人子宫内膜细胞培养及形态学观察

１３例妇女的子宫内膜组织标本经酶消化分离成腺体及单个细胞后在体外培养。通过光镜及电镜观察可鉴别三种形态特征的细胞，一种为上皮细胞，细胞之间可见连接复合体，免疫组化角蛋白（ｋｅｒａｔｉｎ）染色呈阳性反应。第二种为子宫内膜间质细胞。第三种是成纤维细胞。后两种细胞无细胞间连接结构，角蛋白染色均呈阴性反应，而纤维连接素（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ），系间质细胞的一种特异性蛋白质）染色呈阳性。上述三种细胞均能在体外培养并传代。     

人子宫内膜细胞的体外纯化和培养

目的:旨在建立一套子宫内膜细胞体外培养和贮存传代的方法。方法:用胶原酶消化和铜网过筛法分离子宫内膜基质细胞和上皮细胞,进行单层培养。结果:子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗组化染色为阳性,腺上皮细胞可持续培养4-6周,传代2-3次;基质细胞可持续培养5-8周,传代4-6次。结论:建立了可体外培养贮存、传代的子宫内膜细胞,为进一步对其进行抗原组分研究奠定基础。     

人子宫在位及异位内膜细胞的体外培养及生物学特性比较

１６例人子宫内膜及２０例子宫内膜异位组织进行了体外分离培养,并比较了两种组织中上皮细胞及间质细胞的形态学特点及分泌功能。结果显示：两种组织的两类细胞在细胞角蛋白、波形蛋白和ＰＲＬ免疫细胞化学染色均有相似的阳性反应特点;并且也分别分泌相似量的ＣＡ １２５和ＰＲＬ,但是异位内膜间质细胞分泌的ＩＬ ６量明显高于正常内膜的间质细胞（Ｐ＜ ０．０１）。作者认为这种体外培养方法,对子宫内膜异位症细胞的生物学特性,以及进一步揭示子宫内膜异位症发病机制的实验室研究,可提供有价值的细胞模型     

改良筛网法分离培养人子宫内膜细胞

目的:探索一种能获得较高纯度和较多数量子宫内膜细胞的分离培养方法。方法:取12例患者各1mg新鲜子宫内膜组织,经0.25%Ⅰ型胶原酶(含有0.005%DNA酶)消化后,将所得细胞悬液一分为二,分别采用传统筛网法和改良筛网法(二次筛网过滤和低速离心相结合)分离并记录所得细胞数;体外培养后采用光学显微镜观察,用免疫细胞化学和免疫荧光化学方法鉴定纯度,比较两种方法分离子宫内膜细胞的纯度和数量。结果:两种方法均有11例组织分离培养成功。传统筛网法分离的子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的纯度分别为(89.54±3.75)%和(92.82±1.60)%,细胞数分别为(0.47±0.09)×105个和(23.73±5.37)×105个。改良筛网法分离的腺上皮细胞和间质细胞纯度分别为(91.95±0.47)%和(99.28±0.21)%,细胞数分别为(8.09±1.24)×105个和(27.23±0.50)×105个。改良筛网法分离的腺上皮细胞数量和间质细胞纯度均明显高于传统筛网法,有统计学差异(P均=0.000)。结论:改良筛网法操作简单,能获得较高纯度的子宫内膜间质细胞及较多的子宫内膜腺上皮细胞。     

人子宫内膜腺癌细胞原代培养方法及细胞系鉴定

目的优化人子宫内膜癌细胞原代培养方法,建立体外培养细胞系。方法将辽宁医学院附属第一医院2009年10月至11月收治的3例子宫内膜癌患者手术切除的子宫内膜腺癌组织采用酶消化法制成单细胞悬液,用含血清DMEM/F-12培养基进行原代和传代培养,通过自然纯化、冻存及低血清培养法纯化腺上皮癌细胞。在倒置显微镜下观察细胞形态,行HE染色,免疫荧光染色对细胞进行鉴定,绘制生长曲线。结果 2例子宫内膜腺癌体外成功建系,传代数扩展至50～70代。细胞形态符合上皮癌细胞系特征,细胞角蛋白表达阳性,细胞生长曲线为S形。结论应用酶消化法原代培养子宫内膜腺癌细胞,并采用自然纯化、冻存及低血清培养法纯化腺上皮癌细胞简单、易行、高效。此2株细胞系可望作为子宫内膜腺癌研究的实验模型。     

人子宫内膜细胞外基质在月经周期中变化的研究

本实验对人正常子宫内膜细胞外基质随月经周期的变动状况进行了观察，目的是进一步探讨为接受胚泡着床，子宫内膜的准备状态。子宫内膜标本利用ＬＳＡＢ免疫组织化学方法对细胞外基质的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白在月经周期中的变化进行了观察。结果显示胶原蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白主要分布在上皮组织的基膜中。胶原蛋白和纤维粘连蛋白总量在分泌早期明显减少。而层粘连蛋白总量在分泌期，特别在分泌中期明显增多。结果表明，细胞外基质随月经周期变化而明显变化。提示子宫内膜细胞外基质的周期变化对胚泡着床可能有着重要的作用。我们认为，细胞外基质是否能伴随月经周期而进行周期性变化是检查是否有正常月经周期的指标之一。本研究对着床、抗着床机理及某些不孕症的治疗将提供新方向。     

异位子宫内膜间质细胞分泌催乳素的体外研究

目的 探讨异位子宫内膜间质细胞分泌催乳素（ＰＲＬ）与子宫内膜异位症（内异症）患者腹水中高ＰＲＬ水平的关系。方法 对１２例内异症患者的异位内膜及１２例正常育龄妇女在位子宫内膜进行体外细胞分离、培养。两种内膜间质细胞在加入１０＾－８ｍｏｌ／Ｌ浓度孕酮培养６ｄ后,用酶联免疫吸附试验法测定其分泌的ＰＲＬ水平;并对异位内膜间质细胞分泌ＰＲＬ水平与美国生育协会（ＡＦＳ）修正标准分期评分进行相关性分析。采用免疫     

离体异位子宫内膜细胞的研究进展

子宫内膜异位症是妇科最常见的疾病之一，与不孕密切相关，近年来人们通过建立异位子宫内膜细胞的体外培养系统，研究异位细胞的生长特征，表面受体、分泌活性及药物影响，进一步探讨了子宫内膜异位症发生，发展的分子学机制，并为临床治疗提供重要的理论依据。     

子宫内膜腺上皮及基质细胞分离、培养作为子宫内膜异位症体外细胞模型的探索

目的 :探索在位子宫内膜腺上皮及基质细胞的分离、培养作为子宫内膜异位症 (EMs)的体外细胞模型。方法 :通过酶解、系列过滤、沉降及贴壁纯化等技术 ,分离、纯化及培养 15份EMs患者的在位子宫内膜腺上皮细胞及其基质细胞 ,并拟传代。结果 :11份标本获得成功 ;每 1g新鲜子宫内膜组织可得到 (8～ 12 )× 10 6个原代基质细胞及 (4～ 8)× 10 6个原代腺上皮细胞 ;基质细胞纯度率可达 95 %以上 ,腺上皮细胞的纯度率约为90 %。基质细胞可以有限的传代 ,腺上皮细胞不能传代。通过改良步骤 ,可提高基质细胞的产量。结论 :在位子宫内膜腺上皮及其基质细胞的分离、培养可作为EMs的体外细胞模型之一。     

月经周期中子宫内膜内皮素及其受体的研究

评价内皮素在内膜生殖生理中的作用,方法利用免疫组织化学和分子原位杂交交结合计算机辅助图象分析技术,检测２３例因良性疾病而行子宫切除术的子宫内膜ＥＴ肽、ＥＴ受体及其两种亚型（ＥＴａＲ、ＥＴｂＲ）的ｍＲＮＡ表达定位、周期性变化。结果在整个月经周期中子宫内膜ＥＴ肽和ＥＴｍＲＮＡ表达有明显的周期性变化,分泌期表达强于增殖期,分泌晚期腺上皮表达最高。基质表达弱于腺上皮,并无明显的周期性变化。ＥＴａＲ和ＥＴｂ     

孕激素及间质细胞培养液对原代培养内膜腺上皮HOXA11基因表达的影响

目的:探讨间质细胞是否参与了孕激素对子宫内膜腺上皮的调控,及其初步的作用机制。方法:将增生期子宫内膜间质细胞经激素处理后进行培养,提取培养液。用浓度为30%的提取培养液对腺上皮细胞进行原代培养,当细胞生长融合时,加入孕酮或孕雌激素培养4h、24h。提取细胞总RNA,用半定量RT-PCR方法检测腺上皮细胞HOXA11基因表达量。结果:当内膜腺上皮细胞中含有30%经孕激素处理的间质细胞培养液时,加入孕激素或孕、雌激素后其HOXA11基因,在培养4h时表达量有下降趋势;24h时,表达量下降明显;而用RU486预处理后再加入孕激素或雌孕激素,腺上皮细胞HOXA11基因表达量与对照组无差异;当上皮细胞中含有30%经RU486预处理后,再加入孕激素处理的间质细胞培养液时,孕激素或孕、雌激素对内膜腺上皮HOXA11表达的负调控作用在4h时消失;24h时,转为正调控(HOXA11基因表达量增加)。结论:孕激素对内膜腺上皮HOXA11基因的负调控作用需要问质细胞分泌的孕激素依赖因子的参与,而且由间质细胞和内膜腺上皮中的孕激素受体共同介导完成这一负调控作用。     

子宫内膜干细胞在内膜再生方面的研究进展

人类子宫内膜中存在干细胞,其对子宫内膜的再生起着关键作用。子宫内膜干细胞位于基底层,并存在上皮、间充质和内皮细胞3种类型,它们在子宫内膜上皮修复、再生中都起着重要的作用;子宫内膜干细胞的分布和功能异常将导致子宫内膜再生相关性疾病(如Asherman综合征、子宫内膜异位症)的发生。     

孕激素对人子宫内膜间质细胞moesin表达的影响

目的:探讨孕激素(P)对人子宫内膜间质细胞(hESC)中细胞骨架调节蛋白moesin的调节作用,为胚胎着床提供理论依据。方法:从因子宫肌瘤行全子宫切除术的妇女子宫标本中获取分泌期子宫内膜组织,分离、鉴定后建立人类子宫内膜间质细胞(hESC)体外模型。根据细胞培养液中添加激素不同分组为空白对照组(A组)、孕激素组(B组,P 10-5 mol/L)、雌、孕激素组(C组,E210-8 mol/L+P 10-5 mol/L)及米非司酮联合雌、孕激素组(D组,E210-8 mol/L+P 10-5mol/L+Mif 10-5 mol/L),培养3 d后应用细胞化学免疫方法和免疫印迹方法检测hESC moesin蛋白定位和定量的变化。结果:细胞化学荧光检测显示moesin主要分布于hESC的细胞胞质及胞膜突起、皱褶、细胞间接触等特殊细胞皮质膜部位,各实验组和对照组moesin定位无显著变化。免疫印迹方法显示B组、C组hESC中moesin表达显著均高于A组(P<0.05);B组和C组间表达无显著差异(P>0.05);D组hESC中moesin蛋白较C组表达显著降低(P<0.05)。结论:孕激素促进hESC的moesin表达上调,进一步通过调节细胞骨架重塑介导胚胎着床;米非司酮通过拮抗孕激素作用,抑制hESC moesin上调。     

Reporting Normal Endometrial Cells in Pap Smears: An Outcome Appraisal

OBJECTIVE: The purpose of this study was to determine the clinical relevance of reporting the presence of normal endometrial cells in the Pap smears of women over the age of 35 years and the significance of this practice as it relates to patient management. METHODS: From January 1992 to December 1995, normal endometrial cells were reported in 206 consecutive Pap smears of women over the age of 35 years. Clinical follow-up was available for all patients, including the results of diagnostic procedures whenever performed. RESULTS: Of the 206 women with normal endometrial cells in their Pap smears, 162 presented with the chief complaint of abnormal vaginal bleeding. They were all evaluated by direct endometrial sampling, resulting in detection of 10 endometrial hyperplasias and 7 endometrial carcinomas. The remaining 44 women who were clinically asymptomatic were followed up with only routine annual gynecologic examinations for a minimum of 3 years. All had negative clinical courses. CONCLUSION: Reporting the presence of normal endometrial cells in Pap smears has little, if any, impact on subsequent patient management. Women who present with abnormal uterine bleeding are worked up for endometrial disease regardless of their Pap smear findings. In clinically asymptomatic patients, practitioners may, and in our experience often do, choose to disregard normal endometrial cells in Pap smear reports. The negative follow-up for the asymptomatic women in our study supports this practice. Therefore, reporting the presence of normal endometrial cells in Pap smears is of no clinical relevance and may, in fact, create a management dilemma for clinicians.     

MST1重组腺病毒的制备及对人子宫内膜间质细胞蜕膜化的作用

目的:探讨丝/苏氨酸激酶MST1在人子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中的作用。方法:制备Ad-FLAG-MST1重组腺病毒,用于感染人子宫内膜间质细胞;采用荧光定量PCR实验结合腺病毒介导的MST1基因过表达,分析人子宫内膜间质细胞蜕膜化进程中MST1的表达及其对蜕膜化特异性基因的调控。结果:获得滴度为2×1011ifu/ml的重组Ad-FLAG-MST1腺病毒,该腺病毒感染人子宫内膜间质细胞后,可高水平表达FLAG-MST1融合蛋白,过表达的MST1显著增加人子宫内膜间质细胞中PRL、IGFBP1、TIMP3和DCN等蜕膜化特异性基因的表达;体外培养的人子宫内膜间质细胞经8-Br-cAMP(0.5mmol/L)和MPA(1μmol/L)刺激后,细胞中MST1总蛋白水平增加3倍以上,同时磷酸化的MST1(Thr183)显著增加。结论:MST1的活化可能参与子宫内膜间质细胞的蜕膜化相关基因的调控。     

P300/CBP相关因子(PCAF)表达水平对人子宫内膜间质细胞增殖的影响

目的:观察P300/CBP相关因子(P300/CBP associated factor,PCAF)对人子宫内膜间质细胞增殖的调控作用。方法:通过Western blotting、实时定量PCR及Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖实验,观察分析Ad-FLAG-PCAF重组腺病毒介导的PCAF过表达及PCAF-siRNA介导的PCAF低表达对体外培养的人子宫内膜间质细胞增殖的影响。结果:获得滴度为8×1010ifu/ml的重组Ad-FLAG-PCAF腺病毒,转染体外培养的人子宫内膜间质细胞后,可有效介导细胞内FLAG-PCAF融合蛋白的高表达;而转染PCAF特异的siRNA后,可有效抑制人子宫内膜间质细胞中PCAF的表达。PCAF过表达的人子宫内膜间质细胞中,其细胞周期标志蛋白cyclinD1和cyclinD3的表达水平显著降低(P<0.05),而PCAF低表达的人子宫内膜间质细胞中,其cyclinD1和cyclinD3的表达水平显著升高(P<0.05);此外,CCK-8实验结果显示,PCAF过表达能显著抑制由雌、孕激素共同刺激所引起的人子宫内膜间质细胞的增殖,而基因沉默人子宫内膜间质细胞中内源性PCAF的表达后,间质细胞的增殖增加>20%(P<0.05)。结论:PCAF可能通过蛋白乙酰化修饰作用,参与调控人子宫内膜间质细胞的增殖过程。     

Cytolysis of Eutopic and Ectopic Endometrial Cells by Peripheral Blood Monocytes and Peritoneal Macrophages in Women with Endometriosis

Objective: To compare the ability of peripheral blood monocytes (PBM) and peritoneal macrophages (PM) to mediate the in vitro cytolysis of endometrial cells from eutopic and ectopic endometrium in women with endometriosis.

Design: Prospective study of immune function.

Setting: Institute for the Study and Treatment of Endometriosis and university-based research laboratories.

Patient(s): Twenty-four women with endometriosis (15 in stage I/II, 9 in stage III/IV) and 4 patients treated with GnRH agonists.

Intervention(s): Peritoneal fluid and peripheral blood were sampled and eutopic and ectopic endometrium were biopsied during diagnostic laparoscopy.

Main Outcome Measure(s): Lysis of autologous endometrial cells.

Result(s): Peripheral blood monocytes were significantly more cytolytic than peritoneal macrophages against autologous uterine endometrial cells. However, PBM and PM displayed a similar degree of cytolysis against a hepatoma cell line. Ectopic endometrial cells were significantly more resistant to cytolysis by autologous PBMC than were matched eutopic endometrial cells, and were completely resistant to cytolysis by autologous PM.

Conclusion(s): The reduced capacity of PM from women with endometriosis to mediate the destruction of endometrial cells coupled with the increased resistance of ectopic endometrial cells to macrophage-mediated cytolysis may facilitate the survival of these cells within the peritoneal cavity of women with endometriosis.     

雌、孕激素对人子宫内膜Pbx2蛋白表达的影响

目的:探讨人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞中雌、孕激素对Pbx2蛋白表达的影响。方法:采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)连接法检测人增生期、分泌中期和蜕膜期子宫内膜中Pbx2的表达和分布;体外培养人子宫内膜基质细胞和高分化子宫内膜癌细胞Ishikawa,分别加入雌激素、孕激素、雌、孕激素联合刺激48 h,并以不加雌、孕激素的基质细胞核和Ishikawa细胞为对照组,采用免疫组织化学、免疫印迹法测定各种条件下Ishikawa细胞中Pbx2蛋白的表达。结果:①在人各期子宫内膜组织中,Pbx2表达于腺上皮细胞和基质细胞的细胞核中;Pbx2在分泌中期和蜕膜期基质细胞中的表达显著高于增生期,但在腺上皮细胞中增生期组织的表达高于分泌中期和蜕膜期,差异均具有统计学意义(P<0.05)。②Western blotting结果显示,在孕激素和雌、孕激素联合处理Ishikawa细胞组中,Pbx2的表达显著低于对照组(P<0.05),雌激素处理后Pbx2的表达与其他各组间的表达无显著性差异(P>0.05),在人子宫内膜基质细胞(ESC)中,Pbx2的表达在雌、孕激素处理各组间比较均无统计学差异(P>0.05)。结论:在人子宫内膜腺上皮Ishikawa细胞中孕激素对Pbx2的表达具有下调作用,在人子宫内膜基质细胞中,Pbx2的调控可能是非雌、孕激素依赖性的。