尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６～４５４ｂｐ一段长５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得的ｕＰＡＲｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细胞株９５Ｄ，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ证实转染细胞克隆有ｕＰＡＲ反义ＲＮＡ的表达。结论重组质粒ｐＵＲＡＳ能在肺癌细胞株９５Ｄ中表达尿激酶受体反义ＲＮＡ，尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ表达质粒的构建获得成功。     

鼠白细胞介素—2受体α,β链基因反义RNA真核表达质粒的 …

目的 构建鼠ＩＬ－２Ｒα与β链基因的反义ＲＮＡ真核表达质粒,为反义ＲＮＡ基因治疗细胞免疫相关疾病作准备。方法 用限制性内切酶从克隆体上切下鼠ＩＬ－２Ｒα与β链ｃＤＮＡ及鼠ＩＬ－２启动子,克隆入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３的多克隆位点上,用酶切或ＰＣＲ法鉴定正反连接。结果 得到４个反向连接的重组质粒：ｐｃＡｎｔｉ－ｍＩＬ－２Ｒα,ｐｃＡｎｔｉ－ｍＩＬ－２Ｒβ,ｐ;ｃＡｎｔｉ－ｍＩＬ－２Ｒαβ及ｐｃｉＡｎ     

鼠白细胞介素-2受体α、β链基因反义RNA真核表达质粒的构建

【目的】构建鼠IL 2Rα与β链基因的反义RNA真核表达质粒 ,为反义RNA基因治疗细胞免疫相关疾病作准备。【方法】用限制性内切酶从克隆载体上切下鼠IL 2Rα与β链cDNA及鼠IL 2启动子 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3的多克隆位点上 ,用酶切或PCR法鉴定正反连接。【结果】得到 4个反向连接的重组质粒 :pcAnti mIL 2Rα ,pcAnti mIL 2Rβ,pcAnti mIL 2Rαβ及pciAnti mIL 2Rαβ。前三者由CMV强启动子指导鼠IL 2R基因反义RNA的表达 ,后者由CMV启动子与鼠IL 2靶向可诱导型启动子组成的融合启动子指导反义RNA的表达。【结论】成功构建了 4个不同类型的鼠IL 2R基因反义RNA真核表达质粒。     

尿激酶受体反义寡核苷酸抑制乳腺癌细胞的浸润

尿激酶受体（uPAR）与乳腺癌细胞的浸润转移有关【瞩。通过站抗尿激酶（＂l，A）或uPAR的功能可能是抑制乳腺癌浸润转移的有效手段。本研究应用uPAR反义寡校青酸（Anti－0DNS）研究11r7rtll在乳腺癌细胞浸润、转移中的作用。一、材料与方法1．主要试剂及仪器：uPAR单克隆抗体为美国AInricandipec产品。BiocoaMatrigel浸润小室为美国Bectonfi。kinson］211：：）wale产品。流式细胞仪EpicsXL型为美国Culter公司产品。GSap扫描吸光度仪为美国Hther＆iendricInstants产品。2．细胞培养：人乳腺癌MDA－MK231细胞置含体积分数0．15…     

肝癌相关抗原HAb18G反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定

目的 构建HAb18G反义RNA表达质粒载体。方法 用DNA重组技术将人HAb18G基因反向克隆到真核表达质粒PCI－neo中，构建成HAb18G反义RNA表达质粒PCI－asHAb18G。用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HHCC，经G418筛选后获得的克隆进行鉴定。结果 HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI－asHAb18G经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。流式细胞仪及免疫组化SP法染色均证实：转染细胞HHCC／asHAb18G中HAb18G表达为阴性，而转染空载体的HHCC／neu及HHCC均为强阳性。结论 成功构建了HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI－asHAb18G。为进一步研究HAb18G蛋白分子的生物学功能及肝癌的基因治疗研究奠定了基础。     

表皮生长因子受体反义RNA表达对乳腺癌细胞恶性表型的抑制作用

表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白［１］。为了直接观察ＥＧＦＲ过表达在人类肿瘤中的作用，我们应用反义核酸技术，针对ＥＧＦＲ５′１３５０ｂｐ片段构建了反义ＲＮＡ表达质粒ｐＬＸＳＮＡＥ５′，将其导入人乳腺癌细胞ＭＤＡＭＢ...     

反义Toll样受体4表达质粒对内毒素刺激小鼠巨噬细胞的影响

目的　研究反义Toll样受体 4 (TLR4 )表达质粒对体外内毒素刺激小鼠巨噬细胞的作用。方法　反义TLR4表达质粒的构建 ,及转染入巨噬细胞株RAW 2 6 4 .7。在不同时间用不同浓度的内毒素刺激转染细胞及对照组细胞。用半定量RT PCR技术检测TLR4mRNA的变化 ,ELISA方法检测TNF α水平的变化。结果　转染细胞的TLR4mRNA水平低于对照组细胞。在体外用不同浓度内毒素及不同时间刺激的两组细胞TNF α水平低于对照组细胞。结论　反义TLR4表达质粒能够下调体外细胞TLR4mRNA的表达 ,降低细胞因子TNF α的分泌     

雄激素受体反义RNA逆转录病毒载体的构建及其鉴定

目的　构建雄激素受体 (AR)反义RNA逆转录病毒载体pL AR SN并进行包装和鉴定。方法　PCR扩增ARcDNA片段并将之反向插入到逆转录病毒载体pLXSN ,用脂质体法转染PA31 7细胞 ,提取转染细胞基因组DNA和培养上清中重组逆转录病毒RNA ,用PCR和RT PCR法进行鉴定 ,NIH 3T3细胞测定病毒滴度。结果　限制性内切酶分析证明pL AR SN含有反向插入的ARcDNA目的片段 ;培养上清中病毒滴度为 2 .34× 1 0 5 CFU/ml,PCR和RT PCR分别从转染细胞基因组DNA和培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的目的片段。结论　成功构建了AR反义RNA逆转录病毒载体并包装出了高滴度的重组逆转录病毒。     

雄激素受体反义RNA抑制前列腺癌细胞LNCaP致瘤性的研究

目的　观察雄激素受体 (Androgenreceptor ,AR)反义RNA对前列腺癌细胞LNCaP致瘤性的影响。方法　分别用细胞平板克隆形成试验及裸鼠接种实验观察前列腺癌细胞LNCaP、LNCaPNeo和LNCaPas AR 细胞致瘤性的变化。结果　LNCaPas AR细胞的克隆形成效率显著低于LNCaPNeo细胞 (P <0 .0 1)。LNCaPas AR细胞在雄性裸鼠体内形成的瘤体体积明显小于LNCaPNeo细胞并且形成瘤体的时间延长。结论　雄激素受体反义RNA可抑制前列腺癌细胞LNCaP成瘤能力。     

雄激素受体反义RNA对前列腺癌细胞雄激素受体表达的抑制作用研究

目的 观测雄激素受体（AR）反义RNA逆转录病毒表达载体在前列腺癌细胞中的表达及其对AR表达的影响。方法 将AR反义RNA逆转录病毒表达载体导入前列腺癌细胞株LNCaP，PCR检测AR目的片段在重组LNCaP细胞基因组中的存在，RT－PCR检测AR反义RNA表达和AR mRNA水平，Western blot检测AR蛋白表达水平。结果 PCR在LNCaP^as-AR基因组DNA中扩增出了AR目的片段，表明AR目的片段整合到了细胞基因组。RT－PCR证实LNCaP^as-AR有AR反义RNA表达，且其AR mRNA水平较LNCaP和空载体转染的LNCaP^Neo显著下调（P＜0.05)，Western blot证实LNCaP^as-AR细胞AR蛋白含量显著下降（P＜0.05)。结论 AR反义RNA可抑制前列腺癌细胞AR表达。     

mPLG—PGEM重组表达质粒构建及反义RNA探针的制备和标记

纤溶系统参与体内众多的与细胞外基质降解有关的生理及病理过程，如血栓形成／溶解，动脉粥样硬化、血管新内膜形成，排卵，组织重建，肿瘤转移等[1,2].PLG是纤溶系统的核心成分及功能分子[3]，因此研究PLG基因转录表达在某些生理及病理过程中的变化具有十分重要的意义。目前，用于基因转录表达的核酸探针主要分3种：DNA，反义RNA以及人工合成寡聚核苷酸[4,5]。反义RNA探针的特点是DNA－RNA、RNA－RNA杂交体的稳定性好，特异性强，灵敏度高，杂交信号强[6]，因而，在国外已得到广泛应用，国内则多采用人工合成的寡聚反义RNA探针…     

反义T0ll样受体4表达质粒对内毒素刺激小鼠巨噬细胞的影响

目的 研究反义Toll样受体4(TLR4)表达质粒对体外内毒素刺激小鼠巨噬细胞的作用。方法反义TLR4表达质粒的构建，及转染人巨噬细胞株RAW 264．7。在不同时间用不同浓度的内毒素刺激转染细胞及对照组细胞。用半定量RT-PCR技术检测TLR4 mRNA的变化，ELISA方法检测TNF-α水平的变化。结果转染细胞的TLR4 mRNA水平低于对照组细胞。在体外用不同浓度内毒素及不同时间刺激的两组细胞NF-α水平低于对照组细胞。结论反义TLR4表达质粒能够下调体外细胞TLR4 mRNA的表达，降低细胞因子NF-α的分泌。     

腺病毒介导反义RNA抑制HIV-1辅助受体CCR5和CXCR4表达

目的抑制细胞表面人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的辅助受体CCR5和CXCR4表达,阻止HIV-1进入靶细胞。方法逆转录聚合酶链反应扩增HIV-1辅助受体基因5'-端cDNA片段,反向插入穿梭质粒中,再与腺病毒基因组骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中同源重组,重组质粒在293细胞中包装、扩增得到含有CCR5、CXCR4反义RNA的重组腺病毒,分别感染U937细胞和MT4细胞,于感染后24、48和72h及10d时用流式细胞仪检测细胞表面相应受体的表达。并用Boyden小室法检测重组腺病毒感染对细胞趋化活性的影响以及用3H掺入法检测对细胞增殖能力的影响。结果成功获得含有CCR5和CXCR4反义RNA的重组腺病毒,其滴度为5×1011PFU/ml和7×1010PFU/ml。重组腺病毒感染24h后流式细胞仪检测显示,U937细胞表面CCR5的表达率分别为:Ad-antiR51.12%,未感染细胞对照82.10%,Ad-senseR580.94%,Ad-control81%。MT4细胞表面CXCR4的表达率分别为:Ad-antiX41.03%,未感染细胞对照42%,Ad-senseX444%,Ad-control39%。48、72h及10d后Ad-antiR5感染的U937细胞表面CCR5表达率分别为:1.02%、1.26%、1.23%;Ad-antiX4感染的MT4细胞表面CXCR4表达率分别为:1.13%、1.17%、1.22%。感染重组腺病毒后,两种细胞的趋化活性及增殖能力均无改变。结论包含有CCR5、CXCR4反义RNA的重组腺病毒可以使细胞表面相应受体表达下降,且重组腺病毒不影响细胞的趋化活性和增殖能力。     

雄激素受体反义RNA对前列腺癌细胞LNCaP生长特性的影响

目的　观察雄激素受体 (Androgenreceptor ,AR)反义RNA对前列腺癌细胞LNCaP生长特性的影响。方法　用含不同浓度雄激素培养基培养前列腺癌细胞LNCaP、LNCaPas AR(基因组DNA中整合了AR反义RNA逆转录病毒载体的LNCaP细胞 )和LNCaPNeo(基因组DNA中整合了空逆转录病毒载体的LNCaP细胞 ) ,用台盘蓝染色细胞计数法及3 H 胸腺嘧啶核苷掺入试验观察体外细胞增殖状况。结果　在 1nmol/L合成雄激素R1881、10nmol/L 17β 雌二醇和 1nmol/L孕酮浓度下 ,与LNCaPNeo和LNCaP相比 ,LNCaPas AR生长显著受抑制 (P <0 0 5 ) ,LNCaPNeo与LNCaP细胞增殖无显著性差异 (P >0 0 5 )。3 H 胸腺嘧啶核苷掺入试验表明LNCaPas AR的DNA合成明显抑制率非常显著地高于对照组LNCaPNeoDNA合成抑制率 (P <0 0 1) ,显微镜下观察见LNCaP和LNCaPNeo生长状态良好 ,而LNCaPas AR细胞稀疏且有较多细胞死亡。结论　雄激素受体反义RNA可以改变LNCaP细胞的雄激素非依赖性特征 ,抑制前列腺癌细胞LNCaP对激素的增殖反应     

反义转化生长因子βI型受体表达质粒对实验性肝纤维化的影响

目的 观察反主转化生长因子βI型受体（TβRI）表达质粒对实验性肝纤维化的影响。方法 运用重组DNA技术构建反义TβRI真核细胞表达质粒,经与糖化多聚赖氨酸偶联后,采用尾静脉注射将其导入猪血清诱导的免疫性大鼠肝纤维化模型体内;通过Northern印迹、RT－PCR、Western印迹及免疫组化等方法检测外源导入质粒在肝组织中的表达,并通过检测血清TGFβ1浓度以及肝组织羟脯氨酸测定,I、Ⅲ型胶原免疫组化与Van Gieson染色观察反义TβRI质粒对大鼠肝纤维化的影响。结果 反义TβRI表达质粒可在肝组织中获得确切表达,其表达可抑制TGFβ1表达（P＜0．05）,降低羟脯氨酸含量（P＜0．01）,减少I、Ⅲ型胶原的沉积（P＜0．01）,并促进肝脏病理形态一定程度的改善（P＜0．01）。结论 反义TβRI表达质粒对肝纤维化有较好的改善作用。     

反义RNA技术及其应用

反义ＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ）是一类能与特异ｍＲＮＡ互补的小分子量、可扩散的ＤＮＡ转录物,它能够从翻译水平、转录水平和核酸复制水平上高度特异地抑制靶基因表达。由于反义ＲＮＡ能够选择性地关闭特定基因,因而它已成为一种极有价值的研究工具,是被科学家们广泛用来同病毒性疾病、恶性肿瘤、寄生虫感染和遗传性疾病等作斗争的最引人注目的新武器,也是科学家们用来调节基因表达和观察基因表达的有效手段和方法。随着天然反义ＲＮＡ的发现,人工构建反义ＲＮＡ来调节基因表达的策略应运而生,并已经取得了较大进展。本文拟…     

具有野生起点的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶表达质粒的构建

目的 构建具有野生起点的丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶表达载体。方法 根据疏水性分析选定待表达的丙型肝炎病毒非结构基因５ｂ区大部分基因。以聚合酶链反应扩增泛素基因,逆转录－聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶基因。限制性酶切长度多态性分析重组克隆,并以ＤＮＡ序列分析方法最终确认。     

Nogo-66受体RNA干扰质粒的构建及其干扰效率鉴定

目的 构建及筛选高效率针对Nogo-66受体(Nogo-66 receptor, NgR) 进行RNA干扰(RNAi)的质粒.方法 RT-PCR克隆NgR,插入表达质粒中,构建NgR-GFP融合蛋白表达质粒.根据NgR序列,设计4对针对NgR mRNA进行RNAi的寡核苷酸.退火后,插入短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)表达质粒中,构建shRNA表达质粒.将NgR-GFP融合蛋白表达质粒与shRNA表达质粒共转染AAV-293细胞.通过对GFP表达量的观察及Western blotting定量检测NgR-GFP融合蛋白表达量,鉴定shRNA表达质粒对NgR的干扰效率.结果 针对NgR进行RNAi的4个序列中,有1个序列的干扰效率大于90%以上.结论 成功构建了1个针对NgR的高效RNAi表达质粒.     

大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒,为进一步探究RNA干扰技术对CaSR在肾脏对钙重吸收调控中的作用提供基础准备。方法(1)CaSR基因慢病毒高表达细胞系构建:PCR克隆CaSR目的基因,双酶切CaSR基因和pcDNA3.1载体,连接酶连接,阳性克隆筛选后测序,将pcDNA3.1-CaSR高表达载体和空载体(对照组)经慢病毒包装后转染NRK-52E细胞,Western blot测定CaSR蛋白表达;(2)CaSR基因的RNA干扰质粒构建:设计3对靶向干扰CaSR基因的RNA引物序列,双酶切干扰引物和pLV[shRNA]-EGFP载体,然后经T4连接酶连接,获得重组干扰质粒pLV[shRNA]-EGFP-CaSR,转化至感受态E.coli DH5,阳性克隆筛选后测序,测定干扰效率。结果(1)测序结果与CaSR基因序列一致;(2)测序结果与设计shRNA引物序列一致;(3)Western blot检测获得慢病毒高表达稳定细胞系的CaSR蛋白;(4)干扰质粒干扰高表达细胞系有效。结论成功构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒。