Rab13-蛋白激酶A途径调节体外培养支持细胞屏障通透性的研究

目的:研究Rab13蛋白在支持细胞(SC)屏障功能调节中的作用。方法:体外分离培养大鼠睾丸SC,Western blotting检测Rab13的表达,免疫共沉淀检测Rab13与蛋白激酶A(PKA)催化亚基间的相互作用;睾酮处理建立SC体外屏障增强模型,Western blotting和放射自显影法分别检测Rab13的表达及PKA活性变化,并通过跨上皮电阻(TER)检测PKA活性对SC屏障功能的影响;小干扰RNA(siRNA)干扰Rab13表达,检测其对PKA活性及SC屏障功能的影响。结果:Rab13的表达随SC屏障的建立逐渐降低,且与PKA催化亚基间存在相互作用;睾酮处理可使Rab13的表达下降而PKA活性升高;Rab13 siRNA干扰可导致PKA活性升高,且SC屏障功能增强;抑制PKA活性可以拮抗睾酮或Rab13 siRNA对屏障功能的增强作用。结论:Rab13可通过调节PKA活性参与调节SC屏障通透性。     

Rab25 siRNA诱导人卵巢癌细胞凋亡及其机制的研究

目的:通过RNA干涉抑制Rab25在人卵巢上皮性癌的过表达,探讨Rab25siRNA对肿瘤细胞凋亡的生物学效应及作用机制.方法:构建针对Rab25的siRNA重组质粒,稳定转染A2780细胞,通过RT-PCR检测Rab25的表达,用Hoechst 33258染色和TUNEL法研究Rab25 siRNA诱导细胞的凋亡;用免疫组化法分析抑制Rab25的表达对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响.结果:Rab25 siRNA可诱导肿瘤细胞凋亡;蛋白水平检测表明抑制Rab25表达使Bcl-2表达下降,Bax表达增强.结论:Rab25 siRNA可诱导细胞凋亡,Rab25影响卵巢癌细胞生存途径是通过调节Bcl-2/Bax表达含量发挥作用.     

Rab25 siRNA抑制人卵巢癌细胞粘附侵袭的实验研究

目的通过RNA干涉抑制Rab25在人卵第上皮性癌的过表达，观察Rab25基因沉默对卵巢癌A2780细胞的生物学效应，探讨Rab25基因沉默对卵巢癌侵袭及转移能力的影响。方法根据基因库上的Rab25mRNA序列，构建针对Rab25的siRNA重组质粒，稳定转染A2780细胞，通过RT-PCR检测Rab25的表达，利用粘附实验和transwell小室实验检测其对细胞的粘附力及侵袭能力的影响。结果成功构建Rab25的siRNA重组质粒，稳定转染靶细胞后可显著降低Rab25的表达，并且与对照相比，Rab25siRNA可显著影响卵巢癌细胞的侵袭粘附能力（P〈0．01）。结论成功构建Rab25siRNA显著抑制肿瘤细胞的侵袭粘附能力，对Rab25的研究有望为卵巢癌的基因治疗开辟新途径。     

小干扰RNA抑制多药耐药基因表达并逆转耐药

目的探讨小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）影响卵巢癌耐药细胞株MDRl基因的表达并逆转其多药耐药的功能。方法2004年10月至2005年6月于山东省立医院中心实验室采用浓度梯度诱导法建立人卵巢癌阿霉素耐药细胞株OVCAR／AR。根据MDRl基因的编码区域设计了2个含19个碱基的MDR1基因特异性siRNA，脂质体介导下转染OVCAR／AR细胞。RT—PCR分析MDR1 mRNA的表达；流式细胞术（FCM）检测P-糖蛋白（P-gp）的表达；MTT法检测OVCAR／AR细胞的多药耐药性。结果MDR1特异性siRNA转染后，OVCAR／AR细胞MDR1 mRNA和P-gp的表达减少，分别以转染后48h和72h下降最著；转染mdr1a和mdr1b siRNA可不同程度地逆转OVCAR／AR细胞对阿霉素、泰素的耐药性，但对非P-gp介导耐药的顺铂无影响。结论阿霉素所致的卵巢癌细胞多药耐药与MDR1基因过度表达有关，体外实验中应用MDR1特异性siRNA能部分逆转OVCAR／AR细胞的多药耐药。     

HPV16 E6小干扰RNA与宫颈癌细胞中E6 p53 p21关系的研究

目的 探讨HPV16E6小干扰RNA（siRNA）与宫颈癌CaSki细胞中E6、p53、p21之间的关系。方法 2004年9月至2005年3月于四川大学华西第二医院,应用化学合成针对HPV16E6的siRNA借脂质体转染CaSki细胞,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术检测E6siRNA转染前后细胞中HPV16E6、p53、p21mRNA及其蛋白表达的变化。结果 转染24h,E6mRNA的表达显著低于空白组（P〈0.05）。各时间点p53、p21mRNA的表达差异无显著性意义（P〉0.05）。转染48h,E6蛋白表达明显下调,p53、p21蛋白表达相应升高。结论 HPV16E6siRNA能特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复p53蛋白的功能活性。RNA干扰（RNAi）技术可为HPV感染相关性疾病提供一种新的特异性基因治疗方法。     

输精管结扎家兔外周血细胞免疫功能变化及其与血浆睾酮、皮质醇的关系

体重２．５～３．０ｋｇ的日本大耳白雄兔，分为输精管结扎组（ＶＧ）和假手术组（ＳＯＧ）。术后４、８、１２、１８、２２月经耳静脉采血。同步检测代表外周血Ｔ淋巴细胞和巨噬细胞功能指标及血浆睾酮、皮质醇含量。结果表明：１．代表Ｔ淋巴细胞功能的ＩＬ—２、ＩＬ—６活性，术后８月ＶＧ均明显低于ＳＯＧ（ＰＭ０．０１，Ｐ＜０．０５）。术后１２、１８、２２月两组比较无显著差异；２．代表巨噬细胞功能的ＩＬ－１活性和ＴＮＦ含量，术后第８月均明显高于ＳＯＧ（Ｐ＜０．０２，Ｐ＜０．０１），１２月后恢复到对照组水平；３．血浆睾酮含量与ＩＬ－２活性的变化趋势一样，二者间呈明显正相关关系（Ｐ＜０．００１）；４．血浆皮质醇含量的变化趋势则与ＩＬ－１是一致的，二者是显著正相关（Ｐ＜０．０１），而与ＩＬ—２活性呈有意义的负相关关系（Ｐ＜０．０１）；５．ＩＬ—１活性与血浆睾酮含量的相关检验，ｒ＝－０．３５０，Ｐ＜０．０１。故推测，输精管结扎术后细胞免疫功能的变化与免疫－神经内分泌调节有关。     

RNA干扰对雄激素合成关键酶17α-羟化酶/17，20裂解酶作用

目的：探讨细胞色素P45017α-羟化酶/17，20裂解酶（CYP17）小干扰RNA（siRNA）对CYP17基因表达和多囊卵巢综合征（PCOS）卵泡膜细胞雄激素合成的抑制效果。方法：合成4条靶向CYP17基因的特异性siRNA和非特异性siRNA。将0．4μg携带报告基因增强型绿色荧光蛋白和CYP17基因的质粒和siRNA共转染入HeIJa细胞，荧光显微镜观察及流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达反映对CYP17表达的影响，筛选抑制效果最佳的siRNA。卵泡膜细胞取自PCOS患者和非PCOS妇女各5例，将筛选出的最佳CYP17siRNA以最佳浓度转染人卵泡膜细胞，荧光定量实时逆转录多聚酶链反应检测CYP17mRNA的表达，并且检测培养液中CYP17作用产物雄烯二酮和前体孕酮水平。结果：siRNA1221处理后。HeLa细胞中外源性CYP17的表达显著降低，抑制率达50％,卵泡膜细胞中CYP17mRNA水平和雄烯二酮产生降低．但与对照组比较，统计学上无显著差异。结论：RNA干扰技术可能提供一种PCOS高雄激素基因治疗的新方法。     

缺氧微环境下HIF-1α对卵巢癌A2780细胞侵袭转移的影响及分子机制

目的:探讨缺氧微环境下HIF-1α在卵巢癌细胞系A2780侵袭转移中的作用。方法:常氧及缺氧微环境培养卵巢癌A2780细胞;RT-PCR及Western blot法检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和基质金属蛋白酶13(MMP13)mRNA及蛋白的表达;siRNA干扰HIF-1α表达,检测干扰效率及MMP13表达的变化;Transwell小室侵袭实验检测siRNA干扰前后卵巢癌细胞侵袭转移能力。结果:缺氧诱导卵巢癌A2780细胞HIF-1α及MMP13表达上调,细胞侵袭数明显增多;siRNA能有效抑制HIF-1α表达及缺氧引起的MMP13增多,降低细胞侵袭能力。结论:HIF-1α通过调控MMP13表达增强缺氧环境下卵巢癌细胞的侵袭能力。     

肌动蛋白结合蛋白细丝蛋白A参与肿瘤坏死因子α诱导的支持细胞屏障功能降低的研究

目的:探讨肌动蛋白结合蛋白细丝蛋白A(filamin A,FLNa)在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)调节支持(Sertoli)细胞屏障功能过程中发挥的作用。方法:体外分离培养20日龄大鼠睾丸支持细胞,用10μg/L TNFα处理后测定跨上皮电阻(trans-epithelial electrical resistance,TER),反映屏障功能改变;Western blotting分析TNFα处理后FLNa表达水平变化;细胞免疫荧光或鬼笔环肽染色分别检测FLNa及微丝(F-actin)的定位改变;FLNa si RNA干扰后检测支持细胞屏障功能。结果:TNFα处理后TER值较对照组显著降低(P0.01);Western blotting结果显示TNFα处理组FLNa水平明显下降(P0.01);细胞形态学检测亦表明TNFα处理后FLNa及F-actin在支持细胞的分布有显著改变;TER测定结果表明FLNa经si RNA沉默后可降低血睾屏障(BTB)功能(P0.01)。结论:FLNa可通过调节F-actin在支持细胞中的排布参与TNFα引起的BTB功能降低。     

孕酮对离体胎鼠头盖骨成骨细胞增殖与分化的影响

目的：从细胞、基因水平探讨孕酮对成骨细胞增殖及分化的影响。方法：胎鼠头盖骨成骨细胞在体外经不同浓度（１０－９ｍｏｌ／Ｌ～１０－６ｍｏｌ／Ｌ）的孕酮作用后，对其细胞增殖、碱性磷酸酶（ＡＬＰ）活性、骨钙素ｍＲＮＡ表达、骨钙素分泌及骨小结形成进行检测分析。结果：（１）孕酮对成骨细胞增殖无明显促进作用；（２）孕酮增加细胞ＡＬＰ活性；（３）孕酮提高骨钙素ｍＲＮＡ表达及骨钙素的分泌，孕酮对骨钙素基因表达的刺激作用呈剂量依赖性；（４）孕酮增加骨小结形成的数量及面积。结论：孕酮对离体胎鼠头盖骨成骨细胞的分化具有多重促进效果，但对细胞的增殖无影响。     

米非司酮通过调节岩藻糖基转移酶IV的表达抑制胚胎体外黏附

目的:探讨米非司酮对人胚胎细胞JAR与人子宫内膜细胞RL95-2之间黏附的影响及其调控的分子机制。方法:采用黏附实验分别观察RU486以及岩藻糖基转移酶IV(FUT4)对JAR细胞与RL95-2细胞之间黏附的影响。采用RT-PCR以及Western blotting检测米非司酮对RL95-2细胞以及流产妇女子宫内膜中FUT4表达的调控。结果:①米非司酮抑制JAR细胞与RL95-2单层细胞之间的黏附;②米非司酮抑制RL95-2细胞以及流产妇女子宫内膜中FUT4基因和蛋白的表达;③FUT4质粒转染RL95-2细胞后,调节JAR细胞与RL95-2单层细胞之间的黏附。结论:米非司酮通过调节FUT4的表达抑制胚胎体外黏附。     

睾酮对3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性影响的机制研究

目的:探讨睾酮(T)对离体3T3-L1脂肪细胞胰岛素(Ins)信号通路影响的分子机制。方法:将3T3-L1前脂肪细胞诱导成熟,用10-5 mol/L T处理12 h,免疫印迹检测细胞Ins受体底物-1(IRS-1)的酪氨酸磷酸化水平及其总蛋白IRS-1、葡萄糖转运蛋白-4(GLUT-4)的表达,以及Ins刺激下膜蛋白GLUT-4的表达。加入核因子-κB(NF-κB)或ERK1/2的抑制剂预处理,再用免疫印迹检测细胞总蛋白中IRS-1的酪氨酸磷酸化水平及其总蛋白IRS-1、GLUT-4的表达,以及Ins刺激下膜蛋白GLUT-4的表达,[3H]-2-脱氧葡萄糖([3H]-2-DG)掺入法检测葡萄糖摄取率。结果:10-5 mol/L睾酮处理12 h与非T处理组相比,细胞总蛋白IRS-1及GLUT-4的表达均增多(P0.05),但使Ins刺激下的IRS-1的酪氨酸磷酸化水平及膜蛋白GLUT-4的表达减少(P0.05),加入ERK1/2或NF-κB的抑制剂后,IRS-1的酪氨酸磷酸化水平及膜蛋白GLUT-4的表达、葡萄糖摄取率能部分逆转。结论:ERK1/2/NF-κB信号通路是睾酮引起胰岛素抵抗(IR)的途径之一。     

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯致胎鼠隐睾发生过程中胰岛素样因子3的表达分析

目的:探讨环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯[Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]诱发胎鼠隐睾的分子机制。方法:妊娠昆明小鼠随机分为3组,每组15只:DEHP实验组(A组)、玉米油(溶剂)对照组(B组)和正常对照组(C组)。A组和B组自妊娠12.5￣18.5d分别持续经口每天给予DEHP(500mg/kg)或玉米油,C组不予灌药。结果:B组和C组睾丸组织中胰岛素样因子3(INSL3)mRNA和蛋白质的表达均无差异(P>0.05);A组INSL3mRNA的表达量约为B或C组的1/3,INSL3蛋白质的表达量约为B或C组的1/4,与B或C组比其差异显著(P<0.05)。A组睾丸引带发育不良,睾丸位置异常。结论:环境内分泌干扰物DEHP下调睾丸间质细胞INSL3基因的表达,影响睾丸引带发育,可能是DEHP诱发隐睾的分子机制之一。     

甲状腺素转运蛋白对卵巢癌细胞株的影响及机制研究

目的:探讨甲状腺素转运蛋白(transthyretin,TTR)对卵巢癌细胞株SKOV-3及OVCAR-3迁移和侵袭的影响及其机制.方法:用Lipofectamine 2000搭载转染TTR小干扰RNA(siRNA)或non-target siRNA(对照组)入细胞,采用划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell法检...     

白细胞抑制因子(LIF)对离体小鼠子宫内膜岩藻糖基转移酶(FuT7)表达的影响

目的:探讨白血病抑制因子(LIF)对小鼠子宫内膜细胞岩藻糖基转移酶(FuT7)因子表达的影响。方法:分别用含LIF和抗LIF-抗体(LIF-Ab)培养液孵育子宫内膜细胞10h,通过PCR、免疫荧光和免疫印迹方法分析各组培养液中FuT7因子的表达。结果:PCR结果显示:与空白对照组比,LIF对离体子宫内膜细胞FuT7基因表达有上调作用(0.26±0.02vs0.18±0.01),而LIF-Ab可抑制子宫内膜细胞FuT7的表达(0.14±0.04vs0.18±0.01)。免疫荧光和免疫印迹结果同样显示经LIF孵育后,子宫内膜细胞FuT7蛋白量有所增加。结论:LIF在体外可调控子宫内膜细胞FuT7表达,并有可能借此来调控着床阶段特异表达的sLeX寡糖抗原量,继而影响整个着床调控网络。     

子痫前期患者胎盘组织中降钙素受体刺激肽-3(CRSP-3)的表达及意义

目的:研究子痫前期患者胎盘组织中降钙素受体刺激肽-3(CRSP-3)的表达与正常妊娠者之间的差异及其临床意义。方法:采用免疫组织化学方法检测住院分娩的50例子痫前期患者(子痫前期组:轻度子痫前期25例,重度子痫前期25例)和30例正常晚期妊娠孕妇(对照组)胎盘组织中CRSP-3的表达定位,Real-time PCR及Western blotting方法检测胎盘组织中CRSP-3mRNA和蛋白的表达。结果:子痫前期和正常妊娠者胎盘组织细胞滋养细胞和合体滋养细胞中均表达CRSP-3。子痫前期患者胎盘组织中CRSP-3mRNA及其蛋白表达水平均高于正常妊娠组(P均0.05)。其中重度子痫前期患者胎盘组织中CRSP-3mRNA和蛋白表达水平显著高于正常对照组(P均0.01),虽重度子痫前期胎盘组织中CRSP-3表达略高于轻度子痫前期,但组间无统计学差异(P均0.05)。结论:CRSP-3上调可能参与子痫前期的发病,但是与疾病的进展及严重程度无关。     

小鼠热休克蛋白10(HSP10)基因腺病毒载体的构建及在卵泡中的表达

目的:构建小鼠热休克蛋白(heat shock protein 10,HSP10)基因重组腺病毒载体,为更好地研究HSP10蛋白在PCOS发病中的作用。方法:用RT-PCR的方法从小鼠卵巢组织中扩增HSP10基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至AdEasy腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-HSP10。PmeI酶切pAdtrack-HSP10,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdtrack-HSP10转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。PacI酶切线性化重组质粒AdCMV-HSP10后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。通过GFP报告基因观察重组病毒的产生。用获得的重组腺病毒感染小鼠卵泡,Western blotting方法检测HSP10基因的表达。结果:从小鼠卵巢组织中扩增出309bp的cDNA,PCR和测序分析证实为小鼠HSP10基因。构建的小鼠HSP10基因的重组腺病毒载体,PacI酶切重组质粒见30000bp和4500bp的特征性条带。制备出高滴度重组腺病毒,病毒上清PCR反应同样扩出309bp的目的条带。分离并培养小鼠卵泡,感染重组的腺病毒,Western blotting检测到显著的HSP10条带。结论:本文成功构建了小鼠HSP10基因重组腺病毒载体,并且在小鼠卵泡中有效表达。     

白介素β1及凝血酶降低孕早期蜕膜细胞同源框A10基因的表达

目的:探讨炎症及出血导致流产的作用机制。方法:选择复发性流产(RSA)及正常妊娠孕6~10周的蜕膜组织各10例,并在体外分离培养正常妊娠的蜕膜细胞,加入雌、孕激素、白介素β1(IL-β1)及凝血酶处理后,用实时荧光定量RT-PCR及Western blotting检测RSA患者、正常妊娠者蜕膜组织及培养处理的各组蜕膜细胞内的同源框A10(HOXA10)的表达情况。结果:1HOX A10基因在孕早期蜕膜细胞中有表达;与正常妊娠者相比,RAS患者蜕膜组织HOXA10的表达明显下降(P0.05)。2雌、孕激素处理组的蜕膜细胞HOXA10 mRNA的表达显著增加(P0.05),是未处理组的9.5倍。3进一步加入IL-β1或凝血酶后,HOXA10 mRNA表达显著下降(P0.05);与雌、孕激素组相比,分别下降89.5%和74.9%。结论:1 HOXA10基因在孕早期蜕膜细胞中有显著表达,在RAS患者中的表达显著下降。2雌、孕激素促进HOXA10的表达,而IL-β1及凝血酶抑制HOXA10的表达。