DNA条形码鉴定技术在动物类中药材鉴定领域的研究进展

动物药应用历史悠久,是我国中药资源的重要组成部分。由于药用动物野生资源的丧失与破坏,致使部分动物药材出现了药源短缺、无药可用的状态。随着动物药材市场价值的逐年增长,为了追求更高的利益,药材市场中混伪品乱用的现象日益严重。DNA条形码鉴定技术,是一种新兴的分子生物学鉴定技术,在中药材鉴定领域取得了丰硕成果,本文对DNA条形码鉴定技术在动物药鉴定领域的相关研究进行整理总结,为我国中药动物药资源的合理开发利用提供新的依据。     

中华蟾蜍DNA条形码鉴定

目的:通过DNA条形码研究鉴别中药材中华蟾蜍Bufo gargarizans Cantor及其混伪品的可行性。方法:从Gen Bank下载了6种蟾蜍属Bufo、2种林蛙属Rana、1种侧褶蛙属Pelophylax和1种小鲵属Hynobius的COI线粒体基因DNA序列。用Clustal X 1.81和Bio Edit软件分别对序列进行比对和编辑。利用MEGA 4.0软件按照Kimura双参数法计算种内和种间的遗传距离。用贝叶斯法和简约法构建系统发育树对中华蟾蜍进行鉴定。结果:构建的系统发育树表明,中华蟾蜍的所有样本聚类为一个单系,能很好地与其他混伪品区分。结论:COI条形码DNA序列能够对中药中华蟾蜍进行准确鉴定。     

DNA条形码技术在动物类中药鉴定中的应用研究进展

DNA条形码鉴定技术可以实现对物种进行快速鉴定,本文从肌肉类中药材、贝壳类中药材、角骨类中药材等方面对DNA条形码技术在动物类中药鉴定中的应用研究现状与展望展开综述,DNA条形码数据库是动物类中药材分子鉴定的重要参考依据,应完善基础数据库建设以及相关标准的制定,推动动物类中药材分子鉴定和产业化的深入发展。     

利用DNA条形码检验中药制剂中的羚羊角药材

目的 研究以线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因作为DNA条形码检验中药制剂中羚羊角的可行性.方法 以不同厂家生产的8种含羚羊角中药制剂为材料,经充分研磨后,采用DNA提取试剂盒提取样品中DNA,以引物LCO1490和HCO2198或特异性引物0703扩增线粒体COI基因片段序列,PCR产物直接双向测序,将测序结果在GenBank中进行BLAST比对,并以DNAMAN和MEGA5.2软件构建同源树和NJ树,以赛加羚羊(gb|JN632700.1)和羚羊角标准药材序列为对照,判定制剂中羚羊角的真实性,并以Kimura-2-parameter模型计算种内、种间遗传距离.结果 8种中药制剂中羚羊角的COI基因序列长度均为658 bp,在同源树和NJ树中可与赛加羚羊和羚羊角标准药材聚成一支,并与outgroup完全分开.种内遗传距离为0～0.064,平均遗传距离为0.020,种间遗传距离为0.167～0.195.结论 以线粒体COI基因作为DNA条形码检验中药制剂中羚羊角方法是可行的,但因羚羊其他器官也含有相同基因,为保证检验结果的准确性,还需配合使用其他检验方法.     

DNA条形码用于动物类中药鉴定的应用与展望

对DNA条形码技术的概念与特点、基因的标准与鉴别原理、操作步骤与分析方法及建立动物类中药DNA条形码鉴定新平台进行综述,对该技术在动物类中药鉴定中的应用前景进行展望。     

鹿茸饮片的DNA条形码鉴别研究

 目的 建立一种快速、准确和标准化的鹿茸饮片DNA条形码鉴别方法,并分析鹿茸药材原动物间的亲缘关系。方法 通过下载GenBank鹿类动物线粒体细胞色素C氧化酶亚基 I(COI基因,经比对分析,在靠近COI 基因5′端设计了一对鹿科动物DNA条形码通用引物,对来源于鹿科动物3个属共计19份样本的鹿茸进行了PCR扩增和序列分析,并构建系统进化树。结果 通过遗传距离和分子系统树分析显示DNA条形码鉴别方法能够在属水平和种水平将鹿科3属9种鹿成功的鉴别开来,对90%的鹿茸样本可进行有效地鉴定,而梅花鹿、马鹿中各一个样本未得到准确鉴定,具体原因有待进一步研究。结论 所建立的鹿茸药材DNA条形码鉴别方法,准确可靠,可用于正品鹿茸马鹿和梅花鹿及其混伪品进行准确鉴定。     

中药DNA条形码分子鉴定技术的应用与展望

中药材品种广泛,存在多基原的情况,质量差异较大,使临床用药安全性和有效性难以得到保证。因传统中药鉴定方法的局限性,对准确鉴别多基原中药材带来了一定的挑战。为了保证中药临床用药安全有效可控,中药鉴定学已成为最重要的研究课题之一,也是当前中医药事业急需解决的关键技术要求。DNA基因鉴别是从基因层面对中药材进行快速、准确的鉴定,包括DNA分子标记法、核酸探针杂交法和DNA条形码技术,其中DNA条形码技术应用最为广泛。DNA条形码是利用标准的DNA片段对物种进行鉴定的技术,2015年版《中国药典》收载了DNA条形码技术指导原则,建立了动物类采用细胞色素C氧化酶亚基I(COI)序列为主,转录间隔区间(ITS)2为辅;植物类采用ITS2/ITS为主,叶绿体psb A-trn H为辅的中药材鉴定体系。该技术的广泛应用为中药鉴别提供更高效快速的方法,并且有效地应用于多基原中药材的鉴别中,使中药品种混乱现象得到极大改观。文章首先对DNA条形码技术的原理、目的及意义、标准片段的选择进行介绍,着重阐述该技术在中药鉴定中的应用以及存在的局限性,并提出展望,以期为中药材的鉴定研究提供参考。     

基于COI和16SrRNA基因的地龙药材及其混淆品的DNA条形码鉴定

目的 利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基1（COI）和16S核糖体RNA（16SrRNA）对地龙药材及常见混伪品进行分子鉴定,探讨快速、准确鉴定地龙药材及其混伪品基原物种的方法。方法 收集地龙药材的药典收载品种及其易混品种10种,提取DNA,得到其COI和16SrRNA序列。所得序列经DNAStar校正后,用MEGA6.0自带的Clustal W多重比对,除去冗余位点,比对结果经MEGA6.0分析,构建地龙药材及其混淆品的邻接（N-J）树。结果 地龙药材的正品来源参环毛蚓（Pheretima aspergillum）、通俗环毛蚓（P. vulgaris）、威廉环毛蚓（P. guillelmi）及栉盲环毛蚓（P. pectinifera）与其混淆品种间COI和16SrRNA基因序列均存在较多变异位点。由所构建的N-J系统聚类树图显示所测物种的单系性,即16SrRNA、COI可以很好的将地龙药材区别于其他混伪品。结论 所获得的COI和16SrRNA序列可作为不同状态的地龙类药材物种鉴定的分子依据,并为进一步建立地龙等动物类中药物种真实性鉴定体系奠定了重要的实验基础。     

中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究

目的：建立一种直接从药材中提取DNA的方法以满足中药材DNA条形码研究的需要。方法: 以麦冬药材为实验对象,对比5种常用植物DNA提取方法,筛选出最优方法后,对不同部位入药的10种中药材进行DNA提取,采用琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增效果进行检测。结果：改良的CTAB法较适合药材DNA提取,虽然所有样品DNA都出现降解,但基于ITS2序列引物PCR扩增成功率为90%。结论：通过增加药材的预处理、核分离液等步骤,并改良CTAB浓度等措施,CTAB法能够用于上述不同药用部位入药的9种药材DNA提取,可以为中药DNA条形码鉴定中的DNA提取提供参考。     

近年来DNA微型条形码和DNA宏条形码在中药鉴定中的应用

中药鉴定是保证中药有效性和安全性的重要一环。DNA条形码技术让中药鉴定摆脱了经验依赖,弥补了传统化学方法和形态学方法鉴定中药材的不足,然而对于在炮制或加工过程中DNA降解的药材和复杂样品方面鉴定能力有限。中药DNA条形码鉴定技术近年来发展迅速,DNA微型条形码的出现,不仅可用于鉴定DNA发生严重降解的实验材料,在很大程度上弥补了传统条形码的短板,还可作为候选条形码,与标准条形码组合,共同鉴定混合中药材样本。此外,DNA宏条形码技术通过将DNA条形码与高通量测序技术相结合,以实现组合样本中多个物种的检测,是目前混合中药材鉴定方面最有效的分子鉴定方法。该文通过对近年来DNA微型条形码、DNA宏条形码在有关中药物种及中药共存微生物组成鉴定的研究进行梳理总结,以明晰该领域研究现状,并展望未来发展,为中药分子鉴定研究提供参考。     

基于DNA条形码技术的毒性药材金钱白花蛇药源调查

目的:建立基于DNA条形码技术的毒性药材金钱白花蛇药源调查方法,调查市售金钱白花蛇的药源构成。方法:建立金钱白花蛇正品及其主要混伪品的参考细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CoⅠ)条形码库,收集51份市售金钱白花蛇样品,分别获取每份样品头部和尾部的CoⅠ序列,通过构建邻接系统发育树进行物种鉴定。结果:共获得60条金钱白花蛇正品及其主要混伪品的CoⅠ条形码,银环蛇种内最大遗传距离0.020 1,与金环蛇、赤链蛇和赤链华游蛇的种间最小遗传距离分别为0.156 1,0.208 8和0.209 3,种内最大变异小于种间最小变异;金钱白花蛇正品及其混伪品在邻接系统发育树上聚为独立的支,金钱白花蛇正品及其混伪品在系统发育树上可明确区分。所有市售金钱白花蛇样品均可从头部和尾部成功获得CoⅠ序列,药源调查结果表明银环蛇29份,赤链蛇20份,赤链华游蛇2份,混伪品占比43%;基于头部和尾部的鉴定结果一致。结论:DNA条形码技术可用于市售金钱白花蛇的药源调查;金钱白花蛇市场混乱、混伪品较多,质量问题严重。     

基于DNA条形码的藤类药材鉴定

目的:对《中国药典》中记载的14种藤类药材进行分子鉴定。方法:以核基因ITS2片段作为DNA条形码,对研究材料进行PCR扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建NJ(邻接)树。结果:14种藤类药材的ITS2序列长度为190-284 bp;各药材种内K2P遗传距离为0-0.053,远远小于种间K2P遗传距离(平均值为0.852,最小值为0.309);由所构建的系统聚类树图可以看出,本研究中具有不同产地来源样品的药材均表现出了单系性,同时又与其它药材明显分开。结论:ITS2序列作为条形码适用于鉴定《中国药典》中藤类药材,在中药材的鉴定领域具有重要的应用前景。     

药用植物DNA条形码研究进展

近10年来,DNA条形码(DNA barcoding)技术飞速发展,已经成为国际上生物学研究的热点之一。该技术在鉴别动物物种上已经得到了广泛的认同和应用,但是在药用植物领域存在极大的挑战,至今还没能得出一个通用的候选序列。候选序列主要有单序列如matK、rbcL等,复合序列如rbcL+trnH-psbA等。现综述DNA条形码在药用植物鉴定中的应用研究,并对常用单序列和复合序列的鉴定应用展开了讨论;同时针对近期提出的以叶绿体全基因组作为"超级条形码"的可行性进行了分析讨论和展望,以期为中药药用植物的快速准确鉴定提供新的研究思路。     

DNA条形码等分子鉴定技术与动植物类中药材的鉴定

中药材鉴定是控制中药质量、确保用药安全与效果的首要环节。DNA分子鉴定是从基因层面上进行中药材鉴别的手段,准确率高。DNA分子鉴定包括电泳技术、免疫技术、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(ISSR)及DNA条形码等,以DNA条形码应用最为广泛。DNA条形码是基因组中相对较短的、可用于物种鉴定的特异性基因片段。植物类中药材的条形码多选用核基因和叶绿体基因DNA片段,如叶绿体psbA-trnH基因、内转录间隔区(ITS)、叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基(rbcL)和RNA转录体Ⅱ型内含子剪切酶基因(matK)等;动物类中药材的条形码多来自核基因和线粒体基因DNA,主要有线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(COⅠ)、核糖体RNA(rRNA)和线粒体细胞色素b基因(CytB)等。综述动植物类中药材DNA分子标记与鉴定技术应用进展,并探讨DNA条形码在药用动植物类中药材鉴定中存在的局限性及发展前景,为中药质量控制提供参考。     

脾虚一号方对脾虚型功能性消化不良大鼠胃组织线粒体呼吸链复合物IV亚单位的影响

目的：探讨脾虚型功能性消化不良（FD）大鼠胃组织线粒体呼吸链复合物IV亚单位（COX VA）蛋白和mRNA表达及脾虚一号方对其的干预作用。方法： 70只7 d龄雄性SD大鼠随机分为正常组,FD模型组（单模型组）,脾虚型FD模型组（双模型组）,多潘立酮组,脾虚一号方低、中、高剂量组,每组10只。FD模型组、脾虚证FD模型组给予0.1%蔗糖碘乙酰胺蔗糖溶液灌胃,连续6 d。脾虚证FD模型组正常饲料喂养至6周龄后叠加改良小平台站立,连续14 d。造模结束后分别给予蒸馏水10 mL·kg^-1·d^-1,多潘立酮3.125 mg·kg^-1·d^-1,脾虚一号方1.275,2.55,5.1 g·kg^-1·d^-1,灌胃14 d。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）,蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫组化法检测胃窦组织COX VA mRNA与蛋白表达量。结果：与正常组比较,脾虚一号方高剂量组COX VA蛋白平均积分吸光度升高（P<0.05）;多潘立酮组、脾虚一号方低、中剂量组COX VA蛋白表达量均有不同程度降低（P<0.01）,而脾虚一号方高剂量组COX VA蛋白表达量则升高（P<0.01）;单模型组COX VA mRNA表达量升高最明显（P<0.01）。与双模型组比较,多潘立酮组、脾虚一号方低、中剂量组COX VA蛋白表达量均有不同程度降低（P<0.01）,多潘立酮组、脾虚一号方低、中剂量组COX VA mRNA表达量均有不同程度降低,而脾虚一号方高剂量组、单模型组则升高,差异均无统计学意义。结论：脾虚型FD大鼠存在COX VA蛋白的表达量降低,脾虚一号方能够增加COX VA蛋白的表达量,改善能量代谢。     

DNA条形码鉴定与功效组分测定在紫草质量评价中的应用

目的:利用DNA条形码技术对中药紫草进行基源鉴定,并建立紫草的功效多组分含量测定方法,为全面评价紫草药材质量提供依据。方法:对不同产地紫草进行DNA条形码基原鉴定;采用高效液相色谱法测定紫草中萘醌类成分与含量,Thermo BDS Hypersil C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相0.2%冰乙酸-乙腈梯度洗脱,流速0.8 m L·min~(-1),检测波长275 nm,柱温35℃。结果:经DNA条形码鉴定了11批药材,均为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma的干燥根;测定了11批新疆紫草的8种萘醌类功效组分含量,各组分均显示良好分离;不同成分在线性范围内线性关系良好,平均回收率在95.26%~101.40%,RSD均在0.7%~1.8%(n=6)。结论:DNA条形码鉴定确保了新疆紫草药材基源的准确性,组分含量测定方法准确可靠、重复性好,二者结合可作为紫草的质量控制方法。     

广东省巴戟天DNA条形码及遗传多样性分析＊

目的 构建广东省巴戟天DNA条形码数据库以及研究广东省不同产地巴戟天的遗传多样性。方法 采用DNA条形码技术对149个巴戟天样本进行分析，构建DNA条形码数据库。利用ISSR分子标记技术对广东省8个居群的巴戟天进行遗传多样性分析。结果 巴戟天五个通用条形码的PCR测序成功率为psbA-trnH > rbcL > matK > ITS2 > ITS，149个巴戟天样本建立了含有569条序列的数据库。研究筛选出6条ISSR引物，从巴戟天中扩增得80条条带，多态性比率为92.50%，遗传相似系数在0.5625-0.8910，表明广东省巴戟天的遗传多样性较高。ISSR标记揭示的PCoA结果、UPGMA聚类分析结果一致，八个居群分为两大支。结论 广东省巴戟天具有较高的遗传多样性。