基于快速和常规全外显子组分析技术对遗传性疾病的诊断程序比较

目的 探索可被临床医生直接应用的全外显子测序（WES）数据分析平台及方法。方法 选择复旦大学附属儿科医院（我院）临床诊断不明疾病的核心家系3例（例1~3）和仅先证者2例（例4和5）行WES分析,采用WuXi NextCODE临床测序数据分析系统（简称NextCODE平台）进行快速数据分析,并与我院分子诊断中心已建立的高通量数据分析流程（简称常规数据分析流程）进行参与人员及耗时的比较。结果 例1~3基于表型相关候选基因联合遗传模式的分析方法,分别检测到FGFR2基因杂合突变、GBE1基因复合杂合突变及TBX1基因杂合突变;例4和5通过表型相关候选基因分析,分别检测到IL10RA基因纯合突变和复合杂合突变。NextCODE平台自动完成3/7个步骤,从输入表型至生成报告,WES数据分析用时30 min以内。常规数据分析流程自动完成1/7个步骤,6个人工完成步骤需要多个专业人员进行数据的筛选及解读,从输入表型至生成报告,熟练的专业人员用时2~8 h。结论 5例临床诊断不明病例通过WES明确了诊断;NextCODE是直接为临床医生所用、简单快速的WES数据分析平台,有助于协助临床医生直接利用高通量测序数据,准确锁定致病突变,提高诊断效率。     

高通量测序数据分析和临床诊断流程对新生儿多发畸形候选变异的筛选准确性研究

目的构建应用于遗传性疾病诊断的基因组二代测序数据分析流程,为候选变异筛选提供参考流程。方法复旦大学附属儿科医院(我院)新生儿出生缺陷生物样本库中的87例多发畸形样本,以美国贝勒外显子组测序分析流程(贝勒流程)为参考标准进行候选变异筛选,同一批样本以我院建立的全外显子组测序分析流程(复旦流程)也行候选变异筛选,以染色体的位置和突变的碱基作为突变位点的标识符对贝勒和复旦流程检出变异逐行比较。结果 87例新生儿多发畸形样本共检出变异7 820 777个,复旦流程经质量控制、公共数据库的变异频率筛选、内部数据库的变异频率筛选、变异类型的筛选和关注与孟德尔遗传病相关的变异数筛选,平均单个病例180~210个变异作为最终候选变异行临床诊断分析;贝勒流程检出候选变异15 242个,复旦流程检出候选变异15 660个,2个流程均检出候选变异15 137个,复旦流程比贝勒流程多检出的候选变异523个,105个候选变异贝勒流程检出复旦流程未检出,复旦流程敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均高于96.66%。结论虽然复旦流程候选变异筛选能真实有效地模拟贝勒流程对WES数据进行筛选,并寻找候选变异的过程;复旦流程所展现的注释和筛选只是粗略的框架,但提供了WES应用于临床时不可或缺的筛选程序。     

复旦大学附属儿科医院高通量测序数据分析流程（第二版）对遗传疾病候选变异基因筛选用时和准确性分析

目的： 本研究旨在比较和分析复旦大学附属儿科医院（我院）分子诊断中心（本中心）2015年建立的高通量测序数据分析和临床诊断流程（复旦流程1.0）及其升级后的流程（复旦流程2.0）的临床应用效果。 方法：以复旦流程1.0和2.0对本中心新生儿重症监护病房送检行二代测序分子诊断的连续样本,进行初步数据分析结果、流程用时和准确性的比较和分析,并以典型病例具体说明复旦流程2.0的主要特点。 结果：2017年11月7~14日取得家属的知情同意的、行临床外显子检测的112例进入本文分析,初步数据分析结果的比较,进入人工数据审核的变异数量,复旦流程1.0平均210个,复旦流程2.0平均25个;完成112例从样本送达测序完成到初步报告形成时间,复旦流程1.0为78.8 h,复旦流程2.0为19.8 h;与人工审核后阳性结果判读符合率为63.6%（7/11）,阴性结果判读符合率为84.2%（85/101）。 结论：复旦流程2.0可以更加快速、准确和自动地进行大样本量的数据分析,可以用于临床大样本量的高通量数据分析及解读。     

SRCAP基因变异致扩张型心肌病1例家系分析并文献复习

目的分析SRCAP基因变异致扩张型心肌病(DCM)家系基因型与临床表型的相关性。方法回顾分析1例特发性DCM患儿的临床资料,利用全外显子测序技术检测致病基因,以Sanger测序验证,利用I-TASSER软件预测致病基因对蛋白质结构及功能的影响。结果患儿男性,16月龄,临床特征为反复呼吸道感染、心肌酶高、心肌收缩力减低、高乳酸血症、语言发育落后,无恶性心律失常。全外显子测序发现SRCAP c.452-453del,pPhe151Cysfs*71基因变异,为新发杂合变异,常染色体显性遗传,以往未有报道。SRCAP基因第151位半胱氨酸在不同物种之间具有高度保守性。I-TASSER软件预测野生型蛋白质3230残基,变异体蛋白质220残基;亲疏水性分析野生型亲水性Sum(求和)(5:3226)=-1449.44,变异体亲水性 Sum(求和)(5:216)=-126.55。结论SRCAP基因c.452-453del(pPhe151Cysfs*71)变异可导致肽链合成提前终止、蛋白质结构截短及亲疏水性发生明显改变,结合患儿临床表型此变异可能是DCM新发现的致病变异。     

全外显子组序列分析新生儿FGFR2基因相关疾病1例

目的通过对1例新生儿期特殊面容、神经系统结构畸形患儿进行全外显子组序列检测分析,旨在为该患儿寻找潜在的致病原因。方法纳入1例在复旦大学附属儿科医院(我院)新生儿病房住院期间未能明确诊断的多发畸形患儿,主要临床表型为前额突出、腭弓高、耳位低、枕部较平,双侧脑室扩大、透明隔部分缺如、胼胝体发育异常,采用Sure Selct Human All Exon捕获试剂盒和Illumina Hi Seq2000测序平台,行全外显子组序列检测。数据分析采用复旦大学附属儿科医院转化中心所建立的高通量测序数据分析流程。采用Sanger测序进行验证。结果患儿全外显子组序列检测数据,共检测到79 064个变异,经过质量控制筛选、变异频率筛选、变异分类筛选,剩余645个变异。在进一步分析中,645个变异中有159个其所在基因在OMIM数据库及HGMD数据库与疾病相关。从3个已经报道的突变位点中锁定致病突变为FGFR2基因(NM_000141)c.C1040G,p.S347C。Sanger测序在家系内验证该位点为新发(de novo)突变。结论采用全外显子组序列检测,明确诊断FGFR2相关疾病1例。并且结合我院已经建立的高通量测序数据分析和临床诊断流程,为新生儿多发畸形寻找潜在的致病基因提供了快速、高效的方法。     

隐睾及隐睾合并其他泌尿生殖系统畸形的外显子测序分析

目的对隐睾及隐睾合并其他泌尿生殖系统畸形的不同表型患儿进行外显子测序,以探索不同临床表型的分子病因。方法提取19例隐睾及隐睾合并其他泌尿生殖系统畸形患儿外周血基因组DNA进行外显子测序,并对测序结果进行生物信息学分析,其中3例行全基因外显子测序,16例行常见基因外显子测序,再采用Sanger测序对获得候选致病突变的患儿及其父母的外周血样本进行突变位点验证。结果本研究纳入的19例患儿中,6例外显子测序结果经生物信息学分析后发现存在异常结果,并提示有3个基因可能与相关表型发病有关:①AR基因发生3处错义突变(c.1600C>A;p.Pro534Thr)、(c.2599G>A;p.Val867Met)和(c.528C>A;p.Ser176Arg);②NR5A1基因发生移码突变(c.442delG;p.Glu148Serfs*148)和错义突变(c.43G>A;p.Val15Met);③ATRX基因发生剪切位点突变(c.4317+13T>C)。其中c.2599G>A和c.43G>A为已知突变,其余4处未见相关研究报道,为新发突变。Sanger测序结果表明6处突变均得以验证,5例患儿母亲存在对应位点突变、患儿父亲未见异常,1例患儿父母均未见异常。结论AR基因错义突变、NR5A1移码和错义突变及ATRX的剪切位点突变可能是隐睾及隐睾合并其他泌尿生殖系统畸形发病的危险因素。     

Coffin-Siris综合征3例患儿的临床表型分析和基因诊断研究

目的 对3例Coffin-Siris综合征患儿进行临床表型分析和基因变异位点鉴定,明确其致病原因。方法 采用染色体微阵列分析、家系全外显子组测序分析、家系全基因组测序分析、一代测序等多种基因检测方法进行病因学确诊。采集患儿3外周血建立永生化淋巴细胞系,用蛋白免疫印迹法检测患儿3 ARID1B蛋白表达。结果 3例患儿均因发育迟缓就诊,均合并有面容异常。患儿1伴宫内发育不全,患儿2伴反复上呼吸道感染,患儿3伴智力落后和手部异常体征。3例患儿染色体微阵列分析结果均为阴性。患儿1和患儿2采用家系全外显子组测序分析得到致病基因位点。患儿1 SMARCB1基因存在一个未见报道的新生杂合剪切变异c.363-3C>G,患儿2 ARID1B基因存在一个未见报道的新生杂合剪切变异c.3550+1(IVS13)G>A。患儿3家系全外显子组未检测到变异,经家系全基因组测序分析发现ARID1B基因携带新生杂合第11号外显子部分缺失,此位点也尚未有文献报道。蛋白免疫印迹法结果显示患儿3 ARID1B蛋白水平的表达量明显下降。结论 Coffin-siris综合征患者临床表现多样,主要以发育落后为主诉。多...     

Ion Torrent PGMTM平台在儿童遗传性疾病诊断中应用初探

目的:在PCR产物定量混合构建文库方法的基础上,探讨Ion Torrent PGMTM平台二代测序应用于儿科常见遗传性疾病诊断的价值。方法:采集临床诊断的2例肌营养不良、1例胆汁酸合成障碍和1例甲基丙二酸血症患儿的外周血,提取基因组DNA,分别针对DMD基因、HSD3B7 基因、AMACR基因及MUT基因采用PCR反应进行编码区扩增,扩增产物定量混合制备成文库,在PGM上完成测序。使用NextGENe软件进行数据分析。同时采用Sanger测序方法,对上述基因进行全基因测序;肌营养不良病例采用多重连接探针扩增（MLPA ）进行基因外显子拷贝数变异的检测。结果:例1 肌营养不良患儿DMD基因检测到6个变异,其中c.998C>A,p.333S>X为已知致病突变位点,4个为SNP（rs228406、rs1801187、rs1801188、rs1800280）。PGM检测到1个假阳性,为6个连续的T后面插入了1个T。例2 肌营养不良患儿检测到DMD基因 g.2788933943-2790543577共5个外显子的缺失,MLPA检测结果与二代测序结果相符合。例3 胆汁酸合成障碍患儿HSD3B7 基因和AMACR基因共检测到7个变异,其中HSD3B7 基因复合杂合突变c.45-46delAG,FS;c.262G>G/C,p. 88G>RG,5个为SNP（rs9938550、rs3195676、rs10941112、rs2278008、rs2287939）。例4 甲基丙二酸血症患儿MUT基因检测到3个变异,1个为已知致病突变位点杂合突变c.728-729het-insTT,FS;2个为SNP（ rs2229384、rs8589）。PGM检测到2个假阳性。结论:基于PGMTM平台、采用PCR产物定量混合构建文库测序的方法,具有低成本、高通量、高灵敏度以及可灵活设计的特点,适合用于儿科临床常见遗传性疾病的检测。但由于二代测序技术可能带来的假阳性,对于检测到的变异需要Sanger直接测序法进一步验证。     

全外显子组测序在危重症新生儿单基因遗传病中的临床应用

目的 探讨全外显子组测序（WES）检测技术在危重症新生儿单基因遗传病中的临床应用价值及意义。方法 选取2016年6月至2018年12月收治的怀疑有遗传性疾病或临床诊断不明确的危重症新生儿为研究对象,采集患儿及父母全血标本进行WES检测。对检测出的基因变异进行分类,寻找与临床表现相关的变异,并进行Sanger测序验证。结果 共纳入新生儿45例,男22例,女23例,中位发病日龄为2.0 d。经分子诊断确诊单基因遗传病患儿12例,诊断阳性率为27%,中位确诊日龄为31.5 d,其中与部分临床表型相关、但经对患儿临床表型再次进行补充与分析后诊断为单基因遗传病者占42%（5/12）。确诊单基因遗传病的患儿经临床治疗后好转率为67%（8/12）。结论 WES检测技术是寻找危重症新生儿单基因遗传病基因变异的有力工具,并可在临床决策中起到关键作用,但数据结果的解读还需要临床医生结合患儿的表型与WES检测结果综合分析。     

3 M 综合征 1 例报告并文献复习

目的探讨3M综合征的临床特征及致病基因。方法回顾分析1例3M综合征患儿的临床资料,并抽提患儿及父母外周血DNA,通过Agilent Sure Select外显子捕获和Illumina Hi Seq测序平台进行测序分析,同时对发现的突变基因进行Sanger测序法验证。结果女性患儿,6月龄,特殊面容,生长落后。患儿的CUL7基因(NM_014780.4)存在错义变异c.4898CT,p.T1633M,父母均为杂合突变。确诊为3M综合征。结论患儿为3M综合征主要致病基因CUL7突变。对于临床表型疑似病例应早期进行基因检测以明确诊断。     

合并围生期缺氧的新生儿脑病遗传因素分析

目的探讨合并围生期缺氧的新生儿脑病遗传因素。方法收集2016年1月至2019年1月参与复旦大学附属儿科医院"新生儿基因组计划"的133例新生儿。纳入标准为诊断为新生儿脑病、合并围生期急性缺氧事件或Apgar评分≤7分的患儿。回顾性分析患儿临床表现、脑电图及头颅影像学表现、基因测序结果和转归等。结果 133例患儿中男77例(57.9%),女56例(42.1%);剖宫产出生56例(42.1%),自然出生77例(57.9%);其中诊断为新生儿缺氧缺血性脑病的患儿68例(51.1%),颅内出血25例(18.8%),遗传学病因的20例(15.0%),败血症(未合并颅内感染)5例(3.8%)。20例二代测序结果阳性的遗传学病因患儿中,19例明确致病性,1例为意义不明;分别为 4例先天性肌病相关变异基因(MTM1基因变异2例、ACTA1基因变异和RYR1基因变异各1例),4例综合征相关变异基因(CHD7基因变异2例、PTN11和NSDHL基因变异各1例),3例代谢性疾病相关变异基因(OTC、MTHFR、ALDH7A1基因变异各1例),2例癫痫性脑病相关变异基因(KCNT1和PACS2基因变异各1例),1例为呼吸中枢相关变异基因(PHOX2B基因变异)以及6例拷贝数致病变异。20例遗传学病因患儿中,8例(40.0%)肌张力减低,7例(35.0%)惊厥,5例(25.0%)合并畸形;20例患儿或家庭均进行遗传咨询,4例患儿死亡,10例患儿放弃治疗出院,6例患儿经过对症支持治疗后症状缓解,出院后进一步制定专科随访计划。结论在合并围生期缺氧的新生儿中,遗传学病因并不少见。先天性肌病、综合征类、代谢性疾病和癫痫性脑病相关变异基因为常见遗传学病因。     

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??Objective??To detect pathogenic genes of short stature with unknown etiology by a targeted next generation sequencing panel to analyze the correlation between genotypes and clinical phenotypes. Methods??A total of 77 children diagnosed with unexplained short stature were enrolled for the study. These children were treated in Ruijin Hospital of Shanghai Jiao Tong University from 2007 to 2015. To search for genetic variation in 187 candidate genes which were associated with growth?? we constructed a targeted next generation sequencing panel encompassing the coding regions of 187 genes. According to ACMG Guidelines??the sites of variation were determined. Sanger sequencing was used to verify the suspected pathogenic genes variation. The relationship between genotype and clinical phenotype was analyzed. Results??Including 5 pathogenic variants?? one likely pathogenic variant and one variant of uncertain significance?? we identified 7 heterozygous variants of 7 cases in 77 cases of short stature with unknown etiology. A pathogenic variant p.D2407fs of ACAN gene was found in a case with advanced bone age. There were 3 reported pathogenic variants?? including p.A72G?? p.I282V and p.P491S of PTPN11 gene?? which were diagnosed as Noonan syndrome. A case carrying known pathogenic variant COL2A1??p.R904C?? was diagnosed as Stickler syndrome. We still got one likely pathogenic variant COMP??p.D401N???? which could cause multiple epiphyseal dysplasia. There was a familial short stature of delayed bone age carrying a variant??p.S289Y?? of uncertain significance??in which the genotype was in accordance with the clinical phenotype. Conclusion??The ACAN gene defection is associated with the idiopathic short stature with advanced bone age. The likely pathogenic variant COMP??p.D401N?? may cause multiple epiphyseal dysplasia. The newly-found heterozygous varians??p.S289Y?? of GHSR gene may result in short stature??which needs further function verification.     

智力发育迟缓新候选基因POSTN对脑损伤神经元体外保护作用研究

目的 通过对1例智力发育迟缓患儿全外显子组测序（WES）,旨在为该患儿寻找潜在的致病原因。方法 纳入1例在复旦大学附属儿科医院（我院）住院期间诊断不明患儿,采用SureSelct Human All Exon捕获试剂盒和Illumina HiSeq2000测序平台,行WES检测;数据分析采用我院分子诊断中心建立的高通量测序数据分析流程;结果采用Sanger直接测序法进行验证。建立体外大鼠神经元原代培养和糖氧剥夺（OGD）模型,分为空白对照组（Sham+PBS亚组、Sham+POSTN亚组）、OGD组（OGD+PBS亚组和OGD+POSTN亚组）,采用免疫荧光、LDH毒性检测、BrdU和TUNEL方法检测POSTN对2组及其亚组神经元生长增殖和凋亡的影响。结果 患儿WES共检测到532 151个变异,筛选后检测到POSTN基因（NM_006475）外显子23:c.A2475T:p.G825G和外显子19:c.G2251A:p.E751K。Sanger测序显示p.G825G来自母亲,p.E751K来自父亲,符合复合杂合遗传模式。培养的大鼠原代神经元（MAP-2或NeuN阳性细胞）中有内源性POSTN的表达。LDH活性Sham+POSTN亚组与Sham+PBS亚组差异无统计学意义,OGD+POSTN亚组与OGD+PBS亚组差异有统计学意义。OGD+PBS亚组致神经元细胞缺氧2、6、12 d后比Sham+PBS亚组BrdU阳性的神经元数量增高,TUNEL阳性神经元凋亡也增高;OGD+POSTN亚组各时间点神经元增殖较OGD+PBS亚组均明显增高,但凋亡减少。结论 POSTN可以减少脑损伤后LDH对于神经元的细胞毒性,促进损伤后神经元的增殖,抑制凋亡。     

1例多发先天畸形-肌张力低下-癫痫综合征1临床及遗传学分析

目的 分析多发先天畸形-肌张力低下-癫痫综合征1(MCAHS1)的临床及遗传学特征.方法 回顾2018年4月确诊的1例MCAHS 1患儿的临床资料;应用全外显子测序及Sanger验证行基因检测;采用流式细胞术分析患儿外周血粒细胞表面糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白FLAER、CD16、CD24、CD58、CD59表达量...     

SLC25A1基因相关性先天性肌无力综合征二例并文献复习

目的探讨SLC25A1基因相关性先天性肌无力综合征(CMS)的临床及遗传学特征。方法回顾性分析2015年1月至2019年6月复旦大学附属儿科医院诊治的2例SLC25A1基因相关性CMS患儿的临床资料,并以“SLC25A1”“先天性肌无力综合征”为关键词对万方数据知识服务平台、中国期刊全文数据库(CNKI),以“SLC25A1”“congenital myasthenic syndrome”为关键词,对美国国家生物技术中心(NCBI)、生物医学文献数据库(Pubmed)建库至2020年6月收录的论文进行检索。总结SLC25A1基因相关性CMS的临床表型及基因型特点。结果2例患儿均为男性,分别为9岁、2岁,发病年龄均在婴儿期,其共同临床表现除典型的CMS症状(波动性肌无力,包括上睑下垂、斜视、咀嚼无力、声音低弱、四肢无力)外,还具有智力障碍、发育迟缓及代谢异常(尿中2-酮戊二酸升高、乳酸升高或者2-羟基戊二酸尿症),家系全外显子测序检测发现存在SLC25A1基因复合杂合变异。文献检索到3篇英文文献共15例患儿,包括本组2例共17例纳入分析,均于2岁以内起病,9例合并轻度智力低下,1例合并发育迟缓;共发现5个SLC25A1基因变异,包括3个错义变异及1个无义变异、1个缺失变异,其中6个家系中12例患儿携带c.740G>A(R247Q)纯合变异,本组2例患儿均有c.145G>A(V49M)变异。结论SLC25A1基因相关性CMS患儿起病早,多合并智力障碍或者发育迟缓,部分有代谢异常表现,基因型中R247Q和V49M具有重复性。     

CCDC39基因突变致原发性纤毛运动障碍1例及其遗传咨询和产前诊断

目的 探讨对原发性纤毛运动障碍(PCD)患儿进行基因检测对指导优生优育的意义。 方法 对1例临床诊断Kartagener综合征并随访4年的患儿进行家系全外显子组测序（WES）,经高通量测序数据分析及临床诊断流程确定致病基因突变,根据基因诊断结果行针对性遗传咨询后对患儿母亲第2胎行羊水穿刺,分离羊水脱落细胞,提取基因组DNA并PCR 扩增羊水脱落细胞相应基因突变所在外显子,行直接Sanger测序。 结果 临床随访发现患儿肺功能较诊断时明显下降,胸部CT支气管扩张较前加重。WES患儿中检测到CCDC39基因c.1819A>A/T, p.K607X无义突变和c.2447_2448het_delCA, p.T816Kfs*3移码突变,2个突变均为未报道的新突变,均经功能预测工具MutationTaster预测为致病突变,分析父母突变来源确定为复合杂合突变。同时结合患儿支气管黏膜活检电镜特征性的纤毛结构异常,认定该复合杂合突变为患儿的致病突变。患儿母亲第2 胎羊水细胞CCDC39基因2个突变位点所在外显子的Sanger测序结果显示,胎儿携带母亲来源的移码突变,无父亲的无义突变,为单杂合突变携带者。 结论 采用WES检测有助于明确PCD患儿的遗传病因,在此基础上对患儿家庭行遗传咨询和产前基因诊断,可以指导优生优育。