慢病毒介导2型阿诺碱受体RNA干扰有效靶序列的筛选

目的:筛选慢病毒介导2型阿诺碱受体(RyR-2)RNA干扰的有效靶序列。方法:设计5条RyR-2干扰候选靶序列,将靶序列构建到慢病毒载体中,在HEK-293T细胞中包装成慢病毒,感染心肌细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定靶序列干扰RyR-2的效果。结果:通过数据库获得5条RyR-2干扰靶序列,成功构建shRyR-2慢病毒载体,获得高效感染心肌细胞的慢病毒;感染心肌细胞后实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹显示shRyR-2_1007具有较高的干扰效果(P0.05)。结论:成功筛选出高效的RyR-2RNA干扰靶序列。     

PC4基因RNAi慢病毒载体的构建及有效靶序列鉴定

目的：筛选慢病毒介导PC4 RNA干扰的有效靶序列。方法：通过数据库设计3条PC4干扰候选靶序列,将靶序列构建到慢病毒载体中,转入HEK-293T细胞后,感染H9C2心肌细胞。通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定靶序列干扰PC4的效果。结果：成功构建shPC4慢病毒载体,获得高效感染心肌细胞的慢病毒;感染心肌细胞后实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹显示,shPC4-1具有较高的干扰效果（P<0.05）。结论：成功筛选出高效的PC4 RNAi靶序列。     

Rac1基NRNAi慢病毒载体的构建与鉴定

背景：Rac1是通过信号转导来调节癌细胞的侵袭、增殖,它在各种肿瘤中都有表达。目的：构建RAC1基因RNA干扰慢病毒载体,并检测其干扰效率。方法：应用Western blot检测Rac1基因在舌癌细胞中的表达。针对筛选确定的Rac1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pMagic4.1载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定后将质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,采用Real-Time PCR筛靶,将筛靶成功的质粒进行慢病毒包装,再感染Tca8113细胞。荧光定量PCR和Western blot检测鉴定Rac1基因表达的干扰效果以确定其生物活性。结果与结论：成功构建了RAC1干扰载体,Western blot检测显著抑制Rac1蛋白表达,经Real-time PCR检测pLVT447的抑制率达70%。成功的构建了Rac1基因RNAi慢病毒载体,为RNAi用于靶向Rac1的基因治疗舌癌（Tca8113）提供了有效的siRNA靶序列。     

Rac1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

背景:Rac1是通过信号转导来调节癌细胞的侵袭、增殖,它在各种肿瘤中都有表达。目的:构建RAC1基因RNA干扰慢病毒载体,并检测其干扰效率。方法:应用Western blot检测Rac1基因在舌癌细胞中的表达。针对筛选确定的Rac1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pMagic4.1载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定后将质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,采用Real-TimePCR筛靶,将筛靶成功的质粒进行慢病毒包装,再感染Tca8113细胞。荧光定量PCR和Western blot检测鉴定Rac1基因表达的干扰效果以确定其生物活性。结果与结论:成功构建了RAC1干扰载体,Western blot检测显著抑制Rac1蛋白表达,经Real-time PCR检测pLVT447的抑制率达70%。成功的构建了Rac1基因RNAi慢病毒载体,为RNAi用于靶向Rac1的基因治疗舌癌(Tca8113)提供了有效的siRNA靶序列。     

靶向Egr-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建靶向人早期生长反应因子(early growth response-1,Egr-1)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体。方法针对Egr-1基因设计并合成1条Egr-1过表达序列和4条干扰序列,过表达序列与双酶切Ubi-MCS-3FLAG载体连接,干扰序列与双酶切hU6-MCS-CMV-EGFP连接,DNA测序鉴定重组载体。共转染人脐静脉血管内皮细胞后(OE-RNAi-1,OE-RNAi-2,OE-RNAi-3,OE-RNAi-4)Western blot检测Egr-1蛋白表达,筛选有效干扰靶点,实时定量荧光PCR检测Egr-1mRNA,验证干扰效果。结果测序表明Egr-1过表达及RNAi慢病毒载体构建成功;Western blot结果显示,OE-RNAi-4组Egr-1蛋白表达抑制率最高(P<0.05);实时荧光定量PCR验证结果显示,OE-RNAi-4组Egr-1mRNA表达受到明显抑制(P<0.05)。结论本研究成功构建了靶向Egr-1基因RNAi慢病毒载体,为进一步研究Egr-1在静脉桥血管再狭窄中早期内皮功能失调作用机制及基因治疗提供了实验依据。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体。方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

解偶联蛋白-2 RNA干扰慢病毒载体的构建

目的:构建解偶联蛋白-2(UCP-2)基因的RNA干扰慢病毒载体.方法:根据RNA干扰序列设计原则,针对UCP-2mRNA(NM_011671)设计3个RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的DNA双链,酶切后连入慢病毒转移质粒pGCL-GFP中.连接产物转化感受态细胞,所获克隆行PCR鉴定和序列测定.构建成功的RNA干扰质粒与UCP-2表达质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观测转染效果,Western blot检测UCP-2蛋白表达,筛选出干扰效果最好RNA干扰质粒.将该质粒与两种辅助包装原件载体质粒pHelper 1.0(gag/pol元件)载体,Helper 2.0(VSVG元件)共转染293T细胞包装成慢病毒并检测滴度.结果:PCR和测序结果显示针对3个靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过Western blot检测获得最优干扰靶点,并成功包装成滴度为5×108TU/ml的慢病毒.结论:成功构建可供感染的解偶联蛋白-2 RNA干扰慢病毒载体,为后续靶向抑制该基因表达以提高脂肪肝移植成功率的研究莫定物质基础.     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖（NG2）在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成OligoDNA,退火形成双链DNA,与HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper1.0载体、pHelper2.0载体通过lipofectamineTM2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96h提取细胞总蛋白,采用Westernblot检测NG2的表达。结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011TU/L。Westernblot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%（P〈0.05）。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景:慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率.目的:构建并鉴定脯氨酰羟化酶 RNA 干扰慢病毒载体.方法:针对脯氨酰羟化酶2 基因序列设计RNA 干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGCSIL-GFP 连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA 干扰慢病毒表达载体,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定.结果与结论:PCR 和DNA 测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA 慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP 载体.说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA 干扰慢病毒载体.     

小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7）中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景:最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。目的:构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。方法:选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成OligoDNA,退火形成双链DNA,与HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper1.0载体、pHelper2.0载体通过lipofectamineTM2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96h提取细胞总蛋白,采用Westernblot检测NG2的表达。结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011TU/L。Westernblot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P<0.05)。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

核糖体结合蛋白1干扰慢病毒载体的构建及其对人肝癌细胞的干扰效应

目的构建核糖体结合蛋白1(RPN1)的干扰慢病毒载体,建立下调RPN1表达的肝癌细胞系。方法运用分子克隆针对RPN1基因构建干扰慢病毒载体,通过与病毒包装辅助质粒共感染293T细胞包装病毒,高速离心浓缩病毒,免疫荧光方式测定病毒滴度,感染Huh7.5.1肝癌细胞系,实时荧光定量PCR(RTqPCR)测定病毒干扰效果。结果成功构建并包装RPN1RNA干扰慢病毒,病毒滴度为2×10~9 TU/mL,感染Huh7.5.1细胞后阳性率大于90.0%。相对于阴性对照,RPN1RNA干扰慢病毒组RPN1基因表达敲减效率达到92.4%(P0.05)。结论成功构建并包装了RPN1干扰慢病毒,建立下调RPN1表达的人肝癌细胞株。     

大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体的构建与测序

[目的]构建测序大鼠视黄醇结合蛋白-1(CRBP-1)基因短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体.[方法]针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1基因RNA干扰(RNAi)有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒裁体,命名为Lv-shCRBP-1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.[结果]PCR鉴定与DNA测序证实合成的Lv-shCRBP-1寡核苷酸链插入正确.[结论]成功构建大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体.     

慢病毒感染稳定敲减eIF4E基因的鼻咽癌CNE2细胞系的建立

目的构建稳定干扰真核起始因子4E(eIF4E)基因的鼻咽癌CNE2细胞系。方法设计针对eIF4E基因mRNA序列的RNA干扰序列,以慢病毒载体pGC-LV为基础构建感染体系。慢病毒感染CNE2细胞后,经嘌呤霉素压力筛选稳定敲减eIF4E基因的CNE2细胞株。采用定量聚合酶链反应和免疫印迹法检测eIF4EmRNA和蛋白的表达水平;采用细胞增殖和迁徙实验验证eIF4E敲减对CNE2细胞的影响。结果成功构建并筛选获得带有eIF4E特异性短发夹RNA的慢病毒颗粒;将慢病毒颗粒转入CNE2细胞,经抗菌药物压力筛选获得稳定敲减eIF4E基因的CNE2细胞(CNE2siEp)及阴性对照细胞(CNE2siNC)。与CNE2siNC细胞相比,CNE2siEp细胞eIF4EmRNA表达水平下调76.0%,蛋白表达水平下调50.0%,细胞增殖活性下调85.0%,运动活性下调59.0%。结论成功构建稳定敲减eIF4E的CNE2细胞系,其eIF4E基因表达水平与功能明显受抑。     

人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

背景:慢病毒载体是一个能够在原代培养的人树突状细胞中进行RNA干扰的有效工具,但目前国内对RNA干扰技术应用于人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子的研究却少有报道.目的:拟构建人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素表达水平提供有利的工具.方法:根据人树突状细胞特异性细胞问黏附分子3结合非整合素基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I和EeoR I双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生DC-SIGN慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Westem blot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列.用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度.结果与结论:PCR扩增和测序结果显示,人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定两条干扰效率高的有效靶序列.利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL.证实实验成功构建了DC-SIGN基因慢病毒载体.     

核转运蛋白2慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的探索构建针对人类核转运蛋白2(KPNA2)基因的重组慢病毒干扰RNA(sh RNA)载体的方法,研究其对人骨肉瘤细胞株MG63的沉默效率。方法针对KPNA2基因设计小片段干扰序列。加入AgeⅠ酶和Eco RⅠ酶酶切位点,根据设计好的序列合成单链DNA oligo并退火合成双链DNA oligo。将合成好的双链DNA oligo与GV115载体重组,形成GV115-sh RNA慢病毒载体。聚合酶链式反应(PCR)法鉴定筛选出阳性重组子,经测序后包装慢病毒载体。荧光法测定病毒滴度,重组慢病毒感染骨肉瘤细胞株MG63,通过显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达来计算其转染效率。RT-PCR法检测重组慢病毒RNA干扰载体对人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2表达的沉默效率。实验结果数据以均数±标准差(sx±)表示,应用SPSS 13.0统计软件分析,两组均数间的比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计意义。结果经PCR分析和测序证实,成功构建KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体;荧光法测定病毒滴度为4×108 TU/ml;荧光显微镜下观察GFP,显示细胞感染效率达到80%以上;RT-PCR检测对照组及实验组KPNA2 m RNA表达分别为0.991±0.087 vs.0.216±0.012,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体构建成功,并有效干扰人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2 m RNA的表达。     

Kir2ds4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。针对已经筛选确定的kff2ds4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]连接产生LV-shkir2ds4慢病毒载体，应用PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用LV-shkir2ds4，包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞，产生慢病毒颗粒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果表明，PCR和测序结果证实成功地构建了kir2ds4shRNA的慢病毒载体LV-shkir2ds4。293T细胞测定病毒滴度为6×10^8TU／ml。结论：成功地构建了人kff2ds4基因RNAi慢病喜载体．     

靶向hTERT基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建hTERT 基因RNAi 慢病毒载体,为大肠癌RNAi 介导的基因治疗打下基础.方法 化学合成3 条靶向hTERT 基因的siRNA,转染大肠癌细胞SW480,48 h 后采用RT-PCR 方法筛选出一条对hTERT mRNA 有明显抑制作用的siRNA.针对已经筛选确定的hTERT 基因RNAi 有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ酶切后的GP-Supersilencing Vector 载体[含U6 启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shhTERT 慢病毒载体,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shhTERT、pGag/Pol、pRev 和pVSV-G 4 质粒共转染包装细胞293T 细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP 蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR 和测序证实,成功构建hTERT shRNA 的慢病毒载体LV-shhTERT.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1 ×108 UT/ml.结论 成功构建了hTERT 基因RNAi 慢病毒载体.     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞.方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度.慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞.结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL.慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞.     

增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.