全血乙型肝炎病毒定量检测方法的初步研究

目的探讨聚合酶链反应(PCR)检测全血中乙型肝炎病毒(HBV)DNA含量及临床应用价值.方法取20μl血清裂解液提取HBV DNA、和取同样量的全血经不同裂解液提取血液中血清及白细胞内总HBV DNA,同时经PCR检测.对78份乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性患者两种取材方法检测HBV DNA含量进行比较.结果检测HBV DNA的最低检测限为1×103拷贝/ml,29份乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和抗乙型肝炎核心抗体(抗HBc)均为阳性患者全血检测HBV DNA阳性率为100%,血清阳性率为100%,P＞0.05;37份HBsAg、抗乙型肝炎e抗体(抗HBe)和抗HBc均为阳性患者全血检测HBV DNA阳性率为97.30%,血清阳性率为48.65%,P＜0.01;12份HBsAg和抗HBc均为阳性患者全血检测HBV DNA阳性率为91.67%,血清阳性率为25%,P＜0.01;20份非乙型肝炎患者血清均为阴性.血清HBVDNA阳性多数是ALT升高患者,其拷贝数均小于全血测定的拷贝数.结论全血检测HBV DNA阳性率高,避免血液中白细胞内HBV漏检,它能准确地反应血液HBV含量,更好地为临床治疗效果作监测.     

乙型肝炎病毒血清DNA定量检测的临床意义

目的　探讨乙型肝炎病毒 (HBV)感染者乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸 (HBV DNA)定量检测的临床意义 ,以及与乙型肝炎血清学e系统 (HBe)标志、丙氨酸转氨酶 (ALT)和天冬氨酸转氨酶 (AST)水平的相关性。方法　采用荧光标记探针定量聚合酶链反应 (PCR)技术、酶联免疫吸附测定法及速率法 ,对 14 0例乙型肝炎病毒感染者乙型肝炎病毒血清DNA含量、血清学标志、ALT和AST进行检测 ;同时动态检测了 2 0例乙肝患者 2 4周拉米夫定治疗期间的血清HBe标记系统和HBV DNA含量变化。结果　e抗原 (HBeAg)阳性组的HBV DNA含量 (M =6 .4 8)显著高于e抗体 (HBeAb)阳性组的HBV DNA含量 (M =4 .2 8) ,差异有统计学意义 (H =2 8.4 8,P <0 .0 0 1) ;不同临床类型乙肝患者的HBV DNA含量检测结果之间的比较 ,差异无统计学意义 (H =2 .181,P >0 .0 5 ) ;在拉米夫定治疗期间 ,血清HBV DNA含量的下降和转阴明显先于血清学标志系统的转换。结论　HBeAg是反映HBV DNA复制的重要指标 ,HBeAg阳性表示乙型肝炎病毒复制活跃 ,但在抗病毒治疗期间 ,血清学标志指标反映HBV复制状态存在局限性 ,HBV DNA定量检测是反映HBV复制和判断药物疗效的最直接、可靠的指标 ;乙型肝炎患者病程的变化、ALT和AST水平与HBV复制是否活跃没有直接相关关系     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒

目的 用荧光定量聚合酶链反应（ＦＱ－ＰＣＲ）方法准确地定量检测血清中乙型肝炎疾病（ＨＢＶ）的数量和免疫指标以指导临床,方法 设计合成了ＨＢＶＦＱ－ＰＣＲ诊断试剂盒,以一种完全闭管式的ＰＣＲ和荧光探针杂交技术相结合产生的实时检测定量ＰＣＲ方法,检测了５３２份临床血清标本,结果 经ＦＱ－ＰＣＲ检测,１５８份ＨＢＶ的ｓ抗原,ｅ抗原,ｃ抗体（ＨＢｓＡｇ,ＨＢｅＡｇ,ＨＢｃＡｂ）都阳性的标本,其血清标本ＨＢ     

乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种采用Lightcycler系统进行HBVDNA实时荧光定量PCR的方法,并探讨其临床应用价值。方法针对HBV基因组S区设计一对扩增引物,并通过预实验严格优化反应体系的组成和条件;将T载体与HBVRT区扩增后纯化的产物进行连接反应,然后转染大肠杆菌（DH5a）,经蓝、白斑筛选后挑取阳性菌落,提取质粒,制备外标准品。结果用于制成外标准品的质粒经1：10的缓冲液倍比稀释,制作标准曲线,线性方程为：Y=-3．344X＋37（r2=0．9999）;通过检测已知浓度并经倍比稀释的HBVDNA,表明其最低检测限为5×10^2 IU／mL;拷贝数介于5×10^2～5×10^8 IU／mI。之间的HBVDNA浓度与ct值具有良好的线性关系。结论外标法实时荧光定量PCR是一种定量相对准确、灵敏度高、特异性强、操作相对简便的方法;该方法可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药;联合该法与血清标志物检测,可更准确评价HBV感染者病情。     

乙型肝炎病毒血清标记物与HBV-DNA定量联合检测的意义

目的探讨乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)与血清免疫标记物的关系。方法采用荧光定量聚合酶链反应检测血清样本中HBV-DNA含量。结果 A组[乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)(+)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)(+)、乙型肝炎病毒核心抗体(抗-HBc)(+)]、B组[HBsAg(+)、乙型肝炎e抗原(抗-HBe)(+)、抗-HBc(+)]、C组[HBsAg(+)、HBeAg(+)]、D组[HBsAg(+)、抗-HBc(+)],4组阳性率分别为94.4%、89.0%、100.0%、58.0%。结论 HBV-DNA与乙型肝炎病毒血清标记物联合检测,对临床HBV感染的诊断、治疗、疗效观察、传染性和复制情况的判断及预后具有重要意义。     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒

目的用荧光定量聚合酶链反应（ＦＱＰＣＲ）方法准确地定量检测血清中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的数量和免疫指标,以指导临床。方法设计合成了ＨＢＶＦＱＰＣＲ诊断试剂盒,以一种完全闭管式的ＰＣＲ和荧光探针杂交技术相结合所产生的实时检测定量ＰＣＲ方法,检测了５３２份临床血清标本。结果经ＦＱＰＣＲ检测,１５８份ＨＢＶ的ｓ抗原、ｅ抗原、ｃ抗体（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂ）都阳性的标本,其血清标本ＨＢＶＤＮＡ也全部阳性,平均ＨＢＶＤＮＡ拷贝数为１．１×１０８／ｍｌ;９８例ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｂ、ＨＢｃＡｂ都阳性的标本,其阳性率为７３％（７１例）,平均拷贝数为８．６×１０５／ｍｌ,而常规ＰＣＲ只有３３％的阳性率;６７例ＨＢｓＡｂ、ＨＢｅＡｂ、ＨＢｃＡｂ都阳性标本的平均拷贝数为２．３×１０５／ｍｌ。结论能够避免ＰＣＲ后处理导致的假阳性污染,并实现准确定量。ＦＱＰＣＲ可以检测ＨＢＶ的真实感染和复制情况,对于乙型肝炎的临床诊断,治疗方案的选择和疗效考察有较大的指导意义。     

实时荧光定量PCR方法检测乙型肝炎病毒基因型

目的建立一种快速准确的实时荧光PCR方法检测乙型肝炎病毒基因型。用此方法对安徽地区乙肝患者进行检测,了解该地区HBV基因型分布情况。方法首先用实时荧光定量PCR方法对150例安徽地区乙肝患者进行HBVDNA定量检测和分型检测,然后对其中载毒量大于5000IU/mL的113例标本和1例1000IU/mL≤载毒量<5000IU/mL进行测序分型检测,验证所建立方法的准确性,了解安徽地区HBV基因型分布情况。结果150例HBV样本中HBVDNA含量<1000IU/mL30例,分型检测结果均为阴性,对载毒量≥5000IU/mL的样本检出率为97.35%(110/113);对1000IU/mL≤载毒量<5000IU/mL的样本检出率为14.29%(1/7);对全部DNA阳性样本的检出率为92.5%(111/120)。HBV分型检测与HBVDNA测序检测的114例样本中,只要是HBVB基因型、C基因型或B/C混合型,乙型肝炎病毒基因分型检测都能检出来(共111例),其中部分样本经分型检测属于B/C混合基因型,测序结果都是混合基因型中占优势的基因型结果,总体符合率为100%。未能被本法检出的样本共3例,3例样本经测序分型均为D型。120例病毒载毒量≥1000IU/mL乙肝患者中B型病例占51.67%(62/120);C型占29.17%(35/120);B/C混合型占11.67%(14/120)。PCR测序检出为D型3例,占2.5%(3/120)。结论应用TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法能快速对我国HBV主要基因型B基因型、C基因型进行检测,结果准确可靠,特异性高。安徽地区的HBV基因型以B型为主,C型次之,亦存在着D型的少数感染病例和B/C的混合感染。     

乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量与乙型肝炎病毒血清免疫学标志相关性的研究

荧光定量聚合酶链反应(FQPCR)的特点是敏感性、特异性好。许多研究证明，乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)定量检测是衡量乙型肝炎传染性的最精确指标．是确定HBV感染不同复制状态的非常有价值的检测手段。有关FQ-PCR法进行HBV-DNA定量与HBV血清免疫学标志相关性研究较少见报道。我们用FQPCR检测了635例患者     

乙型肝炎病毒前S2抗原和脱氧核糖核酸定量检测的相关性研究

乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV DNA）的定量检测,对乙型肝炎的临床诊断和观察治疗效果具有重要意义。近年来国内对前S抗原与乙型肝炎病毒（HBV）复制、HBV感染肝细胞机制等方面研究进展较快,尤其是前S1抗原用于反映HBV复制的报道较多,但对前s2抗原的研究报道相对较少。本研究为进一步了解前S2抗原与HBV DNA之间的关系,进行了此项研究。     

乙型肝炎病毒血清标志物与HBV—DNA定量联合检测的意义

目的探讨乙型肝炎（下称乙肝）病毒DNA（HBV-DNA）与血清免疫标志物的关系。方法荧光定量聚合酶链反应法（FO-PCR）检测血清样本中HBV—DNA含量;酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBV血清标志物。结果A组（大三阳）、B组（小三阳）、C组[乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）阳性]、D组（HBsAg、抗-HBc阳性）阳性率分别为97．3％、57．8％、100％、54．3％,HBeAg阳性组和HBeAg阴性组HBV-DNA病毒载量差异有统计学意义（P〈0．05）。结论HBV—DNA与乙肝血清标志物乙肝两对半（HBV-M）联合检测,能更准确地反映HBV复制情况,更有助于临床疾病的诊治。     

Fast and sensitive quantitative detection of HIV DNA in whole blood leucocytes by SYBR green I real-time PCR assay

The aim of this study was the development of a real-time PCR for HIV DNA quantification in whole blood leucocytes providing an alternative assay to those already described, almost based on the gag gene detection. The technique (pbs-rtPCR assay) is more rapid (the whole assay required less than 5h), easy to perform, omitting both PBMC purification step and data normalization to a housekeeping gene, when compared to previously published assays. Our method is able to detect all group M HIV-1 subtypes in the highly conserved primer-binding site (PBS) region and to avoid the interference by retroviral endogenous sequences in HIV DNA quantification. The sensitivity was 100% for 2 copies even in the presence of high amounts of genomic DNA (1 microg). To monitor the HIV DNA level in all possible clinical conditions, the assay has been validated and compared with a previously developed gag-PCR assay on 73 HIV-1 HAART-treated patients with a plasma HIV-1 RNA range from <50 to >500,000 copies/ml. The 50% of the samples with a viremia below the limit of detection (50 copies/ml) was found to contain HIV DNA between 2 and 10 copies/microg DNA. The pbs-rtPCR offers a significant improvement in the percentage of quantitatively detectable sample (99%) compared with the gag-PCR (42%) suggesting caution in the choice of HIV DNA assay.     

Development and evaluation of real-time polymerase chain reaction assays on whole blood and paraffin-embedded tissues for rapid diagnosis of human brucellosis

This study aimed at developing a real-time polymerase chain reaction (PCR) assay for the rapid diagnosis of human brucellosis on clinical specimens. Three assays with hybridization probe detection on the LightCycler instrument were developed and compared targeting the 16S-23S internal transcribed spacer region (ITS) and the genes encoding for omp25 and omp31. All assays showed 100% analytical sensitivity and 100% specificity when tested on 28 consecutive clinical isolates of Brucella sp. and 19 clinical isolates of common Gram-negative and Gram-positive bacterial pathogens, respectively. The ITS assay was the most sensitive with a limit of detection of 2 genome equivalents per PCR reaction. This assay was then clinically validated prospectively with 354 samples (351 whole blood samples and 3 paraffin-embedded tissues) collected from 340 patients, 24 samples from patients with active brucellosis including 2 relapsing cases, 31 with treated brucellosis, and 299 seronegative patients where brucellosis was initially suspected. The clinical sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values of the ITS assay were 66.7%, 99.7%, 94.1%, and 97.6%, compared with culture at 77%, 100%, 100%, and 97.3%, respectively. The difference in sensitivity between culture and ITS-PCR was not statistically significant (P = 0.71). Both relapsing cases were PCR positive. Treated patients were PCR negative. All 3 assays were positive on tissue samples, but the omp25 and omp31 assays did not detect Brucella sp. DNA in blood samples. Because omp31 is not present in Brucella abortus, these data indicate that the 28 tested isolates are most likely Brucella melitensis. ITS-PCR is rapid and could augment the clinical laboratory diagnosis of human brucellosis.     

产妇血浆和乳汁中HBV DNA定量检测研究

目的 进一步了解乙型肝炎产妇的母乳中HBV DNA含量及其传染性，更好地指导母乳喂养。方法 利用荧光实时定量PCR检测技术，对66例乙肝血清学检测阳性的产妇进行血浆及乳汁中HBV DNA的定量检测。结果 66例产妇血浆和乳汁中HBV DNA的检出率分别为66．7％（44／66）和53．O％（35／66），其HBV DNA含量的对数值具有良好的相关性（r=0．794，n=66，P〈0．01），HBeAg（＋）与HBeAb（＋）两组间比较血浆及乳汗HBV DNA的含量，两者存在统计学差异（P〈0．01）。HBeAg（＋）组含量高于HBeAb（＋）组。结论 乳汁与血浆中HBV DNA含量具有较好的相关性，血浆中HBV DNA高拷贝的产妇，最好不要进行母乳喂养。产妇血浆中HBeAg与乳汁及血浆中HBV DNA含量都具有明显关系，它的存在提示血浆及乳汁中的HBV DNA含量较高。     

自动提取大样本全血基因组DNA方法的建立

目的建立从大样本全血中自动提取基因组DNA的方法,并评价提取DNA的质量和产量。方法基因组DNA使用MiniPrep75-Ⅱ自动工作站提取;DNA样本的纯度和含量用紫外分光光度法测定;DNA的完整性用琼脂糖电泳法测定。结果从100μl全血中平均可提取到(7.33±2.58)μg基因组DNA;DNA样本的纯度平均为1.647±0.135(A260/A280);琼脂糖电泳法测得DNA的分子量约为21kb。结论本方法可以快速从大样本全血中自动提取较高质量的基因组DNA,所得DNA适用于下游的分子生物学实验。     

Comparison of 2 highly automated nucleic acid extraction systems for quantitation of human cytomegalovirus in whole blood

The aim of the study was to evaluate analytical performances of the COBAS Ampliprep and to compare extraction from whole blood on the COBAS Ampliprep and on the MagNA Pure instruments (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) for quantifying human cytomegalovirus (HCMV) DNA with real-time polymerase chain reaction (PCR). The limit of detection using the COBAS Ampliprep was 10 copies/run (150 copies/mL, i.e., 2.20 log(10) copies/mL). Quantitation of HCMV-DNA was linear from 3.0 to 6.0 log(10) copies/mL. The intra-assay variations ranged from 11.1 % to 0.4 % and interassay variation was 11.3 %. A total of 107 samples were tested using both extraction systems. Only 3 samples gave discrepant results. Correlation between HCMV virus loads was good (r = 0.73) (P < 0.001). Mean virus load was lower (-0.49 log(10) copies/mL) with COBAS Ampliprep than with MagNA Pure extraction system. Both MagNA Pure and COBAS Ampliprep provide reliable and high-throughput platforms for real-time PCR HCMV quantitation of DNA extracted from whole blood.     

裂解液加热煮沸法在血清HBV DNA抽提中的应用

目的建立裂解液加热煮沸法抽提血液HBV DNA的方法。方法选取浓度分别为10^6、10^5、10^4、10^3copies/ml的HBV DNA阳性血清,采用5种方法抽提HBV DNA,并用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测抽提产物。结果在HBV DNA浓度为10^6、10^5、10^4copies/ml时5种抽提法（异硫氰酸胍加热煮沸/盐酸胍加热煮沸/kit/SDS加热煮沸/chelex-100加热煮沸）均能得到阳性结果,而在HBV DNA为低浓度10^3copies/ml时,只有异硫氰酸胍加热煮沸/盐酸胍加热煮沸/chelex-100加热煮沸能得到阳性结果。结论chelex-100裂解液加热煮沸抽提HBV DNA操作简便、省时、经济,为血液标本HBV基因检测在临床上的大规模应用奠定基础。     

HBV DNA含量与前S1蛋白抗原和HBV血清学标志物的相关性分析

目的 探讨HBV DNA检测、前S1蛋白抗原与乙型肝炎血清标志物的相关性.方法 采用PCR法检测HBVDNA;ELISA法检测前S1蛋白抗原及乙型肝炎血清学标志物:HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb.结果 644例HBV DNA≥1.0×103Copies/m乙肝患者血清中A组:HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性占50.47%(325/644);B组:HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性占38.82%(250/644);C组:HBsAg、HbcAb阳性占10.71%(69/644).Pre-S1阳性532例.占82.6%.结论 Pre-S1抗原与HBVDNA、HBeAg有较好的一致性和互补性.可作为乙肝病毒存在和复制的观察指标,对病情的预后及疗效判断具有指导意义.     

HBV前S1抗原与HBV DNA联合检测的临床意义

目的探讨乙型肝炎病毒前S1抗原(HBV pre-Sl)、HBV DNA与HBV表面标志物(HBV-M)的关系。方法从临床乙型肝炎标本中筛出HBsAg阳性病例329例,采用ELISA法检测乙肝血清标志物和前S1抗原,荧光定量PCR法检测标本HBV DNA。结果血清HBeAg抗原阳性组,HBV DNA和pre-Sl的阳性率分别为97.2%和90.0%,而HBeAg抗原阴性组的HBV DNA与pre-Sl阳性率分别为42.9%和37.0%,HBeAg阳性患者血清的HBV DNA与pre-Sl的阳性检出率明显高于HBeAg阴性患者。结论 HBV pre-Sl和HBV DNA在各组中阳性检出率有较高的一致性,pre-Sl在一定程度上可替代HBV DNA。pre-Sl与乙肝血清标志物联合检测能为乙肝患者病毒复制、肝功能损伤提供有价值的实验室依据,同时有助于慢性乙肝患者疗效考核和预后判断。     

应用EP09-C对两种荧光定量PCR仪测定HBV DNA的可比性分析

目的 对罗氏cobas_^? z480和ABI 7500 2种荧光定量PCR分析仪测定乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的结果进行比对和偏移评估。方法 根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI) EP09-C方案,采用罗氏cobas_^? z480(参比系统 X)和ABI 7500(待评系统 Y)2种荧光定量PCR分析仪分别单次测定40份患者血清样本HBV DNA浓度,极端学生化偏差(extreme studentized deviate, ESD)法对结果进行离群值检验,绘制散点图和偏差图,拟合回归方程,计算各参数的95%置信区间(confidence interval, CI)和医学决定水平处的偏移,以≤±0.4(LOG值)为可接受标准。结果 通过ESD法检验发现2个离群值,剔除离群值并补充2份相近浓度样本数据后再分析未发现离群值。根据偏差图特征分析差值具有恒定SD变化,绘制差值频数柱状图并经单样本K-S检验差值服从正态分布,采用均值初步估算偏移为0.086,小于可接受标准。进一步经OLR、WLS、Deming、Passing-Baklok(P-B)模型进行回归分析,并将医学决定水平分别代入回归方程中计算的偏移均小于可接受标准。结论 罗氏cobas_^? z480和ABI 7500 2种荧光定量PCR分析仪测定HBV DNA的结果具有可比性。