严重急性呼吸综合征冠状病毒2假病毒的制备及验证

目的 建立严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）假病毒（SARS-CoV-2 pps）的制备方法。方法 设计、合成序列优化的SARS-CoV-2刺突蛋白（S）基因,构建表达质粒,转染293T细胞,用免疫荧光检测S蛋白的表达;将该质粒与基于慢病毒基因骨架的含增强绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的假病毒包装质粒共转染293T细胞,收集细胞培养上清,感染Vero E6和Huh7细胞,观察细胞内EGFP的表达;将制备的SARS-CoV-2 pps感染Vero E6细胞,检测膜融合抑制剂氯喹和盐酸阿比朵尔、SARS-CoV-2 S1蛋白单克隆抗体及新型冠状病毒肺炎患者恢复期血清对假病毒感染性的影响。结果 构建的SARS-CoV-2 S质粒转染的293T细胞可与S1蛋白单克隆抗体及新型冠状病毒肺炎患者恢复期血清反应。SARS-CoV-2 S质粒与HIV假病毒包装质粒共转染293T细胞的上清加入Vero E6细胞和Huh7细胞36 h和72 h后可分别观察到细胞内表达的EGFP,EGFP阳性的Huh7细胞数量明显多于Vero E6细胞。2种膜融合抑制剂、1株人源S1单克隆抗体及2份新型冠状病毒肺炎患者恢复期血清均可有效抑制SARS-CoV-2 pps对Vero E6细胞的感染（P均<0.01）。结论 成功制备了SARS-CoV-2 pps,其可用于后续抗SARS-CoV-2药物筛选与疫苗评价。     

新型冠状病毒中和抗体酶联免疫检测试剂盒的制备及应用

目的 开发一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫检测试剂盒,分析新型冠状病毒中和抗体在新冠疫苗效果监测中的临床应用价值。方法 表达纯化SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD结构域和人ACE2蛋白,将RBD蛋白偶联HRP、ACE2蛋白偶联生物素(Bio),制备新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒;收集15例注射新冠疫苗志愿者血清,检测新冠疫苗注射前后机体中和抗体水平。结果 注射新冠疫苗前SARS-CoV-2中和抗体阳性率为0.00%,第1、2、3针新冠疫苗注射后11～15 d,阳性率分别为13.33%、93.33%、100.00%,第2针注射后第180～190 d,阳性率降低到33.33%;性能检测分析显示,最低检出限为0.06μg/mL,批内CV<5%,批间CV<10%,线性检测范围为0.030～3.125μg/mL,分析灵敏度验证值为0.040μg/mL,与微量细胞中和试验进行对比,确认与其具有高度一致性。结论 新型冠状病毒中和抗体酶联免疫检测试剂盒性能评价良好,检测方法具有快速、方便、易操作等特点,可以用于评估新冠疫苗的保护效果。     

具有广谱中和活性的新型冠状病毒受体结合结构域抗体的筛选和鉴定

目的 从2名新型冠状病毒感染康复者体内分离针对新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain, RBD)的特异性单克隆B细胞,并筛选出具有广谱中和活性的SARS-CoV-2 RBD中和抗体。方法 以生物素化的RBD为分子探针,利用流式细胞仪对康复者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)进行单克隆B细胞分选,将获得的B细胞经裂解并完成逆转录后,采用随机引物对抗体的重链及轻链进行巢式PCR扩增,扩增产物分别克隆至对应的表达载体,随后相应配对的重轻链质粒共转染293F细胞中进行表达,利用Protein A柱纯化获得单克隆抗体。采用原始株(WT)假病毒开展中和实验挑选出半数抑制浓度(IC₅₀)<0.1μg/mL的抗体,进一步在原始株(WT)、Beta株(B.1.351)和Delta株(B.1.617.2)活病毒以及目前的流行株XBB、BA.5、BF.7假病毒...     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 DNA疫苗与重组亚单位疫苗在小鼠中诱导中和抗体的效力分析

目的 探讨以严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）受体结合区（RBD）和表面刺突蛋白（S蛋白）S1亚基为疫苗靶抗原诱导中和抗体的效果。方法 构建SARS-CoV-2 RBD与小鼠IgG1 Fc段（mFc）融合蛋白表达质粒pVRC-RBD-mFc,转染人胚肾细胞293T并进行培养。用蛋白质印迹法检测细胞培养上清中的RBD-mFc融合蛋白,用微量中和实验检测细胞培养上清中的RBD-mFc及CHO细胞重组表达的SARS-CoV-2 S1与人IgG1 Fc段（S1-hFc）融合蛋白对SARS-CoV-2感染的抑制作用。分别用质粒pVRC-RBD-mFc及S1-hFc融合蛋白通过肌内注射接种BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗-S1 IgG,用微量中和实验检测小鼠血清的病毒中和活性。结果 pVRC-RBD-mFc质粒转染293T细胞的培养上清中可检测到RBD-mFc融合蛋白,超滤浓缩的细胞培养上清及S1-hFc融合蛋白均呈浓度依赖性抑制SARS-CoV-2对Vero E6细胞的感染;经pVRC-RBD-mFc质粒及S1-hFc融合蛋白免疫的小鼠血清中均可检测出抗-S1 IgG,且能中和SARS-CoV-2的感染;S1-hFc融合蛋白免疫小鼠血清的抗体滴度及病毒中和活性均高于质粒pVRC-RBD-mFc免疫小鼠血清（P均<0.01）。结论 SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白均可能作为有效的疫苗抗原,重组亚单位疫苗较DNA疫苗能更有效地诱导中和抗体。     

新型冠状病毒长效中和抗体AZD7442的结构特征及药效学评价

新型冠状病毒感染(COVID-19)由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起, 给全球带来巨大的防控压力。AZD7442采用抗体鸡尾酒疗法, 由替沙格韦单抗(Tixagevimab)和西加韦单抗(Cilgavimab)两个长效中和抗体协同发挥中和作用, 兼具预防和治疗价值。本综述总结AZD7442有效中和SARS-CoV-2的结构特征及其药效学研究, 以期深入理解AZD7442对SARS-CoV-2的中和作用。AZD7442在暴露后预防及治疗方面也展现出积极的作用, 是目前唯一获批用于COVID-19暴露前预防的中和抗体。鉴于AZD7442在COVID-19预防和治疗中的双重应用前景, AZD7442有望为当前SARS-COV-2感染的防治提供新的选择, 同时为其他病毒感染的预防和治疗提供借鉴意义。     

微针皮内免疫增强新型冠状病毒S1蛋白免疫原性研究

目的 研究新型皮内免疫方法对新型冠状病毒重组S1(rS1)蛋白的免疫效果。方法 112只BALB/c小鼠随机分为对照组[只注射Al(OH)3佐剂]、5μg S1组、5μg S1+Al(OH)3组、10μg S1组、10μg S1+Al(OH)3组、20μg S1组、20μg S1+Al(OH)3组,每组分别进行肌内免疫和微针皮内免疫,各组免疫所用S1蛋白与佐剂Al(OH)3质量比为1∶10,共14组,每组8只。免疫程序为0、2和4周3次免疫。通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）比较不同免疫途径和免疫剂量诱导的IgG、IgG1和IgG2a结合抗体水平。用SARS-CoV-2野生型（WT）和Omicron(BA. 5)假病毒来评估中和抗体的水平。通过酶联免疫斑点实验（enzyme-linked immunosorbent spot,ELISpot）对细胞免疫反应进行评估。抗体终点滴度和中和数据通过Kruskal-Wallis检验进行分析,细胞免疫数据使用单因素方差分析进行分析。结果 皮内免疫新型冠状病毒rS1蛋白诱导IgG...     

如何看待新型冠状病毒肺炎的潜在抗体依赖性增强效应与疫苗

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是否存在抗体依赖性增强(ADE)效应一直备受关注.大阪大学研究团队首次发现在感染SARS-CoV-2后既会产生抵御感染的中和抗体,也会产生增强感染的抗体,在体外证实了SARS-CoV-2导致ADE的可能性,由此更导致大众对疫苗接种的疑虑和担心.本文结合该研究对感染增强抗体在人体中是否导致ADE,以及对疫苗接种和开发的影响进行了剖析和展望.     

化学发光法检测新型冠状病毒抗体的临床评价及应用

目的:探讨化学发光微粒子免疫法对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体及IgM抗体的检测效果及两种抗体的产生规律.方法:选取武汉大学中南医院收治的197例确诊新型冠状病毒肺炎患者,其中包含了24例核酸检测阴性但通过临床症状和CT检测确诊的患者;已排除新型冠状病毒感染的其他就诊患者142例作为对照组,通过化学发光法对...     

新型冠状病毒特异性抗体检测性能评价及临床价值

目的:评价新型冠状病毒(SARS-CoV-2)免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)抗体检测的诊断性能及在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疑似患者中的临床诊断价值.方法:本研究采用回顾性研究方法,收集2020年1月3日至2月28日在武汉市肺科医院住院患者301例,其中197例为SARS-CoV-2核酸检测阳...     

新型冠状病毒特异性抗体微流控法定量检测能力评价及应用

目的：建立并评价新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus2,SARS-CoV-2）特异性抗体定量检测方法,为新型冠状病毒肺炎（corona virus disease-2019,COVID-19）疫情防控提供血清学研判支持。方法：采集2020年1—2月SARS-CoV-2感染者及其密切接触者的血清和咽拭子样本,分别用RT-qPCR法检测SARSCoV-2核酸,微流控法和胶体金法检测SARS-CoV-2特异性抗体,并比较分析检测结果的一致性。结果：微流控法、胶体金法检测SARS-CoV-2特异性IgG抗体的结果均与RT-qPCR方法一致。发病早中期（<14 d）与后期（≥14 d）微流控法IgG抗体阳性率差异有统计学意义。结论：微流控法是一种新型可定量的SARS-CoV-2抗体检测法,检测结果准确且耗时短。     

成都市91名医务人员接种新冠疫苗加强针后特异性抗体分析

目的 了解成都市公共卫生临床医疗中心医务人员接种新冠疫苗加强针后1月血清特异性抗体产生情况,并与新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎）既往感染者疫苗免疫后特异性抗体比较,分析加强免疫针效果。方法 以接种新冠灭活疫苗第三剂（加强免疫针）的医院医务人员为试验组,以接种两剂新冠灭活疫苗的新冠肺炎既往感染者为对照组。使用化学发光法分别检测对试验组加强免疫后1月、对照组免疫后24~78 d（中位时间58 d）血清SARS-CoV-2 IgG抗体及总抗体,比较对照组疫苗免疫前后抗体变化以及两组免疫后抗体的差异。结果 试验组加强免疫后SARS-CoV-2 IgG阳性率为94.5%（86/91）,均值（6.92±3.40）COI、总抗体均值（460.64±265.98）COI。男、女性IgG阳性率、IgG量、总抗体量的差异均无统计学意义（P>0.05）,≥40岁组IgG阳性率及总抗体量均低于22~<30岁组（F=3.269,P<0.05）;采用Fisher确切概率法分析,对照组疫苗免疫后SARS-CoV-2 IgG抗体及总抗体显著高于免疫前（P<0.001）。试验组加强免疫后1月和对照组疫苗免疫后SARS-CoV-2总抗体分别为（460.64±265.98） 和（595.40±294.36）COI,试验组加强免疫后1月比对照组疫苗免疫后低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 接种新冠灭活疫苗加强免疫针后体内抗体将快速达到高峰,虽然效果可能会受到年龄的影响,但仍普遍有效。新冠肺炎既往感染者免疫接种后的保护力可能强于非感染者加强免疫接种后。符合加强免疫接种条件的非感染者以及免疫接种条件的新冠肺炎康复者,都该及时接种以减少感染或再次感染SARS-CoV-2的风险。     

3例新型冠状病毒肺炎患者不同标本检测分析

目的 分析新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者临床表现及治疗后咽拭子、粪便、尿液的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸检测阴转情况,探讨新型冠状病毒肺炎（COVID-19）病人的出院标准。方法 回顾性分析3例海南省人民医院收治的COVID-19病例,对其临床表现及治疗后咽拭子、粪便、尿液的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸检测结果进行描述。结果 3例COVID-19病例治疗后咽拭子核酸转阴性,粪便核酸检测仍呈阳性,合并尿液核酸阳性1例,1例患者病程3周后出现SARS-CoV-2抗体lgM、lgG均阳性(滴度分别为4.416和18.485)。结论 建议严格把握出院标准,推荐增加粪便、尿液核酸检测,出院后仍需集中医学观察14 d以最大限度降低消化道传播风险的可能。     

接种新型冠状病毒灭活疫苗（Vero细胞）后感染COVID-19病例的临床特征及抗体情况

目的 通过分析22例接种新型冠状病毒灭活疫苗（Vero细胞）后感染新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者的临床特征及抗体情况,方便临床预判和治疗。方法 选取2020年12月—2021年3月在我院收治的22例接种灭活疫苗后的COVID-19患者为研究对象,通过分析其人口学特征、临床症状、血检结果、核酸及抗体、胸部影像学及治疗方法等,以了解接种灭活疫苗后COVID-19患者的临床特征及抗体变化情况。结果 22例COVID-19患者中位年龄34.5岁,临床症状主要有咳嗽（8例）、咳痰（3例）、纳差（3例）、发热（1例）、胸闷（1例）、咽喉不适（1例）、鼻塞流涕（1例）等;胸部影像学有单侧肺炎（2例）及双侧肺炎（7例）,表现为磨玻璃影（5例）或磨玻璃合并斑片影（4例）。入院时1例患者查新冠病毒抗体IgM（+）IgG（-）,3例IgM（-）IgG（-）,4例IgM（-）IgG（+）,14例IgM（+）IgG（+）。结论 本次我院诊治的接种灭活新冠疫苗（Vero细胞）后COVID-19患者,以青中年男性居多,临床分型以普通型患者为主,临床症状主要有咳嗽、咳痰、发热、咽喉不适等,胸部影像学可出现单侧或双侧磨玻璃影或斑片影渗出病灶,经氧疗、中药等常规治疗后所有患者均预后良好。接种灭活新冠疫苗（Vero细胞）后再感染新冠病毒患者,可在短期内迅速产生大量IgG抗体。     

广州市47例新型冠状病毒肺炎恢复期患者肺功能研究

目的 了解47例新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者恢复期肺功能状况,分析新型冠状病毒对肺的损伤程度,为COVID-19致肺损伤恢复提供实验依据。方法 选取2020年1月—2月在广州市第八人民医院治愈出院,隔离14 d后的47例COVID-19恢复期患者为研究对象,对检测肺功能、胸部CT、新型冠状病毒抗体结果进行回顾性分析。结果 47例恢复期COVID-19患者新型冠状病毒IgM阴性40例(占85.1%),IgG阳性44例(占93.6%),其中IgM、IgG均阳性7例,IgM、IgG均阴性3例。肺功能损障碍29例(占61.7%),其中轻度、中度障碍分别19例、10例。限制性通气功能障碍3例,阻塞性通气功能障碍1例,通气功能障碍2例,混合通气功能障碍1例,弥散功能障碍26例,弥散并限制性通气功能障碍2例,弥散并阻塞性通气功能障碍1例,弥散并通气功能障碍2例,小气道功能障碍共5例。11例重型COVID-19患者肺功能障碍10例(占90.9%),其中轻度4例,中度6例,36例普通型患者肺功能障碍19例(占52.8%),其中轻度15例,中度4例,两组对比重型COVID-19患者中度肺功能障碍较普通型多。恢复期患者胸部CT异常35例,多表现为弥漫大片状磨玻璃样影、散在斑片影、纤维条索影;其中表现为弥漫大片磨玻璃影和纤维条索影者共8例,中度肺功能障碍患者(7例)较轻度肺功能障碍患者多(1例),重型患者(6例)较普通型患者(2例)多。结论 COVID-19患者恢复期绝大部分患者有肺功能障碍,多表现为弥散功能障碍,对指导康复治疗有一定临床意义。     

接种不同种类新冠疫苗后发生突破性感染患者的临床特征分析

目的 比较接种不同种类新冠疫苗后发生突破性感染患者的临床特征,为临床中该类患者诊疗提供借鉴。方法 以2021年6月1日—2021年11月1日广州医科大学附属市八医院诊治的接种不同种类新冠疫苗后发生突破性感染的患者为研究对象,按照接种疫苗的种类,分为核酸（mRNA）疫苗组、腺病毒载体（Ad）疫苗组和灭活（Vero细胞）疫苗组,通过比较三组患者的人口学特点、临床表现、血检结果、新冠抗体、肺部影像学、治疗方案及病情预后等,总结接种不同种类新冠疫苗后感染新冠病毒患者的临床特征。结果 共有mRNA疫苗组46例、Ad疫苗组28例和Vero疫苗组225例患者纳入分析,所有患者均完成全程2剂疫苗接种（除接种强生疫苗为1剂）,三组疫苗患者末次疫苗接种至发生突破性感染的时间间隔分别为（44.60±18.29）、（50.83±17.49）及（68.35±38.43）d,Vero疫苗组患者第二针疫苗接种至发生突破性感染的时间间隔最长,差异有统计学意义（P<0.05）。三组患者的临床表现、白细胞、淋巴细胞、肝肾功能、心肌酶学、D-2聚体、氧合指标、炎症指标和入院时IgG抗体滴度等指标以及肺部影像学改变,差...     

新冠肺炎患者特异性抗体IgM、IgG和病毒RNA的动态变化

目的 研究新型冠状病毒感染患者IgM及IgG特异性抗体与新型冠状病毒核酸RT-PCR检测在住院期间的变化趋势。方法 将肇庆市第一人民医院收治的100例SARS-CoV-2感染住院患者根据是否接种疫苗分为疫苗组、无疫苗组。无疫苗组又分为重型、普通型及轻型和无症状组。监测所有患者住院0~<8 d、8~<15 d、15~<22 d、22~<29 d、29~<36 d及≥36 d的核酸检测结果和化学发光法测定的IgM和IgG抗体阳性率及S/CO值的动态变化趋势,比较不同组间的统计学差异。结果 疫苗组和无疫苗组,住院8~<15 d和≥36 d ,IgM抗体阳性率分别为55.6%（15/27）和68.5%（50/73）、0（0/27）和49.0%（36/73）,差异均有统计学意义（χ²=11.048,20.805,P<0.05）。住院0~<8 d和8~<15 d,IgG抗体阳性率分别为96.3%（26/27）和45.2%（33/73）、100.0%（27/27）和78.1%（57/73）,差异均有统计学意义（χ²=21.268,7.576,P<0.05）。住院8~<15 d、15~<22 d、22~<29 d、29~<36 d。RNA阳性率分别为29.6%（8/27）和76.7%（56/73）、14.8%（4/27）和65.8%（48/73）、7.4%（2/27）和42.5%（31/73）、7.4%（2/27）和26.0%（19/73）,差异均有统计学意义（χ²=18.964,20.490,10.957,4.119,P<0.05）。在住院不同时期,疫苗组IgG抗体S/CO值均高于无疫苗组（P<0.05）,而IgM抗体差异均无统计学意义（P>0.05）。重型患者的IgM抗体和IgG抗体在住院22~<29 d和29~<36 d的S/CO值均显著高于普通型、轻型及无症状组（F=17.694,15.116,4.037,4.115,均P<0.05）。结论 重型患者IgM和IgG抗体水平在康复过程中免疫防御的激活更大。在接种疫苗的情况下,IgM抗体在SARS-CoV-2感染后仍能很好地反应机体抵抗病毒的整个病程。     

小鼠CTLA4-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4Fc融合基因（CTLA4-Fc）的真核表达质粒,并检测其在293T细胞中的表达,为后续在小鼠体内研究CTLA4-Fc抗肿瘤作用机制奠定基础。方法 Gene Runner 软件设计并合成互为搭桥、互为模板的CTLA4融合基因引物,利用重叠PCR方法扩增获得CTLA4基因片段,与pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒同时进行双酶切,连接合成CTLA4-Fc融合基因表达质粒;菌落PCR扩增、双酶切以及测序鉴定后,在293T细胞中瞬时转染表达融合基因的质粒,ELISA法检测其在293T细胞内的蛋白表达含量。结果 成功构建CTLA4-Fc融合基因。经菌落PCR和双酶切,琼脂糖电泳检测到CTLA4-Fc片段长度为1 200 bp,CTLA4片段长度为568 bp DNA。将阳性重组克隆菌落挑于液体LB培养基中扩大培养并将菌液送公司测序,测序结果证实DNA序列与GenBank同源性为100%。通过ELISA方法能够检测到CTLA4-Fc质粒在293T细胞中的表达。结论 CTLA4-Fc融合基因正确克隆入pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒中,该质粒能够在293T细胞中表达。本研究利用重叠PCR技术扩增获得CTLA4基因序列,能够快速获得目的 基因扩增产物,提高了实验的成功率。     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.