miR-148-5p靶向H型血管调控因子Slit3的实验研究

目的 观察绝经后骨质疏松症中H型血管调控因子Slit3表达差异,进一步探讨其上游靶向调控miRNAs。方法 雌性SD大鼠随机分假手术组和模型组,Real-time PCR和免疫组化检测骨组织Slit3 mRNA和蛋白表达水平;生物信息学预测可能与Slit3-3’UTR互作的miRNAs,构建野生型和突变型Slit3-3’UTR重组荧光素酶报告载体,和miRNAs表达载体共转染293T细胞,双荧光素酶报告基因测定荧光素酶活性验证miRNA对Slit3-3’UTR的靶向作用。结果 与假手术组相比,模型组Slit3 mRNA表达水平略上调和平均光密度显著上调,生物信息学预测Slit3-3’UTR与miR-148a-5p、miR-148b-5p、miR-410-3p、miR-129-5p和miR-374-5p存在碱基结合位点,野生型Slit3-3’UTR共转染miR-148b-5p荧光活性下调至空白对照组的68.91%,突变型Slit3-3’UTR共转染miR-148b-5p荧光活性未见下调。结论 Slit3可能是绝经后骨质疏松症H型血管的调控基因,miR-148b-5p与Slit3-3’UTR的靶向结合直接调控Slit3的表达水平。     

葛根素对成骨细胞中miRNA-204的调控及其与Runx2基因表达的关系

目的研究葛根素作用于成骨细胞MC3T3-E1后miRNA表达的变化以及与Runx2基因表达的关系。方法 RT-PCR和western blot法检测Runx2的mRNA表达水平和蛋白表达水平;miRNA表达谱检测葛根素作用于成骨细胞后可能靶向Runx2的miRNA;Target Scan、Pic Tar等靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA;RT-PCR测定miRNA-204表达量;构建Runx23’UTR/突变型Runx2 3’UTR重组质粒、合成miRNA-204mimics和miRNA-204NC共转染MC3T3-E1细胞,双荧光素酶报告基因系统验证靶基因;miRNA-204mimics和miRNA-204inhibitor转染MC3T3-E1细胞,RT-PCR和western blot检测转染前后Runx2的mRNA表达量和蛋白表达量的变化。结果与空白组比较葛根素作用后Runx2的miRNA和蛋白表达均上升;miRNA-204表达水平下降;表达谱和靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA共同有miR-204、miR-3072-3p等;过表达miRNA-204后Runx2的蛋白表达水平下降,干扰miRNA-204表达后Runx2的蛋白水平上升。结论葛根素在成骨细胞中可通过调节靶向Runx2基因的miRNA-204来促进细胞增值分化。     

过表达miR-101-3p可下调TOP2A基因表达抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移

目的发现并确认膀胱癌致癌基因TOP2A的上游miRNA,并探讨其在膀胱癌中发挥的具体作用及可能机制。方法starBase数据库用于预测膀胱癌中潜在和TOP2A结合的miRNAs,并运用TCGA数据库挖掘对所有预测的miRNAs与靶基因的相关性和生存分析进行排序;根据预测的结合位点情况构建双荧光素酶报告基因实验和干扰实验,以确认候选基因miR-101-3p和TOP2A基因的结合情况;qRT-PCR用于分析两基因在临床组织水平表达相关性;运用细胞转染技术在膀胱癌细胞中分别转染miR-101-3p mimics和inhibitor及各自的阴性对照,随后采用CCK8,细胞划痕愈合实验和Transwell实验测定细胞的增殖及迁移能力变化情况;细胞共转染技术和细胞功能回复实验以明确miR-101-3p/TOP2A信号轴在肿瘤细胞恶性表型中的调控作用。结果 starBase数据库预测获得147个miRNAs;TCGA数据库分析显示,miR-101-3p和TOP2A基因相关系数最高,且与膀胱癌患者不良预后密相关,作为后续实验候选基因;双荧光素酶报告基因实验和干扰实验证实两者在膀胱癌中的结合能力,miR-101-3p可以下调TOP2A基因的表达;临床组织标本中,miR-101-3p和TOP2A基因的表达具有负相关性;此外,体外实验显示,miR-101-3p可以抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移能力;过表达TOP2A基因,可以恢复膀胱癌细胞的增殖和迁移能力。结论过表达miR-101-3p可以下调TOP2A基因表达抑制膀胱癌细胞增殖和迁移。     

miR-449b多态性位点rs10061133差异调控LHCGR表达

目的探究miR-449b多态性位点rs10061133 AG在卵巢功能不全(POI)中的可能作用机制。方法生物信息学预测可能与POI相关的miR-449b潜在靶基因。双荧光素酶检测LHCGR是否为miR-449b的靶基因以及miR-449b rs10061133不同基因型对LHCGR表达调控的影响。结果生物信息学预测LHCGR为miR-449b的潜在靶基因,双荧光素酶测定证实LHCGR是miR-449b的靶基因。与GG基因型相比,rs10061133 AA基因型显著减弱LHCGR 3’UTR的荧光素酶活性。结论 LHCGR为miR-449b的靶基因,多态性位点rs10061133 AG可能通过差异调控LHCGR表达在POI的发生发展中发挥作用。     

可控性Speedy A基因表达转基因小鼠模型的建立鉴定和表型分析

目的建立基于Tet-On系统诱导表达的Speedy A基因RNA干扰转基因小鼠模型,探讨Tet-On系统在研究精子发生相关基因中的应用,研究Speedy A基因下调对精子发生的影响。方法体外实验筛选下调Speedy A基因表达的有效干扰片段,Gateway技术构建包含有效干扰片段和四环素反应元件(TRE)的质粒(pRP.EX2d-TREshSpdya),受精卵显微注射该质粒建立转基因小鼠并筛选到纯合子,然后与四环素调控的反式激活子(rtTA)转基因小鼠杂交,筛选TRE和rtTA双阳性的小鼠为四环素诱导的Speedy A-RNA干扰转基因小鼠模型,喂食强力霉素(Dox)诱导RNA干扰片段的表达下调Speedy A基因的表达;实时荧光定量PCR法检测模型组小鼠与喂食强力霉素的正常小鼠(对照组)Speedy A的表达差异;HE染色观察睾丸组织形态学变化,TUNEL法检测小鼠睾丸组织的细胞凋亡情况。结果模型组小鼠Speedy A基因的表达量与对照组小鼠的表达量相比下降26%;模型组小鼠睾丸组织发生异常的生精细胞凋亡。结论成功建立了基于Tet-On系统诱导表达的可控性Speedy A-RNA干扰转基因小鼠模型,说明可以基于Tet-On系统在体研究精子发生相关基因的功能;Speedy A基因表达下调可使生精细胞发生异常凋亡。     

动脉重建术后再狭窄相关miRNA表达谱分析及靶基因鉴定

目的 筛查动脉粥样硬化闭塞症( ASO)血管重建术后再狭窄相关miRNA基因表达谱,分析并鉴定表达差异显著的miRNA及其潜在靶基因.方法 取下肢ASO患者股动脉标本6例,3例未行血管重建术(A组),3例动脉重建术后再狭窄(R组),另取正常股动脉3例为正常对照(N组).利用miRNA基因芯片检测miRNA差异表达谱,以实时逆转录-聚合酶链反应(real-time RT-PCR)验证其表达,并通过构建双荧光素酶报告基因系统鉴定预测靶基因.结果 与N组比较,病变组(A组+R组)miRNA-1和miRNA-335表达下调,没有miRNA表达上调;R组miRNA-623表达上调,17个miRNAs下调;A组miRNA-1和miRNA-335表达下调,没有miRNA表达上调.与A组比较,R组17个miRNAs上调,9个miRNAs下调.表达下调以miRNA-1最显著,并经real-time RT-PCR证实(P＜0.05).双荧光素酶实验证实miRNA-1靶向抑制Kruppel样因子4(KLF4)的表达(P＜0.05).结论 miRNA可能参与ASO及动脉重建术后再狭窄的发病机制,其中miRNA-1可能起重要作用.     

MiR-17/RB通路调节血管平滑肌细胞增殖

目的探索miR-17在血管平滑肌细胞(VSMCs)中对视网膜母细胞瘤(RB)基因和蛋白水平的调控作用,以及对增殖效应的影响。方法培养HA-VSMCs并诱导其增殖,应用芯片技术筛选出差异表达水平最显著的微小RNA(miR)。在293T细胞应用荧光素酶报告基因验证生物信息学软件预测的miR-17与RB的靶向结合作用。分别向VSMC转染miR-17 mimic和miR-17 inhibitor并建立阴性对照,检测RB水平及细胞增殖相关指标PCNA表达水平。结果荧光素酶报告分析证实miR-17与RB mRNA-3’UTR具有靶向结合效应。转染miR-17 mimic促进VSMC增殖相关指标PCNA表达上调,并且可以下调RB蛋白及mRNA水平,转染miR-17 inhibitor后下调PCNA表达且可上调RB表达(P0.05)。结论miR-17通过靶向结合RB mRNA-3’UTR调控RB表达从而调控VSMCs增殖。     

PrLZ基因3′-UTR区荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测

目的分析前列腺亮氨酸拉链(PrLZ)基因3′非编码区(3′-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,为研究PrLZ基因转录后的miRNA调控提供有效的工具。方法使用PCR方法从PrLZ阳性的C4-2细胞中扩增含PrLZ基因3′-UTR区序列,插入到T-Vector载体上,提高PCR产物的连接、克隆效率,通过Xbal和BamHI限制性内切酶双酶切后将其连入经相同内切酶双酶切后的荧光素酶报告基因载体pLUC中,构建pLUC-PrLZ 3′-UTR载体,使用生物信息学方法预测PrLZ基因3′-UTR可能是miR-34a的作用靶点,使用慢病毒载体构建对照载体(质粒名称-NC)和过表达miR-34a(质粒名称-miR-34a),包装成病毒颗粒后分别感染293-T细胞,然后通过X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂将pLUC空质粒和pLUC-PrLZ 3′-UTR重组质粒分别转染293-T细胞,Promega试剂盒测定荧光素酶的活性。结果得到含PrLZ基因3′-UTR序列的荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证了其序列的正确性。在miR-34a高表达组的293-T细胞中,重组质粒组荧光素酶活性比空质粒组低40%,差异具有统计学意义(P0.05)。结论成功构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,miR-34a可以显著降低荧光素酶的活性,PrLZ基因3′-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点。     

微小RNA-20b-5p/E2F转录因子5介导转化生长因子-β1调节前列腺癌细胞上皮-间充质转化的作用机制研究

目的探讨前列腺癌细胞中微小RNA(miR)-20b-5p/E2F转录因子5(E2F5)介导转化生长因子-β1(TGF-β1)调节前列腺癌细胞上皮-间充质转化(EMT), 从而促进前列腺癌发生发展的作用机制。方法分析数据库, 预测miR-20b-5p的靶基因, 双荧光报告基因检测miR-20b-5p对E2F5 mRNA的3’UTR的靶向抑制。E2F5的野生型(WT)及突变型(Mut)的3’端非编码区(3’UTR)分别转染PC3和DU145细胞后, 再做TGF-β处理, 双荧光报告基因检测E2F5是否是TGF-β和miR-20b-5p的共同靶点。蛋白质印迹法(Western blot)检测miR-20b-5p对E2F5的靶调节。PC3和DU145细胞分别转染miR-20b-5p抑制剂和模拟物及其对照RNA后, Western blot检测miR-20b-5p对E2F5的靶调节。分别取两组前列腺增生和前列腺癌组织进行mRNA基因测序, 比较两者E2F5的表达。PC3细胞敲低miR-20b-5p的同时也敲低E2F5, Western blot检测EMT相关基因E-钙黏蛋白(E-cadherin...     

miR-342-5p 调控靶基因Merlin 表达促进肝细胞癌侵袭转移的实验研究

目的：探讨miR-342-5p及其可疑靶基因Merlin在肝细胞癌（HCC）中表达及意义。 方法：用qRT-PCR检测miR-342-5p和Merlin mRNA在HCC组织与癌旁组织，以及正常肝细胞系与各种不同HCC细胞系中的表达；用重组慢病毒包装质粒pGCSIL-GFP-miR-342-5p或空载体（阴性对照）转染HCCLM3细胞，以无处理的HCCLM3细胞作为空白对照，划痕愈合及Transwell实验观察细胞侵袭运动能力；Western blot法检测细胞中Merlin蛋白的表达。采用双荧光素酶基因报告系统，将含野生型或突变型Merlin基因3''UTR质粒（psiCHECK-Merlin）分别与pGCSIL-GFP-miR-342-5p、空载体（阴性对照）共转染或单独转染（空白对照）HCCLM3细胞后，检测各组细胞荧光素酶活性。 结果：与癌旁组织比较，HCC组织中miR-342-5p表达明显上调，Merlin mRNA表达明显下调（均P<0.05）；HCC组织中，血管侵犯组较无血管侵犯组miR-342-5p表达明显上调，Merlin mRNA表达明显下调（均P<0.05），且miR-342-5p与Merlin mRNA表达呈负相关（r2=5.364，P<0.05）。各HCC细胞系中miR-342-5p表达均明显高于正常肝细胞系，且miR-342-5p的表达随HCC细胞系的侵袭性增高而上调，而Merlin mRNA表达则呈相反趋势（均P<0.05）。与空白对照组及阴性对照组比较，HCCLM3细胞转染pGCSIL-GFP-miR-342-5p质粒后，细胞侵袭运动能力明显下降（均P<0.05），而Merlin蛋白表达明显上调。psiCHECK-Merlin野生型与pGCSIL-GFP-miR-342-5p质粒共转染HCCLM3细胞后，细胞的荧光素酶活性较其阴性对照组或空白对照组明显降低（P<0.05），而psiCHECK-Merlin突变型与pGCSIL-GFP-miR-342-5p质粒共转染HCCLM3细胞后，细胞的荧光素酶活性与其空白对照组或阴性对照组无统计学差异（P>0.05）。 结论：Merlin是miR-342-5p的靶基因，miR-342-5p可能通过调控MerlinmRNA的表达促进肝细胞癌侵袭转移。