线粒体氧化磷酸化抑制剂FCCP体外对人精子动力学和线粒体功能的影响

目的通过线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)特异性抑制剂FCCP对人精子活动力及其线粒体功能影响的研究,探讨氧化磷酸化在精子能量代谢中的作用。方法选择来自捐精志愿者的正常精液8份,优选后制备精子悬液,将每份精子悬液分为4组,分别与终浓度为0μmol/L(对照组)、2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L的FCCP共孵育1h、3h、5h,以精子动力学参数、线粒体膜电位、精子细胞内ATP含量、精子质膜完整性作为评价指标,分析比较各组间的差异。结果 (1)各组精子活动率和其他各项运动参数随着FCCP浓度增高呈下降趋势:孵育1h后,与对照组相比,仅10μmol/L组的精子活动率、前向运动百分率和精子头侧摆幅度(ALH)显著下降(P0.05),其余指标无显著性变化,而其余浓度处理组的各指标变化均无统计学意义(P0.05);孵育3h后,10μmol/L组的精子活动率、前向运动百分率、平均路径速率(VAP)、直线速率(VSL)、曲线速率(VCL)、ALH和鞭打频率(BCF)均显著降低(P0.05),5μmol/L组的ALH和BCF指标显著下降(P0.05);孵育5h后,与对照组相比,10μmol/L组的前述指标继续显著性下降(P0.05),5μmol/L组的精子活动率和前向运动百分率也出现显著降低(P0.05),而2.5μmol/L组各指标差异均无统计学意义(P0.05)。(2)精子线粒体膜电位(MMP)和ATP含量随FCCP浓度增加逐渐降低,10μmol/L组的MMP和ATP含量显著低于对照组(P0.05)。(3)质膜完整性比较中,10μmol/L组比对照组显著降低(73.94%vs.84.53%)(P0.05)。(4)随着FCCP孵育时间延长,各组精子活动率和前向运动百分率呈下降趋势。结论不同浓度的FCCP体外处理精子后,精子活动率和其他各项运动参数,以及反映线粒体活性的线粒体膜电位和ATP含量呈浓度依赖性下降,FCCP所抑制的线粒体氧化磷酸化是精子能量代谢的重要途径。     

线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone对人精子冻融氧化应激损伤的保护作用

目的:探讨线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone(Mito Q)对冻融人精子的保护作用。方法:选取60份健康生育男性精液标本,每份精液一式6份,不含Mito Q者设为对照组(G0),而G1、G2、G3、G4、G5实验组混合液中分别含有2 nmol/L、20 nmol/L、200 nmol/L、2μmol/L、20μmol/L Mito Q,37℃孵育1 h后检测活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和线粒体膜电位(MMP)变化。选取合适Mito Q浓度B1、B2组用于精子冷冻保存,B0组未添加Mito Q,B1、B2组在精子冷冻保护液中分别含有200 nmol/L和2μmol/L Mito Q,进行冷冻保存,检测冷冻复苏后的ROS水平、MDA含量和MMP改变。结果:新鲜精液添加Mito Q孵育后,G3组和G4组前向运动精子百分率[(30.8±10.2)%和(32.7±13.5)%]和总活动率[(70.6±9.0)%和(70.3±11.9)%]显著高于G0组[(17.6±5.0)%、(54.9±11.5)%](P0.05);随着Mito Q浓度的增加,ROS水平呈下降趋势,G3、G4、G5组(分别为86.5±31.6、93.6±42.0、45.1±15.0)显著低于G0组(160.8±39.7)(P0.05);MDA含量G3、G4组[分别为(0.9±0.5)、(0.9±0.5)μmol/mg]明显低于G0组[(1.9±1.1)μmol/mg](P0.05),而G5组[(1.7±0.7)μmol/mg]不但没有降低,反而显著高于G3、G4组(P0.05);与G0组MMP(1 701±251)相比,G5组(1 156±216)显著降低(P0.05),而G1、G2、G3、G4组(分别为1 810±298、1 995±437、1 950±334、1 582±314)无明显变化。冷冻复苏后各组前向运动精子百分率和总活动率均较新鲜精液明显下降(P0.01),B1组前向运动精子百分率[(3.2±2.3)%]较B0组[(0.8±0.6)%]明显改善(P0.05);B1组精子总活动率[(43.0±9.5)%]较B0组[(26.5±11.4)%]明显改善(P0.05);B1组ROS[(34.6±12.3)]和B2组ROS[(37.0±10.5)]均较B0组[(56.9±14.3)]显著下降(P0.05),B1组MDA[(1.4±0.5)μmol/mg]和B2组MDA[(1.4±0.6)μmol/mg]均较B0组[(2.6±1.0)μmol/mg]显著下降(P0.05),B1组MMP[(1 010.0±131.5)]和B2组MMP[(880.6±128.6)]均显著高于B0组[(721.1±24.8)](P0.05)。结论:在精液冻存液中添加200 nmol/L的Mito Q能有效提高人精子质量,可作为精液冷冻保护添加剂用于精液的冷冻保存。     

左卡尼汀对冷冻精子运动参数和精子线粒体功能的影响

目的:探讨左卡尼汀(LC)对人冷冻精子的影响。方法:将每份供精志愿者精液分为6组:新鲜精液组(FE组);常规冷冻组(Non-LC组,冷冻保护剂中未添加LC); LC 1～4组,冷冻保护剂中LC浓度分别为:1、2. 5、5、10 mmol/L。通过观察冷冻复苏后精子活力和运动参数改变,筛选最佳LC工作浓度。伊红-苯胺黑染色法评估精子质膜完整性(PMI),JC-1法评估精子线粒体膜电位(MMP),DCFH-DA法评估活性氧(ROS),探索LC对精子冷冻损伤的影响机制。结果:与FE组相比,冷冻复苏后精子(Non-LC组和LC各组),前向运动精子百分率(PR%)和运动参数(VAP、VSL、VCL)均明显下降(P 0. 05)。与Non-LC组相比,LC 3组PR%[(47. 0±4. 3)%vs(41. 9±4. 6)%,P=0. 0261)]和VAP [(38. 9±4. 2)μm/s vs (34. 9±2. 6)μm/s,P=0. 0152)]改善明显,确定5 mmol/L为实验最佳LC工作浓度。与FE组比较,Non-LC组冷冻复苏后精子PMI[(52. 7±5. 7)%vs (75. 5±5. 4)%]、MMP[(44. 5±3. 5)%vs(57. 3±4. 4)%]明显降低(P 0. 01),ROS[(12. 5±3. 9)%vs(6. 8±2. 4)%]明显升高(P 0. 01);与Non-LC组比较,LC组精子PMI[(70. 1±8. 2)%]和MMP[(50. 3±3. 4)%]明显升高(P 0. 01、0. 05),ROS[(8. 4±5. 3)%]明显降低(P 0. 05)。结论:LC可能通过降低精子ROS,提高精子MMP,保护精子质膜,改善冷冻后精子活力和运动参数。     

RHO/ROCK信号通路在精子抗冷冻损伤中的作用

目的:探讨RHO/ROCK信号通路在人精子抗冷冻损伤中的作用,为高效精液冷冻保护剂的研制提供理论依据。方法:选取健康精液25份,每份精液分为新鲜组、对照组与RHO通路抑制剂组(抑制剂组)。检测冷冻前后各组精液精子活力、精子存活率、精子膜完整率、正常形态精子百分率、精子DNA碎片指数(DFI)、精子顶体酶活性及精子线粒体膜电位变化;免疫荧光染色检测RHOa/ROCK蛋白在精子中的表达。结果:抑制剂组精液冷冻复苏后精子活力[(57.50±6.83)%vs(51.20±7.70)%,P=0.002]、精子存活率[(60.24±5.53)%vs(52.87±5.07)%,P=0.001]、精子膜完整率[(67.10±4.43)%vs(59.78±5.56)%,P=0.001]、正常形态精子百分率[(7.46±1.28)%vs(4.83±1.11)%,P=0.001]、精子DFI[(18.87±4.07)%vs(27.64±6.64)%,P=0.001]、精子线粒体膜电位(63.11±2.97 vs 56.30±4.28,P=0.001)指标均明显优于对照组;抑制剂组冷冻后精子顶体酶活性与对照组差异无统计学意义(98.30±11.33 vs 97.65±9.31,P0.05)。免疫荧光染色显示RHOa/ROCK蛋白在精子头、颈部广泛表达。结论:RHO/ROCK信号通路在精子冷冻损伤中具有一定作用,抑制其通路活性可明显提高精子抗冷冻损伤的能力。     

高原环境对世居藏族与移居汉族男性精液特征的影响

目的:探讨世居高原藏族和移居高原汉族生育与不育人群精液参数特征,分析高原环境对男性生育力的影响。方法:从不育门诊收集男性不育人群1 563例,其中世居藏族698例,移居汉族865例;生育人群为西藏阜康妇产儿童医院员工,共56例,其中世居藏族33例,移居汉族23例。行精液常规分析、精子DNA完整性检测、外周血生殖激素测定,分别比较世居藏族及移居汉族不育人群生育力特征和生育人群主要精液参数和生殖激素水平。结果:在两组不育人群中,世居藏族较移居汉族人群无精子症、严重少精子症、精液粘稠度异常发病率显著增高(分别为5.87%vs 2.89%、3.15%vs 1.73%,P0.05;43.12%vs 25.89%,P0.01),而精液参数正常者和少精子症、严重弱精子症、严重畸形精子症患者百分率无明显差异(分别为81.08%vs 87.39%、5.44%vs3.93%、4.44%vs 4.04%、4.58%vs 6.59%,P均0.05)。在已育人群中,世居藏族与移居汉族在年龄[(32.42±4.82)岁vs(34.57±6.01)岁]、精子浓度[(143.69±85.74)×106/ml vs(155.11±82.56)×106/ml]、直线运动速度(VSL)[(25.74±3.94)μm/s vs(27.24±3.46)μm/s]、正常形态精子百分率[(8.22±4.35)%vs(7.28±2.46)%]、精子DNA碎片指数(DFI)[(25.49±7.88)%vs(24.52±11.86)%]、TT[(17.97±2.98)nmol/L vs(15.72±6.38)nmol/L]、FSH[(5.51±1.62)IU/L vs(4.17±2.08)IU/L]等方面均无统计学差异(P均0.05);移居汉族男性精子活动率明显高于世居藏族男性[(79.75±14.67)%vs(66.58±17.21)%,P0.05],而曲线运动速度(VCL)[(60.97±2.71)μm/s vs(71.14±82.13)μm/s,P0.05)]、LH[(4.28±1.20)IU/L vs(5.84±1.15)IU/L,P0.05]均较世居藏族低。结论:移居高原汉族人群在习服高原低氧环境过程中,其精子浓度、精子活力等发生适应性改变,且无精子症、严重少精子症等发病率低于世居藏族。     

冷冻保存对人类精子线粒体DNA的影响

目的探讨常规精液冷冻技术对人类精子线粒体DNA的影响。方法收集符合精子库捐精条件的正式志愿者精液样品,将每份样品分为2份:1份进行精液冷冻复苏处理,为实验组;1份新鲜精液,为对照组。采用Markler计数板联合CASA法评估冷冻复苏前后精子活力;两组精液均采用实时荧光定量PCR和长链PCR技术,分别检测精子线粒体DNA的拷贝数和完整性。结果共收集22份精液标本,纳入志愿者年龄为(27.8±3.0)岁,禁欲天数(6.1±0.9)d;精液体积(5.0±1.5)ml,精子浓度(75.8±15.8)×106/ml,前向运动精子百分比为(68±6)%,总活动精子复苏率为(72±8)%。冷冻保存后,精子活力显著降低:前向运动精子百分比减少[(49.0±6.5)%vs.(68.0±6.1)%,P0.05),平均路径速率(VAP)[(35.8±6.8)vs.(46.8±9.5),P0.05]、直线速率(VSL)[(27.3±3.3)vs.(35.1±8.3),P0.05]和曲线速率(VCL)[(57.6±6.9)vs.(91.8±10.2),P0.05]较前下降。与新鲜精液相比,冷冻复苏后精子的线粒体DNA拷贝数显著增加[(10.12±8.41)vs.(5.66±5.53),P0.05],完整性比较无统计学差异[(29.69±15.04)vs.(32.78±16.0),P=0.077]。结论在正式捐精志愿者人群内,常规精液冷冻技术降低精子活力,增加人类精子mtDNA的拷贝数,但未显著改变mtDNA的完整性。     

亚临床型精索静脉曲张患者精浆NO浓度与精子活力关系

目的 探讨亚临床型精索静脉曲张(SVC)精浆一氧化氮(NO)浓度与精子活力的关系.方法 选择亚临床型精索静脉曲张患者35例为实验组,同时选择正常健康男性35例作对照组.采用计算机辅助精液分析技术测定各组精子活力,采用硝酸还原酶法测定精浆中NO浓度.结果 ①实验组精浆中NO浓度为52.19±17.12μmol/L,对照组精浆中NO浓度为38.06±6.43 μmol/L,实验组明显高于对照组,两者比较差异具有统计学意义(P＜0.05).②实验组精浆中NO水平与精子活力水平呈负相关性,具有统计学意义(P＜0.05).结论 亚临床型精索静脉曲张患者精浆中NO浓度增高,并在一定范围内与精子活力呈负相关.     

乙肝病毒对人精液参数和精子DNA完整性的影响

目的:探讨精液中乙肝病毒存在对精液参数和精子DNA完整性的影响。方法:采用实时荧光定量PCR技术对153例血清乙肝表面抗原阳性患者精液进行乙肝DNA定量检测,采用精子染色质扩散法检测精子DNA损伤指数(DFI),对比分析精液HBV DNA阳性组(A组,n=43)与阴性组(B组,n=110)精液参数包括精液体积、精子浓度、存活率、前向运动精子百分率、平均直线速率(VSL)、平均路径速率(WAP)结果,以及HBV DNA拷贝数与精子DNA损伤指数的关系。结果:乙肝感染者精液HBV DNA检出率为28.1%(43/153);两组年龄、精液体积、精子浓度无统计学差异(P>0.05),A组精子存活率显著低于B组[(51.4±17.1)%vs(58.0±18.8)%,P>0.05],前向运动精子率显著低于B组[(24.5±10.1)%vs(29.6±13.3)%,P>0.05],VSL显著低于B组[(19.9±4.5)μm/s vs(23.7±4.0)μm/s,P<0.01],WAP显著低于B组[(23.4±5.3)μm/s vs(26.5±7.0)μm/s,P<0.01];A组精子DNA碎片指数显著高于B组[(24.2±9.4)%vs(19.3±8.0)%,P<0.01];精液中HBV DNA拷贝数与精子DNA碎片指数呈正相关(r=0.819,P<0.01)。结论:精液中HBV DNA存在对精子数量尚未构成显著影响,但可能改变一些精液参数,包括精子活力和运动速度以及精子DNA完整性,精液中乙肝病毒载量和精子DNA损伤之间呈现病毒载量-效应关系。     

中频穴位电刺激联合他莫昔芬片治疗少弱精子症患者的临床研究

目的:探讨中频穴位电刺激联合他莫昔芬片治疗少弱精子症的临床效果及其可行性与安全性。方法:120例少弱精子症患者随机分为他莫昔芬片口服治疗组(他莫昔芬组)、中频穴位电刺激治疗组(穴位电刺激组)与联合治疗组,每组40例。连续治疗8周,记录各组治疗前后的精液体积、精子总数及浓度、总活力、前向运动(PR)精子百分率及血清生殖激素(FSH、LH、T)水平,对比分析3组患者治疗前后的精液参数及生殖激素水平。结果:所有患者均完成本研究,治疗前后3组精液体积无明显改善(P0.05)。与治疗前对比,3组均可改善生殖激素(FSH、LH、T)水平(P0.05);他莫昔芬组可以显著提高精子总数[(42.65±5.78)×10~6vs(25.16±2.05)×10~6,P0.05]及精子浓度[24.31±2.59)×10~6/ml vs(12.15±2.51)×10~6/ml,P0.05],而精子总活力及PR精子百分率无明显改善[(22.61±5.75)%vs(21.78±8.81)%;(16.76±5.86)%vs(15.87±7.81)%,P均0.05];穴位电刺激组可以增加精子总活力率[(32.43±4.97)%vs(24.81±8.27)%,P0.05]及PR精子百分率[(27.17±5.09)%vs(19.71±9.15)%,P0.05],而精子总数及精子浓度无明显改善[(25.87±4.96)×10~6vs(23.23±3.14)×10~6;(14.12±2.47)×10~6/ml vs(11.27±2.24)×10~6/ml,P均0.05];联合治疗组不仅可以提高精子总数[(51.14±3.69)×10~6vs(26.17±5.05)×10~6,P0.05]及精子浓度[(27.28±1.98)×10~6/ml vs(12.78±2.41)×10~6/ml,P0.05],而且可以显著提高精子总活力[(37.12±5.33)%vs(23.89±9.05)%,P0.05]及PR精子百分率[(31.09±7.12)%vs(17.14±8.04)%,P0.05],并且显著优于他莫昔芬组和穴位电刺激组(P0.05)。联合治疗组总有效率(97.5%)显著高于他莫昔芬组(72.5%)和穴位电刺激组(75.0%),P0.05。结论:中频穴位电刺激联合他莫昔芬片口服可以明显改善特发性少弱精子症患者的精液质量和生殖激素水平,有一定的临床推广意义。     

4G手机射频电磁辐射阴囊暴露对成年大鼠生精能力和血-睾屏障的影响

目的:探讨4G手机射频电磁辐射阴囊暴露对成年大鼠睾丸的直接影响。方法:30只SD大鼠随机分为对照组及暴露组,建立阴囊局部暴露模型,暴露组接受6 h/d的辐射,共150 d。分析精液质量和生精上皮变化;检测抗氧化酶-过氧化物水平及血-睾屏障蛋白的表达。结果:与对照组相比,暴露组精子浓度(6.39±0.82 vs 4.74±0.87)(×10~7/ml)、活率(62.11±8.82 vs 41.44±7.33)(%)、总活力(55.71±7.39 vs 36.22±6.36)(%)及正常形态精子百分率(84.89±5.11 vs 70.78±8.11)(%)明显降低(P0.05);暴露组Johnsen评分明显减低(8.38±0.98 vs 6.11±1.56,P0.05),Coentino评分明显增高(1.36±0.21 vs 1.81±0.34,P0.05);暴露组MDA水平明显上升(P0.05),SOD、GSH及CAT水平明显下降(P0.05);暴露组Occludin、ZO-1、CAR及N-Cadherin水平显著降低(P0.05)。结论:4G手机射频电磁辐射阴囊局部暴露可直接导致成年睾丸损伤、血-睾屏障紊乱及精子质量下降,造成大鼠生育力下降。