分离纯化重组水蛭素Ⅲ工艺的优化研究及重组水蛭素Ⅲ的分子鉴定

目的优化分离纯化大肠杆菌发酵液中重组水蛭素Ⅲ的工艺并对所纯化产物进行分子鉴定. 方法通过三步纯化步骤,即大孔树脂层析、DEAE纤维素DE52层析和反相高效液相色谱层析,分离纯化发酵液中的重组水蛭素Ⅲ,优化纯化条件.通过SDS-PAGE和分析型反相高效液相色谱对重组水蛭素Ⅲ的纯度进行鉴定.以质谱对重组水蛭素Ⅲ的分子量进行鉴定.通过肽图的测定来鉴定重组水蛭素Ⅲ的结构. 结果通过优化后的分离纯化步骤得到了纯度为95.4786%的纯品,总产率为39%.得到的产物分子量为6 913.32 ± 6.55 Da,与重组水蛭素Ⅲ分子量的理论值相符,其结构亦与理论值一致. 结论优化后的分离纯化步骤可以有效地用于大肠杆菌发酵液中重组水蛭素Ⅲ的大规模分离纯化.所得的高纯度产物确为基因重组水蛭素Ⅲ.     

重组水蛭素Ⅲ的工程菌的培养及高密度发酵

为提高重组水蛭素Ⅲ工程菌的产水蛭素量，采用正交实验法确定了较佳培养基组分，优化了摇瓶发酵工艺和发酵条件，工程菌摇瓶水蛭素产量稳定在2000ATU／ml左右，30L发酵罐批式发酵水蛭素产量达到4000ATU／ml，补料一批式发酵水蛭素产量达到8000ATU／ml。     

重组水蛭素Ⅲ多克隆抗体的制备

目的:制备重组水蛭素Ⅲ(rHV3)多克隆抗体。方法:分别用戊二醛法与碳二亚胺法处理抗原,电泳检测rHV3自身交联及与牛血清白蛋白(BSA)交联结果;分别免疫家兔、豚鼠和大鼠后取血清,双向免疫扩散试验测定效价。结果:rHV3交联BSA后作为抗原免疫豚鼠和家兔产生了抗体,抗体效价1∶16。结论:rHV3交联BSA作为rHV3抗原免疫家兔、豚鼠可以产生rHV3多克隆抗体。     

冻干重组水蛭素Ⅲ的稳定性研究

目的研究冻干重组水蛭素Ⅲ的稳定性,为选择包装材料、确定贮藏条件和有效期提供依据。方法通过影响因素实验,加速实验和长期稳定性实验,对其外观性状、溶解性、干燥失重、活性等进行研究。结果该制剂的主要影响因素是湿度和温度,光照影响不大;加速试验条件下6个月时活力能保持80%左右,其他指标正常;长期稳定性试验条件下,放置12个月后,各项指标均符合质量标准。结论该制剂可在室温下稳定保存12个月。     

水蛭素及重组水蛭素的研究概况

目的综述水蛭素、重组水蛭素的药理作用与临床应用研究进展,为其临床应用提供参考。方法依据近年采国内外文献,进行分析、归纳和总结。结果与结论水蛭素、重组水蛭素是迄今发现的活性最强的特异性凝血酶抑制剂,通过与凝血酶特异性结合而产生强有力地抑制血液凝固的作用,在心、脑血管系统疾病等方面的抗凝、抗血栓的应用广泛,药物开发前景广阔。     

重组水蛭素抗血栓作用研究进展

水蛭素是从医用水蛭中分离出的一种多肽，它具有抗凝、抗血栓等药理作用。重组水蛭素为其基因工程产物，它与天然水蛭素的药理作用基本相同。本文综述重组水蛭素抗血栓作用的研究进展。     

重组水蛭素Ⅲ工程菌菌种稳定性考察

研究基因工程菌E.coli ASl. 357在LB培养基中传代50代过程中菌种的稳定性.以菌体和菌落的形态、质粒稳定性(ST)、质粒酶切图谱和水蛭素的表达量以及比活等方面进行考察,以评价工程菌的稳定性.重组水蛭素Ⅲ工程菌在传代50代的过程中质粒稳定性高,传代10代内质粒稳定性(ST)为98%,且表达稳定,表达产物可达发酵液可溶性蛋白总量的60%,产物的抗凝血酶活力大于2.0×103ATU/ml,传代50代的菌体与菌落呈典型的大肠杆菌形态.重组水蛭素Ⅲ工程菌菌种稳定.     

水蛭素及重组水蛭素体内外分析方法的研究进展

 水蛭素是天然的凝血酶抑制剂,由65个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为7 000,等电点为3.8。大量的研究表明,水蛭素具有强大的抗血栓和抗凝血作用。随着基因工程技术的发展,重组水蛭素产品也得到了开发,从而克服了天然水蛭素产量的不足。重组水蛭素与天然水蛭素具有相似的结构和相同的药理活性。本文综述了近20年来国内外关于水蛭素及重组水蛭素的体内外分析方法,主要有以下4个方面：① 生物测定法,包括凝血酶滴定法、抗凝法、生色底物法、蝰蛇毒凝血时间测定法。② 免疫测定法,包括放射免疫测定法、酶联免疫吸附分析法、三抗体夹心酶免疫吸附法。③ 同位素标记法。④ 光散射法等。本文旨在为重组水蛭素的进一步研究和质量控制提供参考。     

重组水蛭素的表达纯化及活性检测方法进展

作为直接凝血酶抑制剂，重组水蛭素在临床上的应用已越来越重要。文章综述了重组水蛭素的表达、分离纯化及其理化性质和活性检测方法的进展。     

重组水蛭素Ⅲ口服乳糜微粒的研究

为了实现重组水蛭素Ⅲ口服给药途径并验证其药效.将其制成乳糜微粒,比较了3种制备方法,确定了逆相蒸发法为rHV3乳糜微粒的最佳制备方法.优化了制备条件,通过正交实验确定了rHV3乳糜微粒配方,制得的rHV3乳糜微粒的包封率为(65.08±1.96)%.在-20℃保存条件下rHV3乳糜微粒稳定性良好.药效学实验结果表明,口服rHV3乳糜微粒具有良好的抗凝和抗栓作用.     

重组水蛭素

水蛭素（Hirudin）因最早从水蛭中分离而得名。天然水蛭素由65个氨基酸残基组成，分子量7000道尔顿。水蛭素能同凝血酶的催化中心及纤维蛋自原结合中心发生不可逆的结合，使凝血酶失活。由凝血酶介导的各种效应均可被水蛭素抑制／阻断，为目前发现的最强的凝血酶抑制剂。     

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞的保护作用

为研究重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞(HLEC)的保护作用.采用D-半乳糖建立人晶状体上皮细胞损伤模型,用重组水蛭素Ⅲ作用于受损细胞.设置正常组、模型组、低、中和高剂量重组水蛭素Ⅲ组以及阳性药白内停组,观察各组细胞密度和形态,用MTT法检测各组细胞存活率,考察各组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力.结果表明,当D-半乳糖浓度为50×10-3 mol/L时,模型组与正常组细胞有显著差异.重组水蛭素Ⅲ作用后受损细胞的存活率和SOD活性显著提高.因此,重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞有明显的保护作用.     

Lepirudin—抗凝血重组水蛭素

水蛭秦是抗凝血多肽，原先是从水蛭（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）涎腺中获得的。在弄清其多肽结构后，人们用基因技术生产各种水蛭素，并进行临床研究。Ｌｅｐｉｒｕｄｉｎ是一种重组水蛭素，这在疗效和特异性方面性与水蛭水水蛭素没有本质区别。１９９７年春，Ｌｅｐｉｒｕｄｉｎ（Ｒｅｆｌｕｄａｎ＾Ｒ）被批准用于免疫介导、肝素诱发的血小板减少（Ⅱ型）和血栓栓塞性并发症患者抑制凝血，从而提供了新一类抗凝剂代表     

重组水蛭素的表达和纯化及临床应用进展

重组水蛭素为基因工程的产物,与天然水蛭素有相同的功效,为新一代高效安全的抗凝、防栓药物.文中综述了重组水蛭素的表达、纯化及临床应用的研究.     

重组水蛭素Ⅲ滴眼液的组织分布和排泄研究

为了研究重组水蛭素Ⅲ(recombinant hirudin Ⅲ,rHVⅢ)滴眼剂在新西兰兔中的组织分布和粪尿排泄,用氯胺-T法将放射性同位素125I标记到rHVⅢ的酪氨酸残基上,通过同位素示踪方法考察滴眼给药后125I-rHVⅢ在新西兰兔体内的组织分布和粪尿排泄。结果发现新西兰兔滴眼给予125I-rHVⅢ后,125I-rHVⅢ主要通过肾脏排出,给药后120 h通过尿液排出放射性活度占总放射性活度的(81.54±10.78)%,同时通过粪便排出的放射性活度仅为(6.20±2.05)%。将放射性活度高的尿液,经RP-HPLC分离,实验结果表明尿液中存在重组水蛭素Ⅲ原型且比例达23.52%以上。组织分布实验结果表明,rHVⅢ原型及其代谢物在肾脏、血浆分布最多,脑中几乎无分布;rHVⅢ原型及其代谢物在眼部主要分布在角膜及巩膜,房水也有分布,而玻璃体和晶状体几乎没有分布。因此,rHVⅢ主要通过肾脏代谢并以原型和代谢物的形式通过尿液排出体外。     

重组水蛭素临床应用的研究进展

重组水蛭素是一种特异的凝血酶抑制剂，它能与血浆中游离的和与纤维蛋白结合的凝血酶结合，以防止血栓形成。本文综述了重组水蛭素的临床应用，包括急性心肌梗死溶栓后的辅助治疗、治疗不稳定型心绞痛、深静脉血栓、Ⅱ型肝素相关的血小板减少症和弥漫性血管内凝血，并在血液透析和体外循环时预防血栓形成。     

新型大肠杆菌融合表达系统表达水蛭素Ⅲ基因研究

选用大肠杆菌Ｌ－门冬酰胺酶（ＡＳＰｓⅡ）高效表达质粒ｐＫＡ作为融合表达载体,将水蛙素Ⅲ（ＨＶ３）人工合成编码基因插入 ｐＫＡ质粒的 ＡＳＰｓⅡ编码基因 ａｎｓＢ中,使 ＡＳＰｓ Ⅱ１Ｎ端的 ８９个氨基酸残基通过甲硫氨酸残基与 ＨＶ３形成融合蛋白,从而构建成 ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白表达质粒 ｐＫＡＨ,通过基因操作将该质粒的低拷贝数复制原长更换成 ｐＵＣ高拷贝数复制原点,进而构建成ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白高效表达载体 ｐＵＫＡＨ。该质粒在大肠杆菌 ＪＭ１０５宿主细胞中表达后,融合蛋白（１５． ６ ｋＤ）占细菌总蛋白 １０ ５％,该融合蛋白经 ＣＮＢｒ切割释放出活性水蛭素分子,抗凝血活力达约 ２０ ＡＴＵ／ｍｌ培养液,为以后进一步研究打下了基础。     

BAEE法测定重组水蛭素的生物活性

目的建立重组水蛭素的生物活性测定方法。方法用BAEE(N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯)作底物,通过测定反应体系中未被水蛭素抑制的凝血酶的量,来间接测定水蛭素抗凝血酶的活力。结果重组水蛭素的生物活性测定曲线在3.2~12.8 ATU之间线性关系良好,回归方程为Y=-0.034 8X+0.7,r=0.999 3。结论BAEE法经济、便捷、准确可靠、重现性好,适宜作为该品种的生物活性测定方法。     

重组水蛭素Ⅲ的质量控制标准研究

通过测定重组水蛭素Ⅲ的质粒中目的基因序列、重组水蛭素Ⅲ分子质量、C末端序列以及菌体蛋白和DNA残留量，对重组水蛭素Ⅲ的质量进行研究。结果：重组质粒经Nhe Ⅰ、HindⅢ双酶切和基因序列测定，表明工程菌所携带的质粒上含有完整的信号肽基因、Nhe Ⅰ酶切位点、水蛭素HV3基因和HindⅢ酶切位点；还原性SDSPAGE结果表明在14000 u处有单一条带，为重组水蛭素Ⅲ二聚体；测定样品分子C端序列为E—D—Y—A—D—E—P—I—P—E—F，与重组水蛭素Ⅲ的理论值一致；重组水蛭素Ⅲ样品中的残留菌体蛋白和DNA含量分别是0．02％和每剂量样品中残留DNA含量低于2．8ng。结论：从基因水平、蛋白水平和杂质的角度证明重组水蛭素Ⅲ产品符合质量控制标准。