多药耐药细胞系K562/HHT和K562/VCR的建立及耐药性逆转的研究

目的研究人白血病细胞多药耐药（ＭＤＲ）的发生机理及逆转方法。方法建立了Ｋ５６２／ＨＨＴ和Ｋ５６２／ＶＣＲ两株ＭＤＲ细胞系，经免疫组化染色观察了Ｐ－糖蛋白（Ｐｇｐ）和ＭＤＲ相关蛋白（ＭＲＰ）的表达；采用四氮甲基唑蓝（ＭＴＴ）药敏试验及测定细胞内柔红霉素（ＤＮＲ）含量的方法研究了异搏定和红霉素对ＭＤＲ的逆转作用。结果两株ＭＤＲ细胞系均有Ｐｇｐ高度表达，但无ＭＲＰ表达。５μｇ／ｍｌ异搏定和５０μｇ／ｍｌ红霉素都能部分逆转两株ＭＤＲ细胞系的耐药性。２．５～１０μｇ／ｍｌ异搏定不仅能增加ＭＤＲ细胞对ＤＮＲ的摄取量，也能减少ＤＮＲ的外排，且上述作用随异搏定浓度的增加而增强；５０～２００μｇ／ｍｌ红霉素则对ＭＤＲ细胞摄取和外排ＤＮＲ无明显影响。结论Ｐｇｐ可能与白血病细胞产生ＭＤＲ有关；异搏定和红霉素对白血病细胞ＭＤＲ有逆转作用。     

铁剥夺对 DNR诱导 K562细胞多药耐药基因表达的影响

目的 探讨铁剥夺对柔红霉素（DNR）诱导多药耐药基因MDR1表达的影响。方法 以柔红霉素单用或联合应用去铁胺（DFO）或二氯化铁（FeCl3）为处理因素作用于人红白血病细胞株K562,应用RT—PCR法、流式细胞分析技术,检测K562细胞多药耐药基因信使核糖核酸（MDR1mRNA）和P-糖蛋白（Pgp）表达的情况。结果 ①与空白对照组相比,柔红霉素（1μmol／L）作用24h可使MDR1／Pgp表达增加（P〈0．05）;②与单用DNR组相比,DFO可显著抑制柔红霉素诱导的MDR1／Pgp的表达,而FeCl3的作用相反（P〈0．05）。结论 柔红霉素短期作用可诱导MDR1表达,提示化疗药本身的诱导作用在肿瘤多药耐药产生中发挥重要作用。铁剥夺可减少柔红霉素诱导的MDRI／PgP表达,而FeCl3的作用相反,提示铁剥夺有可能成为阻止或降低白血病化疗耐药的新的措施之一,而白血病化疗患者补铁应慎重。     

去铁胺对K562细胞多药耐药基因MDR1及核因子κB表达的影响

目的 探讨去铁胺对柔红霉素（DNR）诱导多药耐药基因MDR1及核因子KB（NFκB）表达的影响,初步了解NFKB与MDR1表达、细胞内铁代谢的关系。方法 以DNR单用或联合应用25μmol／L去铁胺（DFO）为处理因素作用于人红白血病细胞株K562,应用RT-PCR法、流式细胞分析技术分别检测对照组、DNR组和DNR＋DFO组K562细胞MDRlmRNA和P糖蛋白（PgP）的表达情况,同时采用免疫组织化学染色法检测NFKBκB表达及活性情况。结果 与对照组相比,DNR可同时诱导MDRlmRNA、Pgp表达和NFgB活化（P〈0．05）;25μmol／LDFO联合DNR可显著抑制DNR诱导的MDRlmRNA、Pgp的表达及NFKB的活化（P〈0．05）。结论 去铁胺可减少柔红霉素诱导的MDRl、PgP表达,其机制可能与铁剥夺后降低了柔红霉索诱导的K562细胞的氧化应激反应,进而影响NFκB的活化有关。     

采用Calcein-AM评价白血病细胞膜P-gp泵功能及其逆转剂合理应用的研究

目的通过荧光染料Calcein—AM（C—AM）在K562及其耐长春新碱（VCR）的细胞系K562／VCR细胞中的变化以及异搏定（VER）、环孢霉素A（CSA）对C—AM在K562和K562／VCR细胞中摄取与排出的影响,研究C—AM在评价P—gP泵功能的作用,评价两种逆转剂的逆转作用,为临床合理应用逆转剂提供实验依据。方法以K562及K562／VCR为实验对象,以流式细胞术测定两种细胞系内不同时间点（0、30、60、90和120min）的C—AM荧光强度来反映P—gP泵功能以及CSA、VER对其的影响。结果C—AM在K562和K562／VCR细胞中的变化以24h内最为明显,24h后K562细胞和K562／VCR细胞内C—AM荧光强度分别下降至14．57％和15．64％。其在K562细胞内各时间点的平均荧光强度（MFI）明显高于K562／VCR细胞（各时间点差异P值均〈0．05）;CSA、VER和CSA＋VER对K562细胞内C．AM的摄取和外排无明显影响,但各组逆转剂、C—AM与细胞共孵育120min后,对照组、CSA、VER和CSA＋VER组的K562／VCR细胞MFl分别为3251±106．7、4014±219．0、3879±116．1和4158±302．6,与对照组相比,后三组细胞对CAM的摄取明显增加（P均〈0．05）。当外排120min后,对照组、CSA、VER和CSA＋VER组的K562／VCR细胞MFl分别为1622±191．0、2237±155．2、1932±233．0和2231±146．7,与对照组相比,后三组的CAM残余量也明显增加（P均〈0．05）,表明CSA、VER和CSA＋VER能增加K562／VCR细胞对C—AM的摄取和减少细胞内C—AM的外排。结论P—gP的表达能减少K562／VCR细胞对C．AM的摄取和增加其对C—AM外排,逆转剂CSA与VER的联合应用对K562／VCR细胞摄取和外排C—AM的影响并不比单独使用CSA或VER明显,通过使用C—AM和流式细胞术,可以比较迅速、简便评价白血病细胞P—gP的泵功能以及逆转剂的逆转作用。     

四株人白血病多药耐药细胞系的建立及其生物学特性的初步研究

我们对人红白血病细胞株Ｋ５６２和人早幼粒细胞白血病细胞株ＨＬ－６０应用高三尖杉酯碱（ＨＨＴ）或长春新碱（ＶＣＲ），采用反复短期暴露法，并逐渐增加ＨＨＴ和ＶＣＲ的浓度，成功地建立了Ｋ５６２／ＶＣＲ、Ｋ５６２／ＨＨＴ、ＨＬ－６０／ＶＣＲ和ＨＬ－６０／ＨＨＴ四株具有高度耐药性的多药耐药（ＭＤＲ）细胞系。免疫组织化学染色显示，Ｋ５６２／ＶＣＲ、Ｋ５６２／ＨＨＴ及ＨＬ６０／ＶＣＲ三株ＭＤＲ细胞系有Ｐ－糖蛋白     

Bcl-2反义寡核苷酸对多药抗性HL-60/HHT细胞耐药性逆转的研究

目的探讨bcl-2基因在急性白血病细胞凋亡及耐药性中的作用及Bcl-2反义寡核苷酸（ASON）逆转耐药性的效果。方法细胞耐药性测定采用MTT法,Bcl-2和Bax蛋白含量测定采用单克隆抗体标记技术在流式细胞仪上测定,细胞凋亡率采用流式细胞仪测定。结果（1）Bcl-2水平在HL-60/HHT细胞系明显高于HL-60细胞系（P＜0.01）;（2）Bcl-2ASON可逆转HL-60/HHT的耐药性（P＜0.01）;（3）HL-60/HHT细胞系的凋亡百分率经ASON作用明显升高（P＜0.05）,经ASON+HHT作用后升高更加显著（P＜0.01）;（4）Bcl-2ASON可明显降低Bcl-2表达水平（P＜0.01）。结论在HL-60/HHT细胞系中,Bcl-2的高度表达是造成其耐药的重要原因;反义技术可以通过下调Bcl-2/Bax比值,部分逆转它的耐药的发生。通过进一步的深入研究,反义技术将有可能应用于难治及耐药的急性白血病。     

槲皮素对柔红霉素致大鼠心肌细胞损伤的保护作用

目的探讨槲皮素（QUE）对柔红霉素（DNR）诱导心肌细胞损伤的保护作用及其机制。方法体外分离培养心肌细胞，分为空白对照组、DNR组、DNR＋QUE组、QUE组；孵育24h，显微镜下观察心肌细胞形态，流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率．检测培养介质中乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量。结果与DNR组比，DNR＋QUE组脱落细胞减少，细胞碎片减少，细胞凋亡率降低（P〈0．05），LDH和MDA含量降低（P〈0．05），SOD活性增高（P〈0．05），且有剂量效应关系。结论25～100μmol／L槲皮素能减轻柔红霉素对心肌细胞损伤，具有细胞保护作用，机制可能与其抗氧化作用有关。     

B族链球菌的红霉素耐药基因研究

目的 比较不同地区B族链球菌（GBS）对红霉素耐药性的差异及耐药基因谱特点。方法 用琼脂稀释法，测定红霉素、克林霉素对不同地区（北京，广州，俄罗斯圣彼得堡）的113株GBS的最低抑菌浓度（MIC），同时用PCR和核酸杂交的方法，检测红霉素耐药基因mreA、mefA、ermA、ermB、ermC在该批菌株中的出现规律及其与红霉素耐药性的关系。结果 （1）北京、广州两地GBS菌株总耐药率为46％，与克林霉素耐药性的一致率为93．8％；所有ermA基因均来自北京菌株，而广州菌株不含该基因。（2）含ermA和（或）ermB基因的GBS占所有菌株的30．09％，其耐药率高达97．06％，在已检测的GBS菌株中未发现ermC基因。（3）分别有53株和18株含mreA和mefA的GBS以及1株含ermA的菌株仍对红霉素敏感。2株GBS不含上述任何一种基因，但仍对红霉素耐药。结论 （1）北京、广州两地GBS对红霉素普遍具有较高的耐药率，且与大环内酯－林可霉素－链阳性霉素B类抗生素之间存在较严重的交叉耐药，临床使用抗生素时应尽量避免重复选择此类抗生素；（2）ermA和ermB是决定我国北京、广州GBS对红霉素耐药的重要基因；（3）GBS的耐药性还有其他分子生物学机制参与。     

超声检查评价柔红霉素对急性白血病患儿左心室功能的影响

采用彩色超声诊断仪对以柔红霉素（DNR）为主要药物治疗的53例急性白血病（AL）患儿和30例健康儿童的左心室功能（LVF）进行测定，发现AL患儿治疗前的LVF与健康儿童无差异（P＞0．1），DNR治疗后，当DNR累积剂量达到（120～20）mg／m2时，AL患儿的左心室舒张功能（LVDF）较治疗前明显受损（P＜0．05）。当DNR累积剂量达到360mg／m2以上时，LVDF受损进一步加重，并伴有左心室收缩功能（LVSF）受损（P＜0．01〕。结果提示：DNR可影响AL患儿的LVF，且LVDF受损较LVSF受损为早，彩色超声检查可作为DNR治疗AL时心脏毒性监测的可靠方法。     

小儿急非淋白血病持续完全缓解临床探讨

目前治疗急性白血病的关键是如何延长缓解期，克服耐药性，防止髓外白血病发生，为探讨提高无生存的方法，我们采用COAP＋DNR（柔红霉素）作诱导巩固治疗，多种方案交替进行维持治疗，使12例急非林白血病持续缓解已达2．5年以上，现报告如下。一、对象病例系1989年6月～1990年10月经临床及细胞形态学、组化染色确诊的ANLL12例。急单3例，急拉（m2）7例，急拉（m1）2例；男10例，女2例；年龄（4～7）岁6例，（7～10）岁3例，＞10岁3例；伴眼部浸润3例；确诊前未经任何治疗。二、方法诱导方案选用COAP，Prednison60mg／（m2·d）（1～7…     

钙拮抗剂和钙调素拮抗剂对白血病多药耐药细胞内阿霉素浓度的影响及P-GP表达的关系

白血病多药耐药细胞K562/VCR细胞内Dox浓度明显低于对照组,而P-GP表达则明显高于对照组,提示P-GP的过度表达可能是肿瘤细胞产生MDR的机理之一。CaS及CaMAS可下调K562/VCR P-GP的表达,增加其胞内Dox浓度,表明CaS和CaMAS逆转肿瘤细胞MDR的机理也与降低细胞膜P-GP表达有关。     

氯丙嗪对白血病细胞株K562/AO2多药耐药逆转作用的实验研究

目的研究氯丙嗪对阿霉素诱导的K562耐药细胞株(K562/AO2)多药耐药的逆转作用及机制,以便为临床应用提供实验依据.方法 (1)以四氮甲基唑蓝(MTT)法检测氯丙嗪的细胞毒性及其对K562/AO2细胞的耐药逆转作用;(2)以流式细胞术检测氯丙嗪处理前后K562/AO2细胞内柔红霉素(DNR)的蓄积量;(3)以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测氯丙嗪处理前后后K562/AO2细胞中mdr-1 mRNA的表达水平.结果 (1)氯丙嗪在3 μg/ml时对K562/AO2增殖的抑制作用小,抑制率＜5%;(2)氯丙嗪明显增加DNR对K562/AO2的毒性作用(P＜0.05),耐药逆转倍数为1.901;(3)氯丙嗪可明显增强DNR在K562/AO2细胞内的蓄积(P＜0.05);(4)氯丙嗪对K562/AO2细胞mdr-1 mRNA的表达水平无影响.结论氯丙嗪通过增加K562/AO2细胞内DNR的蓄积显著提高 K562/AO2细胞对DNR的敏感性,其逆转白血病细胞多药耐药的机制与mdr-1基因无关,还有待进一步探讨.     

β-榄香烯对K562细胞周期与细胞凋亡的影响及其机制探讨

目的探讨β-榄香烯(β-ELE)对人慢性髓性白血病细胞株K562细胞周期及细胞凋亡的影响及其机制。方法K562和不同浓度的β-ELE共同培养后,应用流式细胞仪技术和Hoe-chest33258/PI荧光染色法检测β-ELE对K562细胞周期及凋亡的影响,应用RT-PCR技术测定野生型p53活化片段(P21wild-type p53 activated fregmentl,P21WAF1)、Survivin mRNA水平。结果不同浓度β-ELE能使K562细胞阻滞于G1期,G1期细胞百分比增加,S期细胞百分比明显下降,呈剂量、时间依赖性,且与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。β-ELE作用于K562细胞24h,48h后,在G0/G1期前,可见明显的亚二倍体(凋亡峰),其凋亡率呈剂量、时间依赖性,与对照组比较有显著意义(P<0.01)。Hoechest33258/PI免疫荧光技术发现β-ELE能使凋亡细胞数目明显增多(P<0.01)。RT-PCR结果显示β-ELE能下调K562细胞Survivin mRNA表达,上调P21WAF1mRNA的表达(P<0.01)。结论β-ELE能够阻止细胞K562细胞从G1期向S期转换。β-ELE可以诱导K562细胞凋亡,呈剂量、时间依赖性。β-ELE导致细胞周期阻滞可能与上调P21WAF1mRNA的表达有关;促进K562细胞凋亡机制可能与下调Survivin mRNA的表达有关。随着药物浓度的增加,P21WAF1mRNA表达增加,而SurvivinmRNA表达下降。     

多药耐药细胞系HL60/HHT的建立及耐药机理的初步探讨

为探讨HL60/HHT细胞系耐药性的分子机理,采用反复短期暴露法建立HL60/HHT细胞系,并检测其bcl-2和bax的含量。结果表明,建立了多药抗性HL60/HHT细胞,其bcl-2水平为HL60的1.50倍(92.05/61.35),有显著性差异(P<0.01)。其bax蛋白在二种细胞中均低水平表达(HL6015.92,HL/60/HHT17.63),差异无显著意义(P>0.05)。因此,bcl-2的高表达是造成HL60/HHT耐药的重要原因之一     

锌指蛋白ZFX在儿童B系急性淋巴细胞性白血病中的表达及意义

目的：研究儿童B系急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）患者骨髓单个核细胞中X染色体耦联锌指蛋白（ZFX）的表达及其与白血病预后的关系。方法：通过Western blot方法检测白血病细胞株（REH、HL-60、NB4、K562）中ZFX蛋白的表达;利用PCR方法扩增获得全长ZFX,并测序验证;通过实时定量PCR检测82例初发B-ALL儿童骨髓样本,24例B-ALL缓解期样本,以及64例骨折或先天性心脏病手术患儿样本(对照组)ZFX的表达;并根据治疗3年内有无骨髓或中枢神经系统复发分为预后好组和预后差组,比较两组患儿初发时骨髓中ZFX mRNA的表达水平。结果：ZFX蛋白在白血病细胞株REH、HL-60、NB4和K562中均有表达。初发ALL组骨髓中ZFX mRNA表达高于对照组（P＜0.01）;ALL缓解组ZFX mRNA表达明显低于ALL初发组（P<0.01）;预后差的ALL患儿初发骨髓中ZFX mRNA的表达高于预后好的患儿（P＜0.05）。结论ZFX在儿童B-ALL中高表达,且预后差组表达相对较高,提示它可能在B-ALL预后判断中有重要意义。     

Livin反义寡核苷酸对K562细胞增殖、凋亡和耐药的影响

目的 探讨Livin反义寡核苷酸(ASODN)对白血病细胞K562增殖、凋亡和耐药的影响.方法设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸(MSODN),脂质体(Lip)介导转染K562细胞,实验分为Lip-ASODN组、Lip-MSODN组、Lip对照组和细胞对照组4组,采用反转录-PCR法检测Livin mRNA的表达;四甲基偶氮唑蓝法与膜联蛋白V异硫氰酸荧光素法检测Livin ASODN与K562细胞增殖、凋亡及与高三尖杉酯碱(HHT)耐药的关系.结果 Livin ASODN可显著抑制K562细胞增殖(P<0.01),且作用具有时间和浓度依赖性.终浓度为600 nmol·L-1的Lip-ASODN能明显降低Livin mRNA表达,细胞凋亡率达(36.89±1.08)% (P<0.01),而Lip-MSODN组、Lip对照组与细胞对照组之间差异均无统计学意义(Pa>0.05).Livin ASODN可增加K562细胞对HHT的耐药性,半数抑制质量浓度为(0.37±0.02)mg·L-1;与HHT及小剂量阿糖胞苷联合应用可显著抑制细胞增殖(P<0.01).结论 Livin ASODN可下调Livin基因表达,有效抑制K562细胞的增殖,增加K562细胞凋亡及其对HHT的敏感性.     

三氧化二砷对白血病细胞系K562和HL-60血管内皮生长因子表达的影响

目的研究三氧化二砷对白血病细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法体外培养白血病细胞株K562、HL-60,加入不同浓度的As2O3干预,用Westem bloting和荧光定量RT-PCR测定VEGF的蛋白和mRNA表达。结果K562和HL-60细胞经As2O3作用后,VEGF的蛋白表达明显减少,但VEGFmRNA拷贝数无差异。结论As2O3在蛋白水平抑制白血病细胞VEGF的表达,从而抑制骨髓血管生成,抑制白血病细胞的生长。     

全反式维甲酸对抗肿瘤药物促进HL-60细胞凋亡作用的影响

目的 观察诱导分化剂对抗肿瘤药物促进ＨＬ－６０细胞凋亡的影响。方法 采用苏木精染色,流式细胞仪及ＤＮＡ电泳的方法,研究全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）分别与阿糖胞苷,长春新碱,鬼乙叉甙,柔红霉素４种抗肿瘤药协同作用后ＨＬ－６０细胞凋亡的发生情况。结果 当先以ＡＴＲＡ作用ＨＬ－６０细胞３天后再分别给予抗肿瘤药物,发现各个药物经起的凋亡细胞的数量减少６０％以上,反之先以抗肿瘤药作用后再以ＡＴＲＡ处理ＨＬ－６０