利用3D打印高通量观察斑马鱼肾小球滤过膜损伤

目的:使用桌面3D打印机制备兼容微孔板和平皿的斑马鱼定向工具,用于观察分析斑马鱼足细胞损伤后表型。方法:构建足细胞特异性表达硝基还原酶(NTR)的转基因斑马鱼Tg(pod:Gal4;UAS:NTR-mCherry),NTR/MTZ(甲硝唑)系统特异性诱导足细胞损伤,破坏肾小球滤过膜;应用Open SCAD软件设计模具的3D模型,打印材料为丙烯腈-丁二烯-苯乙烯;结合3D模具和全自动体式显微镜对足细胞特异性损伤斑马鱼进行高通量筛查,对水肿比例和严重程度,蛋白尿程度进行定量分析。结果:桌面3D打印机制备的模具在微孔板或平皿内的琼脂凝胶中形成腔室,可排列48或96个斑马鱼胚胎样本。狭长的微腔确保斑马鱼胚胎方向和体位一致且不易移动。全自动显微镜获取排列在微腔内斑马鱼胚胎的侧面和背面视图,易于观察分析斑马鱼形态、荧光分布和强度。结论:本研究应用3D打印机制备模具,高通量定位观察斑马鱼水肿率和蛋白尿表型,是斑马鱼肾脏功能研究的有效工具。     

远志皂苷调控miR-325-5p/GADD45B对高糖诱导小鼠足细胞损伤的影响及其机制

目的 探讨远志皂苷(TEN)对高糖诱导的小鼠肾脏足细胞MPC5损伤的影响及分子作用机制。方法 将MPC5细胞分为正常对照(NG)组、高糖刺激(HG)组、TEN低中高3个浓度实验组,NG组用5 mmol/L D-葡萄糖处理,HG组用30 mmol/L D-葡萄糖处理,实验组用低中高(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)TEN进行处理,实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)检测MPC5细胞中miR-325-3p和GADD45BmRNA的表达,Western印迹检测GADD45B、podocin和nephrin蛋白表达,流式细胞术测定细胞凋亡率,双荧光素酶报告系统验证miR-325-3p与GADD45B的关系。结果 TEN可使高糖诱导的小鼠足细胞MPC5中miR-325-3p、podocin、nephrin和B细胞淋巴瘤(Bcl)-2含量显著升高(P<0.05),GADD45B、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达量及细胞凋亡率显著降低(P<0.05),抑制高糖诱导的小鼠足细胞MPC5损伤和凋亡;miR-325-3p靶向负调控GADD45B的表达;...     

斑马鱼抗podocin抗体的制备、鉴定及在足细胞损伤模型中的应用

目的:利用合成的podocin多肽制备针对斑马鱼podocin的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用于斑马鱼足细胞损伤研究中。方法:(1)设计、合成斑马鱼podocin抗原多肽,将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰大白兔制备抗血清,protein A亲和纯化得到抗podocin多克隆抗体;(2)ELISA和免疫组化检测抗体效价及组织特异性;(3)构建足细胞特异性表达硝基还原酶(NTR)的转基因斑马鱼Tg(pod:Gal4;UAS:NTR-m Cherry),NTR/MTZ(甲硝唑)系统特异性地诱导足细胞损伤;用podocin反义寡核苷酸阻断正常斑马鱼胚胎podocin mRNA的翻译过程,利用抗podocin抗体对上述两种疾病模型进行免疫荧光染色以验证合成的podocin抗体能否应用于斑马鱼足细胞研究中。结果:(1)化学合成的多肽纯度为92.6%,达到免疫用抗原标准;(2)ELISA和免疫组化染色结果表明抗体效价分别达1∶5.12×105和1∶106;(3)免疫荧光染色表明无论在斑马鱼前肾还是中肾,podocin均特异性地表达于足细胞,且沿着毛细血管袢呈连续、线性分布,表明抗体具有良好的组织特异性;(4)MTZ诱导足细胞损伤24h后见podocin呈粗糙的颗粒状分布,48h后阳性表达面积占整个肾小球面积比值明显下降;(5)显微注射podocin反义寡核苷酸的斑马鱼胚胎出现心包水肿、体轴弯曲的表型,第3天时几乎无Podocin表达,随后逐渐恢复至正常,第5天时表达与正常组无异。结论:所制备的斑马鱼抗podocin抗体效价高、组织特异性强,能够反应足细胞损伤情况,是斑马鱼足细胞研究的有力工具。     

T细胞来源的细胞外囊泡通过miR-193a诱导足细胞损伤

目的:探讨T细胞来源的循环细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)中miR-193a在局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者足细胞损伤中的作用。方法:收集经肾活检确诊的FSGS患者和健康志愿者外周血,分离EVs。芯片和RT-PCR筛选出患者EVs中升高的microRNA(miRNA),再经体外足细胞试验,选出能导致足细胞骨架改变的miRNA。用目标miRNA转染T细胞系(Jurkat细胞),获得富集目标miRNA的EVs。给予Balb/c小鼠尾静脉注射Jurkat细胞EVs,测定尿蛋白/肌酐;用Jurkat细胞来源的EVs与足细胞共孵育,检测细胞骨架改变。验证miR-193a损伤足细胞的分子机制。结果:FSGS患者外周血EVs中miR-193a水平明显上调,并能导致足细胞骨架损伤。FSGS患者循环EVs可导致小鼠蛋白尿和足细胞骨架结构紊乱。富含miR-193a的Jurkat细胞EVs通过下调WT1,导致足细胞骨架结构损伤、诱导小鼠产生蛋白尿和足细胞足突融合。结论:本研究发现FSGS患者循环中T细胞来源的EVs通过miR-193a可诱导足细胞损伤。     

双月安环己烷草酸铂对肝癌细胞DNA损伤修复基因表达影响及其机制

目的 初步明确肝癌细胞中特异性表达缺失的DNA损伤修复基因（GADD45β）近端启动子序列，并探索双月安环己烷草酸铂（Oxaliplatin）对人肝癌细胞HepG2中GADD45β基因表达影响及可能机制。方法 以30～50个碱基间隔体外人工合成GADD45β近端启动子序列（-547至-436），分别插入pGL3 basic荧光素表达质粒的荧光素基因上游，以电穿孔法转染HepG2，根据启动子活性强度结合TRANSFAC数据库分析可能存在的转录调节因子结合位点；以Northern印迹和实时荧光定量PCR比较Oxaliplatin作用前后HepG2细胞GADD4513表达，并在此基础上进一步比较Oxaliplatin对GADD45β启动子活性的诱导作用。结果 GADD45β近端启动子中含有E2F1（-470／-436）和核因子（NF）-κB（-547／-520）转录调节因子与启动子结合位点，并可能存在“抑制区”。Oxaliplatin能明显诱导HepG2中GADD45β表达，并呈剂量效应正相关关系，同时Oxaliplatin能相应诱导E2F-1启动子活性。结论 Oxaliplatin能明显诱导肝癌细胞中特异性缺失的GADD45β基因表达，增强转录调节因子E2F-1的表达水平是其可能的作用机制。     

基于硝基还原酶/甲硝唑系统构建斑马鱼急性肾损伤模型

目的:建立斑马鱼急性肾损伤模型,用于急性肾损伤相关分子机制、肾脏再生和药物筛选等研究。方法:(1)基于硝基还原酶/甲硝唑(NTR/MTZ,Nitroreductase/Metronidazole)系统,分别构建转基因斑马鱼Tg(enpep:Gal4)和Tg(UAS:NTR-mCherry);(2)利用MTZ诱导双转基因斑马鱼幼鱼Tg(enpep:Gal4;UAS:NTRmCherry)肾小管上皮细胞损伤,分别观察幼鱼水肿率,肾小管红色荧光强度,通过原位杂交检测近端小管分子标志物slc20a1a表达水平,经心脏显微注射10KD FITC-Dextran检测近端小管重吸收功能,扫描透射电镜检测近端小管超微结构。结果:(1)转基因鱼Tg(enpep:Gal4)和Tg(UAS:NTR-mCherry)构建成功,可在双转基因斑马鱼幼鱼Tg(enpep:Gal4;UAS:NTR-mCherry)受精后30h观察到肾小管中特异性表达红色荧光mCherry,呈现连续性分布于肾小管;(2)随着MTZ处理剂量的提高,胚胎心包水肿和身体水肿率逐步上升;(3)原位杂交结果显示近端小管分子标志物slc20a1a表达减弱甚至消失,近端小管重吸收功能下降甚至丧失,肾小管超微结构显示肾小管上皮细胞正常形态破坏,刷状缘脱落,管腔中可见微管结构。结论:基于NTR/MTZ系统的斑马鱼急性肾损伤模型构建成功,可用于急性肾损伤相关分子机制、肾脏再生和药物筛选等研究。     

局灶节段性肾小球硬化患者足细胞病变的临床病理特征

目的:探讨局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者肾小球足细胞病变与蛋白尿,肾脏病变进展及对激素治疗反应之间的关系.方法:26例经肾活检明确诊断的原发性FSGS,对照组各选取微小病变(MCD),系膜增生性病变(MsP)9例,并观察4例FSGS病变重复肾活检患者.采用间接免疫荧光双套色方法对所有患者肾活检组织分别进行WT1、CR1、GLEPP1和Ⅳ型胶原α3链的双重染色,激光共聚焦显微镜采集图像,对肾小球足细胞进行密度定量并与相关指标进行观察分析.结果:①双套色清晰显示足细胞与基膜的空间位置,足细胞特异性表达WT1、CR1、GLEPP1.②FSGS组患者非硬化肾小球足细胞三种标记物染色均有不同程度的缺失,WT1、CR1、GLEPP1染色节段丢失比率显著高于MCD组与MsP组(P＜0.05);足细胞密度和肾组织病理类型相关,FSGS组足细胞密度显著低于MCD组与MsP组(P＜0.05).③经典型和脐部型FSGS两组足细胞标志物染色节段丢失比率及足细胞密度无差异.④FSGS组患者足细胞密度与尿蛋白、肾功能无相关性.激素治疗缓解组足细胞密度显著高于激素治疗无效组(P＜0.05).⑤对4例重复肾活检肾组织WT1、CR1、GLEPP1表达的观察表明,三种标记物表达的缺失程度和肾小球病变严重程度密切相关.结论:FSGS组患者均伴不同程度肾小球足细胞损伤,病理改变越重足细胞病变越明显.足细胞WT1、CR1、GLEPP1表达与肾小球病变的严重程度密切相关,表达缺失严重者激素治疗反应差.     

Toll样受体9在嘌呤霉素氨基核苷导致足细胞损伤中的作用

目的:我们发现Toll样受体9(TLR9)在嘌呤霉素氨基核苷(PAN)处理的足细胞中上调。本研究试图确定TLR9是否参与PAN对足细胞的损伤作用。方法:(1)用PAN诱导体外培养的足细胞损伤模型,以定量逆转录PCR(qRT-PCR)和Western Blot检测足细胞TLR9及该通路其他组分的变化。同时,利用流式细胞术检查足细胞凋亡情况。用PAN诱导大鼠足细胞损伤,以qRT-PCR和免疫组化法检测大鼠肾小球中TLR9表达变化。(2)将TLR9干扰RNA(siRNA)表达质粒和对照质粒分别转染足细胞,用Western Blot检测比较核因子κB(NF-κB)p65和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化、qRT-PCR比较白细胞介素12(IL-12)的mRNA变化,流式细胞仪比较足细胞凋亡情况。结果:(1)与对照组相比,经PAN刺激的足细胞,其TLR9、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、IL-12的mRNA水平明显上调,磷酸化p65和磷酸化p38显著增加,细胞凋亡增加。PAN大鼠模型的肾小球中TLR9 mRNA表达上调,免疫组化显示TLR9蛋白显著增加。(2)足细胞转染TLR9干扰质粒后,TLR9的mRNA和蛋白表达水平降低;而经PAN处理后,该细胞与转染对照siRNA的细胞相比,其磷酸化p65和磷酸化p38的水平降低,IL-12 mRNA表达降低,足细胞凋亡减少。结论:TLR9信号通路参与了PAN诱导的足细胞损伤过程,其机制可能是促进炎症因子产生及p38 MAPK依赖的细胞凋亡。     

microRNA-30抑制血管紧张素Ⅱ诱导足细胞损伤的机制

目的:探讨microRNA-30(miR-30)缓解血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)所致足细胞损伤的分子机制。方法:(1)通过皮下埋置渗透压泵,给予小鼠AngⅡ[1 000 ng/(kg·min)×28d]构建肾损伤模型。利用原位杂交及qRT-PCR技术检测小鼠肾小球中miR-30s的表达,运用免疫组化及蛋白印迹检测calcineurin信号重要分子细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6),钙调磷酸酶(PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1)及活化T细胞核因子(NFATC3)表达。(2)给予miR-30s慢病毒尾静脉注射,观察其对AngⅡ诱导损伤模型的肾脏保护作用。(3)体外研究观察miR-30a高表达能否抑制AngⅡ(10-6mol/L)诱导的足细胞骨架损伤和足细胞凋亡。结果:(1)AngⅡ诱导小鼠肾小球中miR-30s水平下调,并上调TRPC6,激活calcium/calcineurin信号通路;(2)高表达的miR-30s能够抑制AngⅡ导致的calcium/calcineurin信号活化从而缓解AngⅡ诱导的肾小球损伤;(3)miR-30s能够逆转AngⅡ所致足细胞骨架损伤及抑制其凋亡过程。结论:miR-30s具有抑制AngⅡ诱导的足细胞损害作用,其机制可能与抑制calcium/calcineurin信号通路有关。     

足细胞研究进展

足细胞是肾小球滤过屏障重要组成部分。足细胞损伤是肾小球疾病发生发展的关键环节,是导致蛋白尿、肾小球硬化及肾功能进行性恶化的病理生理基础。局灶节段性肾小球硬化(FSGS)和微小病变(MCD)主要表现为肾小球足细胞病变。足细胞损伤机制和靶向治疗一直是肾小球疾病研究的热点,本文将综述足细胞基因组、转录组研究进展和新发现的足细胞损伤相关基因,重点阐释足细胞损伤机制研究进展。     

生长阻滞和DNA损伤诱导基因153在慢性缺氧诱导心肌细胞凋亡中的表达

目的研究慢性缺氧诱导心肌细胞发生凋亡的情况,探讨生长阻滞和DNA损伤诱导基因(CHOP/GADD153)蛋白表达变化与心肌细胞凋亡的关系。方法将体外培养的心肌细胞置于95%N_2/5%CO_2混合气体培养箱内进行慢性缺氧处理,随机将心肌细胞分为对照组及缺氧6、12、24、48、72 h组。采用流式细胞术及DNA梯度技术检测心肌细胞凋亡情况.RT-PCR检测CHOP/GAD153 mRNA水平变化,western blot检测细胞凋亡过程中CHOP/GADD153蛋白表达变化。结果缺氧6 h组心肌细胞出现典型的凋亡特征;与对照组比较,缺氧12、24、48、72 h组心肌细胞凋亡数量明显增多(P<0.05):CHOP/GADD153 mRNA和蛋白表达水平也明显增加(P<0.05)。结论慢性缺氧可诱导心肌细胞发生凋亡,CHOP/GADD153可能参与了慢性缺氧诱导心肌细胞凋亡的信号传导通路。     

局灶节段性肾小球硬化的发病机制

局灶节段性肾小球硬化(FSGS)是由多种病因引起的,以肾小球节段硬化为病理特征的一组疾病.临床主要表现为蛋白尿,并逐步进展为慢性肾功能不全.FSGS早期虽然肾小球硬化较局限,但存在广泛足突融合,提示足细胞是损伤的主要靶细胞.     

调控核因子E2相关因子2信号干预足细胞损伤的体外研究

目的:观察增强核因子E2相关因子2(Nrf2)信号对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导足细胞损伤的保护作用并研究其保护机制。方法:PAN刺激体外培养的足细胞24h,建立足细胞损伤模型。甲基巴多索隆(CDDO-Me)用于激活Nrf2。将足细胞随机分为正常组、PAN组(PAN 100μg/ml)、CDDO-Me对照组(CDDO-Me 100 nmol/ml)、CDDO-Me保护组(PAN 100μg/ml+CDDO-Me 100 nmol/L);免疫荧光及Western-blot方法检测足细胞Nrf2的入核情况和表达。qRT-PCR检测Nrf2的靶基因血红素加氧酶(HO-1),醌氧化还原酶1(NQO1)及促炎细胞因子[白细胞介素1(IL-1)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)]的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:CDDO-Me可显著上调足细胞转录因子Nrf2表达及入核,刺激Nrf2下游靶分子NQO-1和HO-1转录。Nrf2激活可拮抗PAN诱导的足细胞凋亡,抑制PAN诱导的炎症因子IL-1和TNF-a上调。Nrf2siRNA显著抑制足细胞Nrf2表达。Nrf2表达下调后,CDDO-Me干预PAN诱导的足细胞凋亡和炎症因子产生的作用受到抑制。结论:Nrf2信号通路活化可抑制足细胞损伤。     

蛋白尿为主要表现的肾损伤患者肾小球TRPC6和ILK的表达及作用机制

目的探讨以蛋白尿为主要表现的肾损伤患者肾小球瞬时受体电位阳离子通道(TRPC6)和整合素连接激酶(ILK)的表达及作用机制。方法行肾脏穿刺活检且24 h尿蛋白1 g的患者肾组织标本共25例。免疫组化染色观察TRPC6、ILK在肾小球中的表达和分布情况。体外培养人原代肾足细胞,10~(-7)mol/L的阿霉素诱导足细胞12、24、36 h至其损伤,Western印迹检测TRPC6、ILK蛋白情况。使用脂质体2000将pc DNA3.1-TRPC6质粒、pc DNA3.1分别转入足细胞建立TRPC6过表达组、阴性对照组,仅加脂质体2000的为空白对照组,检测转染48 h各组TRPC6、ILK蛋白情况。结果 TRPC6多表达于足细胞,除高血压肾损伤组织外,其余类型肾损伤TRPC6表达强度均明显高于正常肾组织(P0.05);ILK多表达于足细胞和系膜区,局灶节段性肾小球硬化症、狼疮性肾炎、糖尿病肾病的肾小球中ILK表达强度均明显高于正常肾组织(P0.05)。体外阿霉素诱导24、36 h时TRPC6、ILK蛋白表达水平均明显高于正常对照组(P0.05)。TRPC6过表达组足细胞ILK蛋白相对表达量明显高于阴性对照组和空白对照组(P0.05)。结论蛋白尿为主要表现的肾损伤患者肾小球中TRPC6、ILK的表达水平升高,尤其是局灶节段性肾小球硬化症和糖尿病肾病。上调足细胞TRPC6表达可提升ILK表达,二者共同参与足细胞损伤。     

线粒体分裂相关蛋白高表达参与阿霉素大鼠肾病模型蛋白尿的发生

目的:探讨肾小球线粒体动力相关蛋白1(Drp1)、P-Drp1(Ser616)和线粒体分裂蛋白1(Fis1)表达与足细胞损伤及蛋白尿发生的关系。方法:建立阿霉素大鼠肾病模型,用免疫组化和western blot检测肾小球和肾皮质Drp1、P-Drp1(Ser616)及Fis1的表达,分析上述蛋白表达与蛋白尿及足细胞线粒体形态的相关性。在小鼠足细胞系MPC5过表达Drp1,分析对凋亡和线粒体形态的影响。结果:肾小球和肾皮质Drp1在阿霉素大鼠肾病模型4周和6周时表达增强,肾小球P-Drp1(Ser616)在6周时表达增强,肾小球Fis1在2周和6周时增强。肾小球和肾皮质Drp1、肾小球P-Drp1(Ser616)和Fis1表达与24h尿蛋白正相关。肾小球Drp1表达量与足细胞线粒体胞浆密度和线粒体细胞密度呈负相关。肾小球P-Drp1(Ser616)与足细胞线粒体最大长宽比呈负相关。肾小球Fis1与足细胞线粒体面积和周长呈负相关。过表达Drp1致小鼠足细胞凋亡显著增多,线粒体片段化。结论:肾小球Drp1、P-Drp1(Ser616)与Fis1高表达参与阿霉素大鼠肾病模型蛋白尿的发生,Drp1高表达致线粒体片段化和足细胞凋亡。     

局灶节段性肾小球硬化患者肾小管上皮细胞白细胞介素13受体表达与组织损伤的关系

目的:FSGS以足细胞损伤为突出特点,但肾小管上皮细胞损伤在这类患者很常见,而且蛋白尿的程度不足以解释其原因.由于足细胞和肾小管上皮细胞分享许多共同的分子,因此我们推测,这可能是导致FSGS状态下足细胞和肾小管上皮细胞同时损伤的分子基础.有关研究显示,IL-13可以通过作用于足细胞膜上的IL-13R,导致足细胞的损伤.本研究对FSGS患者肾小管上皮细胞IL-13R表达和分布情况进行观察,以期对上述问题加以探讨. 方法:选择肾活检明确诊断的特发性FSGS(n=41)患者,并排除继发性因素.对照选取伴大量蛋白尿的IgA肾病(IgAN,n=11)和膜性肾病(MN,n=10)患者.正常对照选择肾移植供体(n=5).FSGS患者小管间质病变分为:"正常"、急性病变、急性+慢性病变、慢性病变.IL-13R和RANTES染色采用间接免疫荧光法.IL-13R表达分布和强度采用评分方法.IL-13R与N-cadherin免疫荧光双标观察IL-13R在小管上皮细胞的分布. 结果:正常对照组近端肾小管上皮细胞表达IL-13R,但分布局限,而且强度弱.疾病对照组仅少数肾小管上皮细胞可见中等量IL-13R表达,但强度较弱.FSGS患者近端肾小管上皮细胞IL-13R表达总评分≥4的比例明显高于正常对照和疾病对照.小管间质‘正常'的患者IL-13R表达总评分均≥ 4,分布于小管的基底和侧面细胞膜.小管间质急性病变患者IL-13R表达总评分≥ 4比例为88.9%,分布于基底和侧面细胞膜.小管间质急性+慢性病变患者IL-13R表达总评分≥ 4比例为50.0%,分布于基底和侧面细胞膜,以基底面为主.小管间质慢性病变患者IL-13R表达很少,IL-13R表达总评分均≤2,主要分布于基底面细胞膜.FSGS患者IL-13R高表达的小管上皮细胞同时表达趋化因子RANTES,而且上皮细胞标志物N-cadherin表达减少. 结论:首次证实人肾活检组织近端小管上皮细胞表达IL-13R.FSGS患者近端小管上皮细胞IL-13R表达的范围和强度高于具有同等程度蛋白尿的IgAN和MN患者.FSGS患者小管IL-13R的表达范围和强度与肾小管病变性质相关.FSGS患者IL-13R的表达增强启动了小管上皮细胞的损伤过程.本研究表明,FSGS患者肾小管上皮细胞IL-13R高表达参与肾小管间质的损伤,而且有助于进一步探讨FSGS患者足细胞与肾小管上皮细胞损伤的共同分子基础.     

Diplacone通过抑制氧化应激作用及NF-κB信号通路活性降低Hcy诱导的血管内皮细胞损伤

目的采用高同型半胱氨酸血症(HHcy)诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),建立血管内皮细胞炎性损伤模型,通过Diplacone预处理,在之前实验的基础上进一步探讨Diplacone对血管内皮细胞可能的保护作用机制。方法以HUVEC为研究对象,经过不同浓度的Diplacone预孵育2 h后,加入2 mmol/L同型半胱氨酸(Hcy)继续处理12 h,流式细胞术检测细胞凋亡率;通过检测活性氧(ROS)细胞比率和抗氧化指标超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及MDA含量的变化反应细胞氧化应激水平。Western blot和qRTPCR检测核因子κB(NF-κB)蛋白和mRNA表达水平的变化。结果与对照组比较,2 mmol/L Hcy模型组细胞凋亡率显著增加,ROS细胞比率和MDA含量显著升高,抗氧化指标SOD、GSH-Px的活性显著降低,NF-κB的蛋白和mRNA表达水平逐渐升高。与2 mmol/L Hcy模型组比较,0.1～10μmol/L Diplacone预处理后细胞凋亡率逐渐降低;氧化应激指标ROS细胞比率和MDA含量降低,抗氧化指标SOD、GSH-Px的活性增加; NF-κB的蛋白和mRNA表达水平逐渐降低。结论 Diplacone具有抑制Hcy诱导的HUVEC内皮损伤的作用,且作用机制可能是通过降低氧化应激作用和抑制NF-κB信号通路活性而降低细胞凋亡率,抑制细胞凋亡。     

局灶节段性肾小球硬化患者足细胞钙神经蛋白的表达

目的:观察成人局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)患者足细胞钙神经蛋白的表达并探讨其意义。方法:选取临床表现为肾病综合征且经肾活检确诊的成人特发性FSGS63例,微小病变(minimal change disease,MCD)24例和肾移植供肾组织10例作为对照。免疫组化法检测肾组织钙神经蛋白A(CnA)异构体α、β、γ的表达。免疫荧光法行肾组织CnAα和synaptopodin双标记,并采用胶体金免疫电镜对肾小球CnAα的表达定位。两位病理医生分别盲法评分染色结果。结果:供肾组织肾小球CnAα、β、γ免疫组化染色均阴性,肾小管CnAα、β微弱表达,CnAγ阴性。26例FSGS患者肾小球足细胞CnAα表达上调,其阳性率为41.27%;而MCD患者肾小球CnAα阴性(P0.01);两者肾小球CnAα、β、γ染色均阴性。足细胞CnAα阳性患者肾小管损伤指标尿视黄醇结合蛋白[20.91(0.17～54.37)mg/L]、血清肌酐[(128.18±56.58)μmol/L]高于阴性患者(P0.05);两者间病理类型构成差异存在统计学意义(P0.01);而年龄、性别、尿蛋白、尿N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、血清白蛋白及胆固醇无统计学差异。塌陷型、细胞型、顶部型、门周型FSGS中足细胞CnAα阳性病例分别为5例(83.33%)、10例(66.67%)、8例(61.54%)、3例(20%),14例经典型FSGS患者均阴性。多因素Logistic回归分析示血清肌酐(OR4.855,P0.01)、塌陷型(OR11.069,P0.05)为FSGS患者足细胞CnAα过表达的主要相关因素。69.23%足细胞CnAα阳性患者肾小球syanptopodin表达减弱且不连续。结论:本研究首次发现部分FSGS患者足细胞上CnAα表达增强,这可能参与了FSGS的发病。FSGS与MCD患者足细胞CnAα的表达差异,提示二者发病机制不同。对临床怀疑FSGS而未见明确节段病变的患者,足细胞CnAα阳性有助于诊断。     

糖尿病肾病患者足细胞病变的临床病理特征

目的：研究2型糖尿病肾病患者肾小球足细胞病变，分析其与血糖控制、蛋白尿、肾功能及肾组织病理形态学改变之间的关系。方法：27例经肾穿刺活检明确诊断的2型糖尿病肾病。肾组织病理定量计数肾小球足细胞数。借助足细胞特定标志物WTl与肾小球基膜Ⅳ型胶原α3链(C—Ⅳα3)双套色荧光染色，用激光共聚焦荧光显微镜对肾小球足细胞进行准确的密度定量分析。结果：糖尿病肾病患者无论临床表现为微量白蛋白尿、蛋白尿(尿蛋白＜3．5g/24h)，还是大量蛋白尿(尿蛋白＞3．5g/24h)，均伴肾小球足细胞数目及密度的减少，其中以大量蛋白尿组最为显著，蛋白尿组次之，微量白蛋白尿组最轻。足细胞数目及其密度与尿蛋白量呈显著负相关(P＜0．01)。足细胞数目的减少还与肾小球病理改变相关，表现为肾小球K—W结节病变者其足细胞数明显少于肾小球弥漫系膜增生性病变者(P＜0．01)。此外，足细胞数减少严重者肾小球硬化以及血清肌酐水平升高的发生率均明显增高。结论：糖尿病肾病患者早期就表现出肾小球足细胞数目及其密度的减少，随着病变加重，这种变化愈发明显。足细胞病变不仅导致大量蛋白尿的发生，而且还与肾小球硬化和肾功能损伤的发生有关。     

SB431542对高糖环境中小鼠足细胞Cdk5/p35表达的影响

目的应用SB431542及Roscovitine处理高糖培养的足细胞,观察抑制转化生长因子(TGF)-β1通路对高糖培养足细胞中Cdk5/p35表达的影响及抑制Cdk5激酶活性对高糖和TGF-β1诱导足细胞凋亡的影响。方法采用不同浓度SB431542(0.1,1.0,10μmol/L)处理高糖培养的足细胞,Western印迹法及RT-PCR技术检测各处理组Cdk5及p35蛋白和mRNA的表达变化情况。应用流式细胞术检测Roscovitine对高糖及TGF-β1刺激足细胞凋亡的影响。结果高糖(HG组)Cdk5和p35的蛋白及mRNA表达水平明显增高,显著高于正常血糖组(NG)组和甘露醇组(M组)(P0.05),并且呈时间依赖性升高。加入SB431542后,高糖培养导致的足细胞内Smad-2蛋白磷酸化水平明显降低。同时,HG+SB431542组足细胞内Cdk5和p35的蛋白及mRNA表达水平呈浓度依赖性显著降低,明显低于HG组(P0.05)。加入Roscovitine后,高糖及TGF-β1诱导足细胞的足细胞凋亡水平显著下降(P0.05)。结论高糖可能通过活化TGF-β1通路上调Cdk5/p35表达从而诱导足细胞凋亡。