多重置换扩增(MDA)结合荧光PCR对植入前胚胎进行性别诊断的研究

目的:建立多重置换扩增(MDA)联合荧光PCR对植入前胚胎进行性别诊断的方法,为开展性连锁遗传病的性别筛选提供实验依据。方法:在行IVF-ET助孕的患者中,选取废弃的第3日新鲜或冷冻后的2PN受精胚胎。通过显微操作活检得到单个卵裂球细胞,采用MDA方法对单个/2个卵裂球细胞行全基因组扩增,然后采用荧光PCR方法对AMEL、X22、SRY和XHPRT 4个性染色体相关基因或STR位点进行扩增,对其扩增产物行毛细管电泳检测,分析电泳结果确定植入前胚胎的性别。以父母的外周血单个淋巴细胞作为对照进行分析。结果:①采用蛋白酶K法(n=21)和碱法(n=17)对卵裂球细胞进行裂解行MDA,扩增成功率未见统计学差异(85.7%vs 82.4%,P>0.05);单个卵裂球组(n=15)和2个卵裂球组(n=23)MDA扩增成功率亦未见统计学差异(80.0%vs87.0%,P>0.05)。②利用MDA方法对15个胚胎的单个/2个卵裂球进行扩增,扩增成功率为86.7%(n=13)。13个胚胎中7个为男性,6个为女性,性别检测成功率100%;等位基因脱扣(alleledropout,ADO)发生率为7.7%。结论:PGD中MDA是有效且可靠的全基因组扩增方法,MDA结合荧光PCR可以用于性连锁遗传病的性别筛选、致病基因检测和对胚胎进行HLA分型。     

结合多重链置换扩增和等位基因特异性PCR从单细胞中扩增脊髓性肌萎缩症运动神经元生存基因

目的:建立结合多重链置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)全基因组扩增法和等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)对单细胞进行脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy,SMA)诊断的方法。方法:对脊髓性肌萎缩症运动神经元生存基因(survival motor neuron gene1,smn1)7号外显子纯合缺失皮肤成纤维细胞及正常的皮肤成纤维细胞使用MDA法进行全基因组扩增,使用AS-PCR检测扩增产物的smn1和smn2基因,同时扩增D5S435、D5S351这2个微卫星位点,评估扩增效率、等位基因脱扣(allele dropout,ADO)率及污染检测。结果:对18个SMA细胞和21个smn1基因正常的细胞进行扩增。smn1和smn2基因扩增成功率分别为90.4%(19/21)和94.8%(37/39)。2个微卫星的扩增成功率为82.1%(32/39)和88.9%(16/18),ADO率分别为16.22%(6/37)和12.5%(2/16)。总扩增成功率为88.89%(104/117),总ADO率为15.09%(8/53)。结论:建立了结合MDA和等位基因特异性PCR对单个细胞进行smn1、smn2基因的扩增方法,为SMA单细胞植入前诊断奠定了基础。     

多次退火环状循环扩增和多重置换扩增技术在β地中海贫血基因变异诊断效率中的差异分析

目的:探讨最适的β地中海贫血疾病HBB基因单细胞全基因组扩增方法。方法:60份β地中海贫血成纤维细胞(HBB基因变异位点CD17和IVSⅡ654)和48份废弃胚胎单个卵裂球进行多次退火环状循环扩增法(MALBAC)和多重置换扩增法(MDA)扩增及高通量测序,比较位点检测率、等位基因脱扣(ADO)率及扩增均一度等。结果:β地中海贫血疾病HBB基因MALBAC技术位点检测率(100%)高于MDA技术(96.3%);CD17和IVSⅡ654的ADO率MALBAC技术为9.09%和0.00%,MDA技术为23.08%和19.23%;对编码人β-珠蛋白的HBB基因附近60个SNP位点检测显示MALBAC技术ADO率为12.04%,MDA技术为21.25%;MALBAC技术拷贝数变异检测变异系数为0.13,MDA技术为0.15。结论:β地中海贫血单细胞诊断MALBAC法优于M D A法。     

短串联重复序列在染色体罗氏易位植入前遗传学诊断的应用

目的:采用多重置换扩增(MDA)结合短串联重复序列(STR)建立一种基于PCR技术诊断染色体罗氏易位的植入前遗传学诊断(PGD)方法。方法:选择位于易位染色体上的STR位点,对家系采用荧光PCR进行分析,选择有多态性的位点,再采用MDA对单细胞进行全基因组扩增,根据家系分析的结果,对具有多态性的STR位点进行分析诊断。结果:对3个家系进行了4个取卵周期(3个PGD周期),每个家系分别采用7~15个具有多态性的STR位点进行分析,共对24个胚胎进行诊断。PGD的诊断效率为95.8%(23/24),平衡胚胎占52.2%(12/23),异常胚胎占47.8%(11/23),共移植了6个胚胎,获得2例临床妊娠,临床妊娠率为66.7%(2/3),出生了2个健康婴儿,染色体核型均正常。结论:采用依赖于STR的PCR分析法可以用于染色体罗氏易位的PGD。     

多次退火环状循环扩增技术在单细胞水平诊断脊髓性肌萎缩症的应用评估

目的:应用并评价多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplification cycles,MALBAC)技术在单细胞水平诊断脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)基因变异的效率。方法:收集SMN1基因7号外显子纯合缺失、正常皮肤成纤维细胞以及废弃胚胎单个卵裂球细胞,分别使用MALBAC和多重链置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)方法进行全基因组扩增(WGA)。Sanger测序检测SMN1及SMN2序列,并对3个微卫星位点进行连锁分析。结果:2种扩增技术的总扩增成功率、等位基因脱扣(ADO)率无统计学差异(P0.05);MALBAC组诊断准确率为91.7%(67/73),低于MDA组的96.1%(73/76)(P0.05)。结论:针对SMA疾病开展单细胞水平遗传学诊断,传统MDA方法略优于MALBAC全基因组扩增技术。     

利用短串联重复序列无创性产前诊断21-三体综合征

目的:探索短串联重复序列用于无创性产前诊断21号染色体非整倍体异常的可行性。方法:选择进行遗传咨询的孕妇及其配偶共50对,以血红蛋白γ链染色结合显微操作分离获取母血中胎儿有核红细胞,经PEP扩增细胞基因组后,对3个21染色体位点D21S11、D21S1411、D21S1412进行PCR扩增。同时对各对夫妻外周血DNA进行上述基因位点扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳后胎儿及其双亲的基因型对比分析。结果:50例均获取胎儿细胞样本,平均4.55±2.60个/ml。其中3例扩增失败,其余47例D21S11、D21S1411及D21S1412位点的有效信息率分别为85.11%(40/47)、78.72%(37/47)、76.60%(36/47)。3个STR位点联合应用,对45例样本成功鉴定了细胞的胎儿源性并准确判断胎儿21号染色体的数量,符合率为95.74%(45/47)。检出2例21-三体综合征胎儿,与其实际核型相符。结论:PEP结合多个染色体特异性STR位点分型可用于非整倍体异常的无创性产前诊断。     

孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断中的应用

目的依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论,寻找一种无创性产前基因诊断的新方法。方法提取42例孕14~40周的产妇血浆中游离胎儿DNA,采用引物延伸预扩增(primerextensionpreamplification,PEP)后行PCR,特异性扩增其Y染色体重复序列(DYZ3)基因。同时采用9个短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)多态性位点的多重扩增方法以检出血浆中胎儿DNA。结果DYZ3-PCR中,32例妊娠男性胎儿孕妇中有28例血浆中出现基因扩增带,检出率为87.5%,10例妊娠女性胎儿孕妇血浆有2例假阳性结果。性别总符合率为85.7%,STR-PCR中,检测出孕妇血浆中父源性胎儿DNA的存在。结论应用孕妇血浆中胎儿DNA作产前诊断敏感性和特异性较高,是一种无创性产前基因诊断方法,具有广泛的临床应用前景。     

IVF和ICSI中多原核受精卵的发育及遗传多态性分析

目的:了解IVF和ICSI治疗周期中多原核受精卵的发育情况及其基因座遗传多态性。方法:分别收集IVF和ICSI治疗中的废弃多原核(≥3PN)受精卵315个和67个,进行体外培养,观察比较其发育能力,并复合扩增多原核来源的1株胚胎干细胞和2个囊胚细胞DNA的15个短串联重复序列(STR)基因座,利用3100遗传分析仪对其进行STR基因座多态性检测。结果:IVF组和ICSI组的多原核受精卵卵裂率无显著性差异(P>0.05),但IVF组胚胎停育率和囊胚形成率显著低于ICSI组(P<0.01)。STR基因座多态性检测显示,IVF组3PN受精卵来源的胚胎干细胞为典型的三倍体特征,但ICSI组4PN受精卵来源的2个囊胚未表现多倍体特征。结论:多原核受精卵有继续发育能力,其中IVF组多原核来源胚胎干细胞表现遗传物质倍性改变,而ICSI组多原核来源囊胚无遗传物质倍性变化。     

简并寡核苷酸引物聚合酶链反应扩增单细胞全基因组均匀性研究

目的　探讨单细胞简并寡核苷酸引物聚合酶链反应 (DOP PCR)扩增全基因组DNA的均匀性及植入前胚胎遗传学研究的新途径。方法　获取正常男女性、X单体、X、13和 2 1三体细胞 ,行单细胞DOP PCR ,通过比较基因组杂交 (CGH )双色荧光强度比变化 ,分析扩增均匀性。结果　 (1)DOP PCR产物 /正常男性基因组DNACGH :约 1/ 3常染色质区强度比均数及标准差超过正常允许范围 ,X染色体假性过度表达 ,13、2 1三体无明显变化。 (2 )DOP PCR产物 /正常男性单细胞DOP PCR产物CGH :94%强度比均数及标准差接近期望值 ,能显示正常男女性、X单体、X、13和 2 1三体染色体拷贝数变化。结论　单细胞DOP PCR扩增基因组DNA存在明显的不均匀性 ,但这种不均匀扩增是非随机的。如选择合适的参照 ,扩增产物可用于植入前胚胎等单细胞全基因组研究。     

应用MLPA技术进行脊髓性肌萎缩症高风险胎儿的产前诊断

目的:建立快速、准确的脊肌萎缩症(SMA)家系的产前诊断方法。方法:2个曾生育过SMA患儿(患儿已死亡)的家系,母方再次妊娠。采用多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术检测父母双方的生存运动神经元基因(SMN)以及邻近基因拷贝数,明确是否为SMA携带者。经羊膜腔穿刺术抽取胎儿羊水,应用短串联重复序列(STR)位点检测并分析父母及胎儿的遗传关系,排除羊水细胞DNA中孕母DNA的污染,再采用MLPA技术进行胎儿产前诊断。结果:MLPA分析结果显示,2个家系的父母双方SMN1基因7、8外显子均为杂合性缺失,为SMA携带者。STR位点检测分析结果显示,2个家系中的孕母羊水细胞DNA均未受到孕母DNA的污染。家系1的胎儿SMN1基因7、8外显子拷贝数与父母相同,为SMA携带者;家系2的胎儿SMN1基因7、8外显子拷贝数为0,为SMA患者。结论:先证者遗传病因不明确时,可采用MLPA技术对SMA家系进行产前诊断,预防SMA患儿出生。     

不同扩增方法和探针长度对植入前单个卵裂球比较基因组杂交检测结果的影响

目的 探讨不同扩增方法和探针长度对植入前单个卵裂球比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)检测结果的影响,为植入前产前诊断奠定基础.方法 随机将20枚植入前6～8细胞期胚胎卵裂球分为A和B组(各10枚),取1名正常男性外周血20枚淋巴细胞,分为C和D组(各10枚)作为对照.A和C组经简并寡聚核苷酸聚合酶链反应(degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction,DOP-PCR)、B和D组经多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)分别进行全基因组扩增(whole genome amplification,WGA),用上述全基因组扩增产物进行PCR扩增TBX1基因2号外显子,验证其特异性.将获得的WGA产物制备成250～750 bp和750～2000 bp 2种不同长度的探针与正常男性中期染色体核型进行杂交,Y染色体性别决定区(sex-determining region of Y,SRY)基因验证CGH检测结果.结果 (1)用DOP-PCR扩增时,A组10枚卵裂球中有9枚WGA成功,C组10枚淋巴细胞WGA均成功;但其扩增产物进一步扩增TBX1基因2号外显子时,出现较多非特异性条带.CGH检测中.5例卵裂球用长度250～750 bp的探针检测时,1例失败,1例CGH软件核型分析结果与SRY结果不一致.(2)经MDA的B和D组,均WGA成功;其产物进一步扩增TBX1基因2号外显子时,非特异性条带少.CGH检测中,探针长度为250～750 bp的5例卵裂球均检测成功,且与SRY验证结果一致.(3)用长度为750～2000 bp探针检测时,杂交效果不好.结论 单卵裂球全基因组扩增,MDA较DOP-PCR方法稳定,特异性强,CGH检测中,扩增产物酶切至250～750 bp制备的探针杂交图像均匀、清晰,软件分析核型结果稳定、准确.

Abstract：

Objective To investigate the effect of different amplification methods and probes with various length on the results of comparative genomic hybridization (CGH) analysis of pre-implanted single blastomere and to establish the basis for preimplantation genetic diagnosis.Methods Twenty blastomeres of embryo at 6-8 cells stage were randomly divided into A and B group with 10 in each.Twenty peripheral blood lymphocytes from a healthy man were similarly divided into C and D group with 10 in each.Degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction (DOP-PCR) was used to amplify whole genomic DNA in group A and C,and multiple displacement amplification (MDA) was used in group B and D for whole genome amplification (WGA).The specificity of resultant products was confirmed by amplification of TBX1 gene exon 2.CGH was performed respectively with 250-750 bp and 750-2000 bp probes prepared from the amplified whole genomic DNA.The result of CGH was verified by sex-determining region of Y (SRY).Results (1) Nine of the 10 samples in group A and all in group C were amplifiable by DOP-PCR,but there were multiple non-specific bands in the amplification of TBX1 exon 2 when WGA products were used as templates.When 250～750 bp probe was used in CGH,1 of the 5 blastomeres was failed and another one had different karyotype from that analyzed by SRY.(2) All samples in group B and D were successfully amplified by MDA,and the non-specific bands were significantly less in the amplification of TBX1 exon 2.All 5 blastomeres were successful in CGH with the 250～750 bp probe.Moreover,the karyotype was in agreement with that of SRY.(3) When 750 ～ 2000 bp probe was used,the CGH results were suboptimal.Conclusions In WGA of single blastomere,MDA is superior to DOP-PCR in the stability and specificity.The karyotype image detected by CGH with the 250～750 bp probe is clear and homogenous.     

五重巢式PCR同步检测单细胞杜氏肌营养不良基因和性别的研究

目的 建立五重巢式PCR技术同步检测单细胞DMD基因和性别,探讨该技术在杜氏肌营养不良症的植入前诊断（DMD-PGD）的可行性。方法 获取正常男性、女性单个淋巴细胞和无DMD家庭史的单个胚胎细胞,用五重巢式PCR技术检测DMD基因外显子17、19、44、48和SRY基因。结果 在正常男性单个淋巴细胞扩增成功率为96.7%（145/150）,假阳性率为4%（1/25）,假阴性率为0（0/25）。在正常女性单个淋巴细胞扩增成功率为98%（147/150）,假阳性率为0（0/25）,假阴性率为0（0/25）。15个胚胎细胞扩增成功率为100%（66/75）,假阳性率为0（0/25）。结论 本文建立的单细胞DMD基因外显子17、19、44、48和SRY基因五重巢式PCR技术具有较高的敏感性和特异性,有望应用于DMD-PGD。     

人胚胎活检经Y-特异性DNA扩增决定性别后移植子宫内妊娠成功

目前200多种X染色体伴性遗传病中,产前诊断一般采用绒毛膜绒毛取样或羊膜穿刺术,而后进行细胞、生化或分子遗传学分析或决定性别,如遇问题或为男孩只能终止妊娠。作者采用体外受精方法使采自有X染色体伴性遗传病家族史的妇女卵细胞受精。在分裂至6～8细胞胚胎阶段时抽取一个细胞,应用多聚合酶链反应(PCR)技术进行Y-特异性DNA扩增以确定胚胎性别。 PCR中使Y-特异性重复序列短片段扩增。以不同稀释度的男性DNA为参照,在聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分析,在50个抽取的胚胎细胞中,男、女性各为23个,其余4个性别未确定。两例有遗传肾     

STR-PCR检测孕妇外周血浆中胎儿DNA基因型的初步研究

目的采用短串联重复序列(STR)多态位点的复合扩增方法,研究孕妇血浆中胎儿DNA基因型。方法采用STR多态位点即CSF1PO、TPOX、TH01(简称CTT)三个位点的复合扩增方法,对30例孕妇孕中期的血浆DNA进行扩增,并对扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染后观察结果。结果30例孕中期的孕妇中,16例从母体血浆中检出了父源性等位基因,5例可能检出了胎儿DNA,3例未检出胎儿DNA,6例扩增失败。结论STR多态位点的复合扩增,判断基因型简便、快速,结果容易判断,费用低,可用于父源性遗传病的产前诊断。     

分子生物学技术在植入前诊断中的应用

植入前诊断是产前诊断非常早的一种方法，目的是放弃携带严重遗传病的胚胎，将健康胚胎植入母体。两种主要的方法是聚合酶链反应（PCR）和荧光原位杂交（FISH）。PCR用于单基因病诊断，FISH用于染色体异常诊断。临床主要应用于存在遗传风险的患者如携带单基因病和染色体易位的患者。随着分子生物学技术的飞速发展，如比较基因组（CGH），全基因组扩增技术（WGA），引物延伸预扩增（PEP），间期核转换技术及DNA芯片技术（DNAchip）等PGD先进检测手段的应用，单细胞用于诊断单基因或多基因突变及染色体疾病，为期不远。     

胚胎单个卵裂球人类白细胞抗原基因的检测及意义

单细胞PCR技术用于胚胎植入前单基因遗传疾病的诊断已经取得成功，并且应用于对单个卵裂球人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)基因的检测。本研究探讨单个卵裂球HLA基因的检测方法及意义。     

基因芯片筛查多囊卵巢综合征来源胚胎干细胞分化的脂肪细胞中的差异基因

目的:筛选出与多囊卵巢综合症(PCOS)相关的特异表达基因,以期阐明PCOS的发病机制。方法:将本实验室自主建立的PCOS来源和非PCOS来源的人胚胎干细胞(hESCs)系定向分化成脂肪细胞,应用北京博奥生物有限公司的晶芯?人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片检测不同来源脂肪细胞中的差异基因。结果:PCOS来源和非PCOS来源的人胚胎干细胞均成功诱导分化成了脂肪细胞,共筛选出2种脂肪细胞中的差异表达基因153个,其中PCOS来源脂肪细胞上调表达91个,下调表达62个。挑选上调表达的6个基因进行Real-time PCR验证,与基因芯片检测结果一致。结论:PCOS和非PCOS来源hESCs分化的脂肪细胞在基因表达上有差异,这些差异基因很多涉及糖、脂代谢,并与甾体激素相关,进一步研究后有部分基因可作为PCOS发生、发展的候选基因。     

引物延伸预扩增在β-地中海贫血产前基因诊断中的应用研究

目的探讨孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞(NRBC)经引物延伸预扩增(PEP)后在β-地中海贫血产前基因诊断中应用的可行性。方法以2004年7月至2005年6月在广西医科大学第一附属医院行产前诊断,夫妇均为轻型β-地中海贫血,孕龄9～34周的28例孕妇为研究对象。显微操作获取母血中NRBC,PEP对单个NRBC进行全基因组扩增,短串联重复序列(STR)鉴定所取细胞的来源。证实为胎儿细胞的PEP产物作为模板进行β-珠蛋白基因扩增,反向点杂交确定胎儿β-珠蛋白基因型。结果每例发现NRBC4～13个,约43.6%的NRBC来源于胎儿。单个NRBC经PEP后STR及β-珠蛋白基因扩增成功率分别为100.0%和90.8%。经反向点杂交可鉴定胎儿β-珠蛋白基因点突变类型,与传统的产前诊断结果相比较,符合率为85.7%,误诊率14.3%。结论母血中单个胎儿NRBC经PEP后可以进行产前基因诊断,不仅可以应用于β-地中海贫血,也可应用于其它遗传病,是一条可供尝试的无创性产前诊断途径。     

X-连锁脊柱骨骺发育不良家系孕早期产前诊断一例

2007年本实验室对1例X-连锁脊柱骨骺发育不良家系(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,X-SEDL)进行基因诊断[1],确诊该家系的先证者(图1:I:1)为位于染色体Xp22.2的SEDL基因的4号外显子c.209G＞A突变致病,其女儿(图1:Ⅱ:1)为该致病基因突变携带者(c.209G/A杂合突变).2008年,该女性携带者于妊娠19周时曾在本院对胎儿(图1:Ⅲ:1)采集的羊水细胞进行基因诊断,证实为男性胎儿伴遗传突变基因而引产.此次妊娠11周时要求在孕早期对胎儿(图1:Ⅲ:2)进行产前诊断.签署手术知情同意书后,行绒毛膜穿刺术取绒毛组织.部分绒毛组织标本经常规细胞培养、收获制片后G显带染色体核型分析.部分绒毛组织提取基因组DNA,进行Y染色体性别决定基因(sex determining region of Y chromosome,SRY)检测,判断性别,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)条件参照文献[2].参照相关研究[1]直接PCR扩增SEDL基因4号外显子,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、回收纯化后进行DNA序列分析.同时选择Xp22区域内位于SEDL基因附近的4个短串联重复(shorttandemrepeat,STR)位点(包括DXYS10085、DXYS10092、DXYS10093和DXYS233)进行PCR扩增检测,PCR扩增引物及反应条件见参考文献[3],进行单体型分析.     

超促排卵和体外成熟人卵子中印迹基因H19和PEG1的甲基化状态

目的:探讨超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)和未成熟卵母细胞体外培养(in vitro maturation,IVM)是否引起印迹基因甲基化异常。方法:采用单细胞低熔点琼脂糖包埋亚硫酸氢钠处理、半巢式PCR扩增及克隆测序的方法,检测人单个卵子印迹基因H19和PEG1的甲基化状态。结果:共检测分析了94个(58个来自COH,36个来自IVM)处于不同成熟阶段的卵子中H19基因和PEG1(MEST)基因的甲基化状态,分别有6个COH卵子和2个IVM卵子出现H19或PEG1的1～2个CpG位点甲基化异常。绝大多数COH卵子的H19(91.4%,53/58)和PEG1(91.7%,33/36)的所有检测CpG位点甲基化正常,H19和PEG1所有CpG位点的甲基化率分别为0.8%(8/1044)和99.4%(859/864)。结论:经超促排卵和体外成熟培养卵子的印迹基因H19和PEG1甲基化状态是正常的,1～2个CpG位点甲基化异常的卵子是否导致胚胎的基因印迹异常需进一步研究。