共移植体对神经干细胞向神经元分化的影响

目的:探讨共移植体所构成的微环境对神经干细胞移植后向神经元分化的影响。方法:48只同一基因背景的Wistar大鼠,随机分为:NSCs移植组,共移植体移植组。在新生的同一基因背景鼠海马取神经干细胞和大脑皮质取血管内皮细胞,把单独NSCs和共移植体移植入同一基因背景大鼠MCAO造模后24h缺血半暗带区,Brdu标记其中NSCs,利用免疫荧光双标于3d,7d,14d,60d分别观察NSCs向神经元分化情况。结果:在7d,14d,60d三个时间点神经干细胞向神经元分化中,共移植体组神经元分化率高于NSCs组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:共移植体对移植入MCAO模型大鼠的NSCs向神经元分化有促进作用。     

红景天苷对神经干细胞作用的研究

目的:观察红景天苷药物血清对新生大鼠海马神经干细胞分化为神经元的影响。方法:从新生24h内的W istar大鼠脑中分离扩增获得大量神经干细胞后,加入低、中、高剂量的红景天苷药物血清,观察其对神经干细胞分化为神经元的影响,并通过免疫细胞化学染色检测神经干细胞分化为神经元的状况。结果:低、中、高剂量的红景天苷药物血清组单位视野内神经元特异烯醇化酶(N SE)阳性细胞个数与对照组相比有显著差异(P<0.01),并呈一定的剂量依赖性。结论:红景天苷药物血清在体外可促进神经干细胞向神经元方向分化,为红景天药物应用于相关神经系统疾病的临床治疗提供了试验依据。     

肝细胞生长因子促进神经干细胞向神经元细胞方向的分化

目的观察肝细胞生长因子(HGF)对神经干细胞向神经元细胞方向分化的作用。方法取孕14~17d的胚胎大鼠,分离其脑组织,以无血清培养基培养,得到神经干细胞后,加入HGF诱导其定向分化,以免疫细胞化学和流式细胞术的方法来鉴定分化得到的神经元细胞及其比例。结果加入HGF和胎牛血清(FBS)的实验组镜下神经元细胞较仅加入胎牛血清的对照组多,流式细胞术计数分化成神经元细胞的比例为55·76%,而对照组阳性率为32·69%;镜下直接计数实验组NSE阳性神经元的比例为(53·34±2·81)%,而对照组仅(30·78±3·13)%(P<0·05)。结论HGF具有促进神经干细胞向神经元细胞方向分化的作用。     

人胰岛素样生长因子-1重组腺病毒转染C17.2神经干细胞增殖及分化的影响

目的观察人胰岛素样生长因子-1重组腺病毒(Ad-IGF-1)转染对C17.2神经干细胞体外增殖和分化的影响。方法体外培养及鉴定C17.2神经干细胞,Ad-IGF-转染C17.2神经干细胞;Western-blotting法检测IGF-1蛋白的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IGF-1蛋白的表达曲线;MTT检测C17.2神经干细胞增殖,NSE及MBP免疫组化观察C17.2神经干细胞体外分化。结果转染AdIGF-1的C17.2神经干细胞成功表达IGF-1蛋白;IGF-1蛋白在病毒转染5～7d达高峰,13d仍高于转染前,Ad-IGF-1转染后各时间C17.2神经干细胞的增殖与对照组相比有显著差异,Ad-IGF-1转染对c17.2神经干细胞向神经元细胞及神经胶质细胞的分化与对照组相比有显著差异。结论Ad-IGF-1转染c17.2神经干细胞可稳定表达IGF-1,Ad-IGF-1转染促进C17.2神经干细胞的增殖及向神经元细胞和少突胶质细胞的分化。     

不同细胞因子组合对神经干细胞分化的影响

目的:探讨不同细胞因子组合对神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法:采用不同组合的细胞因子(bFGF EGF; bFGF PDGF;bFGF BDNF;bFGF)分离培养大鼠海马神经干细胞,并用免疲细胞化学技术研究神经干细胞的分化情况。结果:在bFGF、bFGF EGF、bFGF BDNF及bFGF PDGF不同因子或因子组合中,均能诱导神经干细胞分化,分化后的神经元比例分别为(14.5±1.2)%、(14.7±1.8)%、(23.3±2.1)%、(35.5±2.4)%,神经干细胞的分化比例趋势为bFGF PDGF >bFGF BDNF>bFGF EGF>bFGF(P<0.05)。姑论:PDGF对bFGF促进神经干细胞向神经元定向分化有较好的协同作用。     

垂体腺苷酸环化酶激活肽对MCAO大鼠自体神经干细胞分化影响

目的:研究垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)对MCAO大鼠自体神经干细胞分化影响。方法:将大鼠随机分为不同浓度PACAP治疗组:P8组(1×10-8mol/L),P10组(1×10-10mol/L),P12组(1×10-12mol/L);对照组。免疫荧光双标观察BrdU /NSE 及BrdU /GFAP 细胞的表达变化。结果:各组BrdU /NSE 及BrdU /GFAP 细胞7d时较少,14d显著增加,28d时最高,PACAP治疗组高于对照组(P<0.01);P8组高于P10组,P12组(P<0.05)。结论:PACAP具有诱导神经干细胞分化的作用,以1×10-8mol/L为最佳浓度。     

星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响实验研究

目的研究星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响。方法随机在我院动物实验中心选取3只大鼠为研究对象,将本次实验均分为普通星形胶质细胞的培养的对照组以及星形胶质细胞与神经干细胞互不接触状态下共同培养的实验组。对比两组星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响效果。结果实验组的纯化星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记为阳性,其细胞纯度高到96%,且在神经元特异性烯醇化酶阳性细胞与酪氨酸羟化酶阳性细胞均比对照组多。结论星形胶质细胞不仅可以加快神经干细胞向神经元细胞的分化以及向多巴胺神经元细胞的分化,而且可以延长神经元存活时间,降低神经元凋亡率。     

不同细胞因子体外诱导神经干细胞向神经细胞分化的研究

目的观察碱性纤维母细胞生长因子、白血病抑制因子、脑源性神经营养因子及不同组合对成年SD大鼠脑神经干细胞在体外分化为神经细胞的作用。方法用含碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年SD大鼠脑神经干细胞,单细胞克隆后行Nestin免疫细胞化学染色;根据培养液中所加营养因子的不同将单细胞克隆传代细胞分为5组培养：bFGF、LIF、BDNF、bFGF＋LIF、bFGF＋BDNF组,此5组细胞培养1周,进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单细胞克隆培养后克隆球细胞表达Nestin;与bFGF组、LIF组、BDNF组相比,bFGF＋BDNF组和bFGF＋LIF组神经干细胞分化为神经细胞的比例较高（P〈0．01）,其中bFGF＋BDNF组神经细胞的比例最高。结论在bFGF培养条件下,BDNF促进成年SD大鼠脑神经干细胞向神经细胞分化的能力高于LIF。     

β-细辛醚对癫痫大鼠脑皮质Glu、GABA、GAD的影响

目的:研究β-细辛醚对慢性点燃癫痫大鼠脑皮质谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)及谷氨酸脱羧酶(GAD)的影响。方法:将大鼠随机分为5组,即β-细辛醚高、中、低(100、50、25mg.kg-1)剂量组,阳性药(苯妥英钠)对照组,阴性(基质)对照组,灌胃给药。以青霉素点燃大鼠慢性癫痫,采用高效液相色谱-荧光法测定脑皮质Glu、GABA的含量,以免疫组化法检测GAD65活性。结果:β-细辛醚能显著降低癫痫大鼠脑皮质Glu、GABA的含量,降低GAD65表达,并呈明显的量效关系。结论:β-细辛醚能减少癫痫大鼠脑内兴奋性氨基酸毒性作用,减轻GABA参与的迟发性神经元损害。     

鼠神经生长因子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的:观察鼠神经生长因子(mNGF)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的影响。方法:4周龄健康SD大鼠60只,按随机数字表法分为治疗组(n=30)和正常对照组(n=30)。治疗组在常规培养的基础上加入浓度为0.1μg/mL mNGF作为诱导液。将培养的第3代BMSCs制成单细胞悬液,诱导后3d,观察细胞形态变化,行神经元特异性烯醇酶(NSE)免疫荧光检测,计算阳性率。结果:正常对照组细胞仅有少量NSE的表达,治疗组细胞表达NSE阳性率较对照组细胞显著增加(P<0.01)。结论:mNGF可诱导大鼠BMSCs向神经元样细胞分化。     

骨髓间充质干细胞和脑源性神经营养因子悬液移植对大鼠脊髓损伤的治疗作用

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植兼用脑源性神经营养因子(BDNF)促进大鼠脊髓半横断损伤修复的影响。方法建立成年大鼠脊髓T12半横断损伤模型,将体外培养纯化的BMSCs植入脊髓损伤处,同时局部应用BDNF,术后2个月用斜板试验及改良Tarlov评分评价动物后肢运动功能恢复情况;用光镜及电镜观察移植后脊髓的形态结构变化及移植物存活情况;用相对分子质量为200 000的神经微丝(NF)、相对分子质量为51 000的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学活性的变化来评价移植对再生的影响。结果移植物能很好地与宿主融合和存活,移植细胞的大鼠后肢自主运动功能有显著的恢复,BMSCs和BDNF联合应用对脊髓损伤的修复作用最强。结论BMSCs移植可促进大鼠半横断脊髓结构和功能恢复,联合应用BMSCs和BD-NF在脊髓损伤修复治疗中具有协同作用。     

bFGF和BDNF对MCAO大鼠海马区神经干细胞原位增殖的影响

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、脑源性神经生长因子（BDNF）对大鼠脑缺血损伤后海马区（SGZ）神经干细胞原住增殖的影响。方法：将Wistar大鼠84只随机分为空白对照组（12只）、bFGF组（24只）、BDNF组（24只）、bFGF＋BD—NF组（24只）。采用线辁法制作局灶性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。分别于缺血再灌注后3d、7d、14d、28d处死大鼠。免疫组织化学方法动态检测SGZ区BrdU、Nestin的表达。结果：各组SGZ区的BrdU和Nestin阳性细胞均在脑缺血3d后开始增加,7d达到高峰,14d后开始下降,28d降至最低水平;与空白对照组相比,均有统计学意义（P〈0．05）;其中bFGF＋BDNF组Brdu和Nestin阳性细胞数增加更明显。结论：侧脑室注射bFGF、BDNF可促进脑缺血大鼠SGZ区内源性神经干细胞原位增殖;bFGF和EGF联合应用对脑缺血大鼠神经干细胞原位增殖效应有协同作用。     

不同细胞外基质对神经干细胞分化影响的实验研究

目的:通过观察不同的细胞外基质对神经干细胞(NSCs)分化的影响,寻找促使NSCs向神经元分化的最佳细胞外基质,为NSCs定向分化培养及NSCs共移植体的构建提供实验依据。方法:利用无血清培养和细胞克隆培养技术,从新生大鼠海马分离NSCs,进行体外扩增、悬浮培养、传代;将层粘连蛋白(LN)、Matrigel、多聚赖氨酸与NSCs贴壁混合培养14d;采用免疫细胞化学和免疫荧光技术,观察NSCs的分化情况。结果:通过上述实验表明,在利用不同的细胞外基质混合培养时,LN组MAP2阳性细胞数明显高于其它两组;多聚赖氨酸组和Matrigel组GFAP阳性细胞数明显高于LN组。结论:LN有助于NSCs向神经元定向分化,是NSCs共移植体较理想的细胞外基质。     

Feridex标记胎盘来源的间充质干细胞分化为神经干细胞的实验研究

目的分离胎盘组织来源的间充质干细胞并诱导分化为神经干细胞,以期找到能成功标记神经干细胞的方法。方法将胎盘组织剪碎后消化、培养,加入神经干细胞诱导因子10ng/mL表皮生长因子（EGF）＋10ng/mL重组人碱性成纤维生长因子（bFGF）＋DMEM/F12,并分别添加相应浓度的血清,预诱导3d后加入DMEM/F12＋0.1μmol/L全反式维甲酸（RA）,10ng/mL胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）＋10ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）进行正式诱导7d。结果诱导10d后用Feridex标记诱导后的细胞,普鲁士蓝染色显示90%以上的干细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,Nestin染色显示阳性。结论胎盘来源的间充质干细胞能成功诱导为神经干细胞,且Feridex可成功标记诱导后的细胞。     

GM-1对新生大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的:观察不同剂量神经节苷脂(GM—1)对神经干细胞增殖和分化的影响。方法:从新生大鼠海马组织分离出神经干细胞,分别培养于基础培养液(阴性对照组) ,加入三种不同剂量GM—1(实验组)及含有b FGF(阳性对照组)的神经干细胞培养液。采用神经干细胞球直接计数法测定细胞的增殖能力,并应用免疫细胞化学技术对神经干细胞分化情况进行鉴定。结果:3个实验组神经干细胞的增殖能力较阳性对照组无明显差异,较阴性对照组差异显著,贴壁培养细胞分化发现3个实验组分化能力明显低于阳性对照组。结论:GM—1对新生鼠神经干细胞的增殖起促进作用,对神经干细胞无明显的诱导分化作用。     

脑缺血大鼠脑脊液对神经干细胞存活及分化的影响

目的：探讨脑缺血大鼠脑脊液对新生大鼠海马神经干细胞生存及分化的影响。方法：将脑缺血大鼠脑脊液加入神经干细胞的培养液中，观察神经干细胞存活及贴壁细胞团的分化．并应用免疫细胞化学技术对神经干细胞分化情况进行鉴定。结果：悬浮培养细胞实验组较对照组有明显差异；贴壁培养细胞分化的细胞数量较对照组明显增多。结论：脑缺血大鼠脑脊液可促进体外培养神经干细胞存活，并且促进神经干细胞向神经元和星形胶质细胞分化。     

新生小鼠小脑提取液对成年小鼠神经干细胞分裂与增殖的影响

目的:探讨新生小鼠小脑提取液(ECNM)对成年小鼠脑内神经干细胞分裂与增殖的影响.方法:采用脑立体定位给药技术,将ECNM注入前脑和海马,应用Nestin单抗做免疫组化染色,显示神经干细胞.结果:给予ECNM后7d和14d,在前脑和海马均可见密集的神经干细胞,对照组未见阳性染色.结论:ECNM可诱导成年小鼠神经干细胞分裂与增殖.     

A rat model for studying neural stem cell transplantation

Aim:

The goal of this project was to develop a rat model for neural stem cell (NSC) transplantation studies in which NSCs were modified with brain-derived neurotrophic factor (BDNF) genes that may permit extensive and reliable analysis of the transplants.

Methods:

NSCs were cultured and purified by limiting dilution assay in vitro and infected with recombinant retrovirus pLXSN-BDNF (BDNF-NSCs) and retrovirus pLXSN (p-NSCs). The expression of BDNF genes in transgenic and control NSC groups was measured by FQ-PCR and ELISA assays. NSCs were then transplanted into the subretinal space of normal rat retinas in four groups, which included NSCs alone, BDNF-NSCs, phosphate buffered saline (PBS) control, and normal control. Survival, migration, and differentiation of donor cells in host retinas were observed with optical coherence tomography (OCT), Heidelberg retina angiograph (HRA), and immunohistochemistry, respectively.

Results:

The results obtained by FQ-PCR demonstrated that the copy numbers of BDNF gene templates from BDNF-NSCs were the highest among the four groups (P<0.05). Consistent with the results of FQ-PCR, BDNF protein level from the supernatant of the BDNF-NSCs group was much higher than that of the other two groups (P<0.05) as suggested by the ELISA assays. HRA and OCT showed that graft cells could successfully survive. Immunohistochemical analysis revealed that transplanted BDNF-NSCs could migrate in the host retinas and differentiate into glial cells and neurons three months after transplantation.

Conclusion:

BDNF promotes NSCs to migrate and differentiate into neural cells in the normal host retinas.     

天麻多糖与电针对脑缺血大鼠齿状回BDNF和 VEGF表达的影响

目的：观察天麻多糖与电针对脑缺血大鼠齿状回（dentate gyrus,DG） 脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响。方法：将40只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、电针组、天麻多糖组和针药结合组,每组8只。以单侧大脑中动脉栓塞法制备脑缺血模型。造模后2周,天麻多糖组和针药结合组大鼠给予天麻多糖 100 mg/kg灌胃,每天1次,连续2周;电针组和针药结合组大鼠给予“百会”、“足三里”穴电针刺激,持续 30 min,每天1次,连续2周。采用免疫组织化学染色法结合图像分析检测DG BDNF和VEGF的表达。结果：与正常对照组比较,模型组缺血侧DG BDNF和VEGF阳性表达增加（P〈0.05）;与模型组比较,电针组、天麻多糖组和针药结合组缺血侧DG BDNF和VEGF阳性表达明显增加（P〈0.05） ;针药结合组阳性表达显著多于电针组或天麻多糖组（P〈0.01）。结论：天麻多糖与电针结合可显著增加脑缺血大鼠缺血侧DG BDNF和VEGF的表达,促进内源性神经干细胞激活,且作用优于单用电针或天麻多糖。