B7特异性siRNA对树突状细胞功能的影响

目的探讨体外合成的B7特异性小干扰RNA（siRNA）对树突状细胞（DC）功能的影响。方法设计并合成B7特异性siRNA,在脂质体的介导下转染树突状细胞,转染后72h收集细胞,用蛋白印迹法检测B7-1、B7-2蛋白的表达,用ELISPOT检测DC与淋巴细胞共培养后T细胞分泌IFN-γ,用MTT法检测混合淋巴细胞增殖反应和CTL特异性杀伤率。结果Western Blot结果显示转染72h后,siRNA1对B7-1蛋白表达的抑制率为（80．9±5．23）％;siRNA2对B7-2蛋白表达的抑制率为（74．7±4．63）％。经转染B7-1、B7-2分子特异性siRNA的DC激活后,T淋巴细胞分泌IFN-γ分别为（84．6±23．1）10^3／L和（76．7±19．7）10．3U／L明显低于对照组（204．5±46．2）10^3U／L;各组DC刺激淋巴细胞增殖指数（PI）分别为1．73±0．32和1．53士0．25,也低于对照组4．23±0．74。CTL杀伤实验结果表明：对照组的特异性杀伤率为（76．4±7．6）％,siRNA1和siRNA2组的特异性杀伤率分别为（14．4±3。6）％和（18．6士4．7）％,低于对照组。结论B7特异性siRNA可明显抑制树突细胞B7基因的表达,并可降低DC激活T淋巴细胞增殖和CTL的细胞毒性,为进一步研究siRNA诱导免疫耐受和治疗自身免疫性疾病提供了新思路和方法。     

RNA干扰抑制树突状细胞CD80和CD86基因表达研究

目的探讨体外合成的小干扰RNA（siRNA）对人树突状细胞（DC）共刺激分子CD80和CD86基因表达的影响。方法设计并合成了3条siRNA（siRNA1、siRNA2和siRNAc）,在脂质体的介导下转染树突状细胞,于转染后24、48、72h收集细胞,用半定量RT-PCR检测CD80和CD86 mRNA的变化,用蛋白印迹检测CD80、CD86蛋白的表达。结果转染24、48、72h后,DC CD80 mRNA均有明显减少（P〈0.01）,抑制率分别为（50.0±3.63）%、（66.8±4.12）%和（76.6±4.87）%;CD86 mRNA均有显著降低（P〈0.01）,抑制率分别为（53.0±3.70）%（、60.5±3.92）%和（73.4±4.46）%,而单纯脂质转染和siRNAc转染对CD80、CD86 mRNA表达均无影响（P〉0.05）。Western Blot结果显示转染48、72h后,siRNA1对CD80蛋白表达的抑制率为（67.3±4.80）%和（80.9±5.23）%;siRNA2后对CD86蛋白表达的抑制率为（60.7±4.15）%和（74.7±4.63）%。结论 siRNA可特异抑制树突细胞B7基因的转录和表达,为进一步研究siRNA诱导移植免疫耐受提供了理论和实验基础,为诱导器官移植免疫耐受提供了新思路和途径。     

B7-H1分子在混合皮肤移植中自体角朊细胞诱导的抑制作用

目的探讨B7-H1在混合皮肤移植中自体角朊细胞诱导的局部免疫耐受中的作用。方法在加入与不加入自体角朊细胞的实验系统中，利用混合表皮淋巴细胞培养（MELC）体外模拟系统，检测角朊细胞表达B7-H1的情况，并观察抗B7-H1和PD-1单抗对自体角朊细胞诱导的免疫抑制的影响情况。结果在引入自体角朊细胞的MELC体系中，刚分离的角朊细胞并不表达B7-H1，但在4h开始有微弱的表达，而〉8h就有较强的表达；而未引入自体角阮细胞的MELC体系中，则始终未检测到B7-H1的表达。而且自体角朊细胞对自体淋巴细胞对异体表皮细胞的同种异体增殖反应的抑制作用能被抗B7-H1和PD-1的单抗阻断。结论混合皮肤移植中，自体角朊细胞可能是通过B7-H1提供共刺激信号，激活Th2亚群，遏止Th1亚群，从而抑制后者介导的细胞免疫。     

RNA干扰沉默MKK7对SH-SY5Y细胞凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰沉默丝裂原激活的蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MKK7)基因对SH-SY5Y细胞凋亡的影响?方法:设计并合成针对MKK7的小干扰RNA (small interference RNA,siRNA)3条(MKK7siRNA-1?MKK7siRNA-2?MKK7siRNA-3)及与MKK7基因无同源性的带有红色荧光的阴性对照siRNA(negative control siRNA),在lipofectamine 2000介导下转染SH-SY5Y细胞,荧光显微镜下观察转染效果,RT-PCR观察MKK7 mRNA表达及Western blot 检测MKK7蛋白的表达,进而筛选出转染效果好的MKK7siRNA,CCK-8检测各组细胞活力,Hochest 33258检测各组细胞凋亡染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测p-JNK?凋亡蛋白cleaved caspase-3的变化?结果:① MKK7siRNA-3组的MKK7 mRNA表达最低,MKK7蛋白表达最低;②与空白对照组(control group)比较,MKK7siRNA-3组的细胞活力无统计学差异,p-JNK?cleaved caspase-3水平降低,凋亡率降低?结论:RNA干扰沉默MKK7可通过下调JNK磷酸化进而抑制SH-SY5Y细胞的凋亡?     

RNA干扰hTERT基因对人乳腺癌细胞株MCF-7周期及凋亡影响的研究

目的观察载体介导的RNA干扰技术能否有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的hTERT的表达及其对细胞周期及凋亡的影响。方法构建2个针对hTERT基因表达短发夹状siRNA的真核表达载体(pshRNA-hTERT)并转染人乳腺癌细胞株MCF-7,通过RT-PCR检测该基因mRNA,Western blot蛋白质检测,端粒酶活性检测,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡等方法检测RNAi效果,从中筛选出基因沉默效果好的靶位点。结果转染乳腺癌细胞后,pshRNA-hTERT1,2质粒均能抑制hTERT基因表达,mRNA表达分别下调了54.6%,55.2%;蛋白表达分别下调46.6%,47.8%。端粒酶活性均明显下降。对乳腺癌细胞周期中S期细胞明显减少,G1/G0期细胞显著增加。结论 RNAi在体外明显抑制乳腺癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

RNA干扰对MCF-7细胞eIF4E表达的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAi)对人乳癌MCF-7细胞真核起始因子4E(eIF4E)表达的影响.方法:针对eIF4E基因的寡核苷酸序列设计并体外转录合成小干扰RNA(siRNA),分别以100、150和200 mg/L转染MCF-7细胞24、48及72 h后,采用免疫细胞化学及原位杂交方法检测MCF-7细胞中eIF4E...     

Nucleostemin 特异性RNA干扰对肿瘤细胞增殖能力的影响

目的：检测肿瘤细胞Nucleostemin(NS)的表达，研究NS特异性RNA干扰对Hela细胞体内外增殖的影响。方法：提取6种肿瘤细胞总RNA，用RT-PCR和Northern blot方法检测NS的表达。用NS特异性siRNA表达载体转染Hela细胞，观察转染的Hela细胞(简称NS-SiRNA-Hela细胞)体内外增殖的变化。结果：6种肿瘤细胞中NS显高表达。体外培养的NS-siRNA-Hela细胞中NS表达显降低，Gn／G，期细胞百分率显升高。体内致瘤实验显示，NS-siRNA-Hela细胞在裸鼠体内增殖显降低。结论：NS在肿瘤细胞中高表达具有普遍性。NS特异性RNA干扰使Hela细胞进入S期受阻，并可明显降低Hela细胞体内外的增殖能力。     

乙酰肝素酶的RNA干扰对B16黑素瘤细胞实验性肝转移的影响

目的 研究用RNA干扰的方法抑制乙酰肝素酶的表达及其对B16黑色素瘤细胞实验性肝脏转移的影响.方法 将HPA siRNA转入B16黑色素瘤细胞,抑制HPA的表达,并测定该细胞的增殖能力及黑色素生成能力;还将RNA干扰的B16黑色素瘤细胞注入小鼠脾脏测定其实验性肝转移的能力,并与对照组比较.结果 将HPA siRNA转入B16黑色素瘤细胞,行RNA干扰后获得HPA较低表达的细胞(表达水平为对照组的20％,P＜0.01),而黑色素生成及细胞增殖能力不受影响(P＞0.05).将该细胞注入小鼠脾脏后,计数实验性肝转移结节的数目,实验组较对照组肝脏转移结节明显减少(P＜0.01).结论 B16黑色素瘤细胞经RNA干扰后,随着HPA表达的降低,细胞转移能力下降.RNA干扰抑制HPA的表达,是一种理想的抗肿瘤治疗方法.     

混合皮肤移植中自体角朊细胞转染B7-1后诱导抑制功能的改变

目的 分析混合皮肤移植中自体角朊细胞转染B7-1基因后功能的改变，并探讨传统共刺激分子和MHC Ⅱ类分子等在自体角朊细胞诱导的局部免疫耐受中的作用。方法 利用建立的MELC体外模拟系统，对自体角朊细胞进行B7-1基因的转染，观察转染前后自体角朊细胞诱导抑制能力的变化，同时通过抗CTLA-4单抗及HLA Ⅱ类分子的封闭实验，观察这些分子在自体皮岛抑制效应中的作用。结果 自体角朊细胞转染B7-1基因后，诱导局部免疫抑制的能力消失，如果加入抗B7-1单抗阻断B7-1的作用后，其诱导抑制的能力又恢复；抗CTLA-4单抗不能阻断自体角朊细胞在实验体系中的抑制作用；用单抗所作的封闭实验结果表明。抗HLA-DR单抗封闭组对自体角朊细胞对MELR抑制诱导的影响最小（P〉0．05），抗DQ单抗则可以对MELR的抑制得到最大幅度的回复，而抗DP单抗也可以使体系中cpm值有一定的回升。结论 混合皮肤移植中，自体角朊细胞之所以可以诱导局部免疫耐受，是通过B7-1以外的其他共刺激信号激活Th2亚群、进而遏制Th1亚群来诱发抑制的，而且这种抑制与CTLA-4的负向调节无关。并具MHC限制性。     

Cdc42小干扰RNA对乳腺癌MCF7细胞增殖的影响

目的观察细胞周期分裂蛋白Cell division cycle 42(Cdc42)小干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌细胞增殖的影响。方法设计并合成靶向Cdc42编码区的siRNA,将其瞬时转染至MCF7细胞中。48 h后应用RT-PCR和Western-blot分别检测细胞转染siRNA后Cdc42 mRNA及蛋白的表达。CCK8及饱和密度实验检测Cdc42小干扰RNA对MCF7细胞增殖能力的影响。结果 RT-PCR和Western-blot检测显示Cdc42-siRNA能显著下调MCF7细胞中Cdc42 mRNA及其蛋白表达水平。Cdc42-siRNA转染后MCF7细胞增殖能力受到明显抑制。结论 Cdc42小干扰RNA可以有效抑制MCF7细胞的增殖能力,提示Cdc42可能成为抑制乳腺癌MCF7细胞增殖的新靶点。     

X射线对小鼠腹腔巨噬细胞表达B7-1和B7-2的影响

目的 :观察 X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 1和 B7- 2的影响。方法 :采用免疫组织化学法 ( ABC法 )。结果 :小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 2达到高峰的时间早于 B7- 1,而且 B7- 2表达幅度也高于 B7- 1。剂量 -效应关系的研究表明 ,B7- 1和 B7- 2的表达均在 0 .0 75Gy剂量点出现峰值 ,而在较大剂量照射时也出现一个峰值。但在不同分度分析结果中发现 ,低剂量 X射线照射组的高密度细胞百分数比较大剂量组多。结论 :B7分子的表达上调可能是参与低剂量电离辐射免疫增强效应的重要因素。     

排斥反应时移植肾组织B7-2的表达

【目的】检测排斥反应时移植肾组织内B7-2的表达情况。【方法】对同种异体移植肾患者行经皮肾穿刺活检获取术前（供肾修整结束时）、术后7 d、1、6个月、1年或以上的植肾组织,用免疫组化方法检测活检组织中B7-2的表达情况。【结果】53例肾移植受体共行肾活检198次,B7-2阳性表达主要见于上皮细胞和炎性浸润细胞。移植后7 d阳性表达率显著上升,1个月后下降至术前水平;急性排斥反应时阳性表达率明显上升,抗排斥治疗1周后下降至术前水平;急性排斥反应组的阳性表达率显著高于非急性排斥反应组。系膜细胞,肾小管上皮细胞和血管内皮细胞表达均阴性。【结论】B7-2分子表达与排斥反应的发生密切相关。     

排斥反应时移植肾组织内共刺激分子B7-2和CD40的表达研究

目的检测排斥反应时移植肾组织内B7-2和CD40的表达情况。方法对同种异体移植肾患者行经皮肾穿刺活检术后(供肾修整结束时)、术后7d、1个月、6个月、1年或以上,用免疫组化方法检测活检组织中B7-2和CD40的表达情况。结果53例肾移植受体共行肾活检198次。B7-2阳性表达主要见于上皮细胞和炎性浸润细胞。移植后7d阳性表达率显著上升,1个月后下降至术前水平;急性排斥反应(AR)时阳性表达率明显上升,抗排斥治疗1周后下降至术前水平;AR组的阳性表达率显著高于N-AR(非急性排斥反应)组。系膜细胞,肾小管上皮细胞和血管内皮细胞表达均阴性。CD40移植前表达阴性;移植后肾功能稳定期的穿刺标本中偶见弱阳性表达;AR时CD40表达增加,内皮细胞、上皮细胞和炎性浸润细胞的阳性率分别为21%、39%和60%,抗排斥治疗后CD40表达转阴性;N-AR组中CD40阳性表达率显著低于AR组。结论共刺激分子B7-2和CD40的表达与急性排斥反应的发生密切相关。     

RNA干扰HDAC7表达在肝细胞癌中的作用

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶7（histone deacetylase 7,HDAC7）在肝细胞癌发生发展中的作用。 方法：体外构建pSUPER-HDAC7反转录病毒干扰质粒,分为pSUPERHDAC7RNAi+组（有效干扰）、pSUPERHDAC7RNAi-组（无效干扰）和对照组（pSUPER空载体）,转染人肝癌细胞HepG2和人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cell,HMEC-1）。Western免疫印迹检测HDAC7,p21,细胞周期素E(cyclin E)、基质金属蛋白酶10（matrix metalloproteinases 10, MMP10）、低氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α）蛋白表达,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT］、流式细胞术、体内裸鼠皮下种植、体外血管内皮细胞二维成管方法检测HDAC7表达的作用。结果：与pSUPERHDAC7RNAi-组和对照组相比,pSUPERHDAC7RNAi+组细胞HDAC7蛋白表达抑制,细胞生长抑制率和凋亡率明显增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）;且HIF-1α和p21蛋白表达上调,cyclin E蛋白和MMP10表达下调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：HDAC7蛋白通过上调p21和HIF-1α蛋白表达、下调cyclin E及MMP10蛋白表达,介导肝癌细胞凋亡和血管成管。     

小鼠B7-1和B7-2基因转染EL4细胞瘤苗抗肿瘤免疫作用的比较研究

目的：研究冠状动脉分流（CABG）术后冠状动脉竞争血流对左乳房内动脉（LIMA）桥血流中内皮素（ET）、一氧化氮（NO）含量的影响，探讨动脉桥血管早期衰坏的分子机制。方法：建立猪CABG术后桥血管竞争血流动物模型，利用血流闭塞器造成冠状动脉不同程度狭窄，测量桥血管血流量及方向变化，并采用放射免疫分析法及硝酸还原酶法分别检测LIMA桥血流中ET、NO含量并进行对比分析。结果：冠状动脉左前降支（LAD）近端狭窄程度越轻，LIMA桥血流量越少；LAD近端未完全闭塞时，LIMA桥均出现双向血流。CABG术后LIMA桥血流ET含量明显高于移植前(P＜0.05)，NO含量明显低于移植前(P＜0.05)。LAD近端冠脉竞争血流越大，LIMA桥血流NO含量越低。LIMA桥血流NO含量与LIMA桥血流量呈正相关（r=0.957,P＜0.05）。LAD近端30％狭窄时，NO含量明显低于LAD近端90％狭窄及全部闭塞时(P＜0.05)，LAD近端50％狭窄时，NO含量明显低于LAD近端全部闭塞时(P＜0.05)。LIMA桥血流ET含量有随LAD近端冠脉竞争血流增加而升高的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：来自未完全闭塞冠状动脉的竞争血流可引起LIMA桥血流量下降，产生双向血流，并导致桥血流中NO含量显著下降。     

B7-H4在大鼠创伤性关节炎模型关节腔中的表达情况

目的：观察B7-H4在大鼠创伤性关节炎模型中的表达及变化情况,探讨其在创伤性关节炎中的作用及可能的机制。方法：将52只健康雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组26只。实验组行右后膝关节内侧副韧带和内侧半月板切除术;对照组行单侧膝关节切开术作为假手术对照。两组分别在术后24 h、48 h、1周、2周、4周5个时间点抽取关节液,采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定关节液中B7-H4含量表达。结果：对照组术后各时间点B7-H4含量表达均较低,各时间点B7-H4含量差异无统计学意义（P〉0.05）;实验组术后各时间点B7-H4含量均高于对照组（均P〈0.05）;实验组术后48 h膝关节液中B7-H4含量较其他时间点明显增高（P〈0.05）;术后2周B7-H4表达较术后48 h明显降低（P〈0.05）;术后48 h、2周、4周3个时间点的B7-H4表达呈降低趋势。结论：B7-H4在创伤急性期的关节中表达增高,其在创伤愈合后期表达逐渐降低,同时对自身免疫反应抑制减弱与创伤性关节炎的发生、发展密切相关。     

共刺激分子配体B7-DC转基因小鼠模型的建立

目的建立共刺激分子配体B7-DC转基因小鼠模型。方法利用RT-PCR方法从来自小鼠胸腺的mRNA中扩增出B7-DC cDNA,继而将B7-DC基因插入到真核表达载体PEF6/V5-His中得到含B7-DC和V5-His融合蛋白的PEF6-B7-DC/V5-His。注射外源基因PEF6-B7-DC/V5-His至FVB小鼠原核,注射胚胎移植到同期发情的假孕受体,所生仔鼠经PCR和Southem-blot检测获得阳性转基因小鼠。结果共注射移植胚胎87枚,出生小鼠39只,检测出阳性小鼠3只,并稳定遗传至F2代。结论成功建立了B7-DC转基因小鼠模型。     

B7分子在DSS诱导的小鼠结肠炎中的作用研究

目的 研究B7分子在DSS诱导的小鼠结肠炎症中的作用。方法 用免疫组化法检测急、慢性DSS小鼠结肠炎模型中结肠粘膜B7-1和B7-2的表达。结果 结肠组织中B7-1、B7-2均为胞浆阳性。急性、慢性模型组肠粘膜B7-1 细胞百分比均高于对照组，而急性组与慢性组之间无显著差异。急性组肠粘膜B7-2 细胞百分率与对照组无显著差异，而慢性组肠粘膜B7-2 细胞百分比高于急性组和对照组。结论 B7-1、B7-2异常表达可能均与DSS模型继发的肠粘膜免疫紊乱和肠组织病损有关。