生长分化因子-9及生长分化因子-9B与卵巢功能调节

生长分化因子-9及生长分化因子9B是转化生长因子的新成员,为由卵母细胞分泌的糖蛋白,两者结构基本相近。本文从其结构特点、在组织中的表达、对卵巢的生物调节作用,其在体细胞中的受体和信号通路进行了综述。     

生长分化因子-9及生长分化因子9B/骨形态发生蛋白-15与卵巢功能

卵母细胞来源的生长因子GDF-9和BMP-15是卵泡生长和发育的重要调节因子。本文就其结构、基因克隆、表达与作用通路作概括性描述。其在卵巢中的生理功能主要体现在对卵泡发育和生殖功能的影响,并与卵巢功能失调有着密切的关系。卵母细胞来源的生长因子具有较好的科研价值和应用前景。     

自然排卵、促排卵和超促排卵状态下小鼠卵巢组织中生长分化因子-9(GDF-9)的表达

目的:观察自然周期排卵、促排卵与控制性超促排卵(COH)状态下小鼠卵巢生长分化因子-9(growth differentiation factor,GDF-9)表达水平的变化情况。方法:成年雌性小鼠随机分为3组每组10只,分别为自然排卵组(对照组)、孕马血清(PMSG)促排卵组(PMSG组)、控制性超促排卵组(COH组),各组小鼠取排卵期卵巢组织,采用免疫组织化学方法检测GDF-9的表达与定位,并分别采用Western blottting和实时荧光定量PCR法,定量检测GDF-9蛋白与mRNA的含量。结果:各组小鼠卵母细胞与颗粒细胞中均检测到GDF-9的表达,PMSG组与COH组GDF-9蛋白与mRNA的表达水平均显著高于对照组(P<0.05),PMSG组的表达也明显弱于COH组(P<0.05)。结论:促排卵可促进小鼠卵巢GDF-9的表达,但COH降低促排卵小鼠卵巢GDF-9的表达。     

控制性超促排卵周期多囊卵巢综合征患者生长分化因子-9和骨形成蛋白-15的初步研究

目的:探讨控制性超促排卵(COH)周期多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢颗粒细胞生长分化因子-9(GDF-9)、骨形成蛋白-15(BMP-15)的表达及其与体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗结局的关系。方法:选择接受IVF-ET治疗的PCOS患者45例,同期输卵管因素不孕患者103例作为对照组。应用免疫组织化学、Real-time PCR技术检测患者卵巢颗粒细胞GDF-9、BMP-15蛋白和mRNA的表达,并分析与IVF-ET的临床结局关系。结果:GDF-9、BMP-15蛋白在PCOS组和对照组患者卵巢颗粒细胞胞质均呈阳性表达,PCOS患者颗粒细胞GDF-9 mRNA、BMP-15 mRNA的表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P0.01)。多元线性回归分析显示,颗粒细胞GDF-9 mRNA、BMP-15 mRNA表达水平与优质胚胎数呈正相关关系(P0.05)。临床妊娠组的颗粒细胞GDF-9mRNA、BMP-15 mRNA表达水平高于未妊娠组(P0.05)。结论:COH周期PCOS患者颗粒细胞GDF-9 mRNA、BMP-15 mRNA表达水平可能与胚胎发育潜能存在相关性。     

促性腺激素对小鼠卵泡生长分化因子9表达的影响

目的 探讨促性腺激素对小鼠卵泡生长分化因子9（GDF-9）及生长分化因子9B（GDF-9B）表达的影响.方法 以性成熟小鼠体外培养卵泡和性成熟雌性BALB/c小鼠作为研究模型,（1）体内实验：20只小鼠随机分为两组,A组10只,注射孕马血清促性腺激素（PMSG）,每只10 IU,B组10只,注射同等体积的生理盐水,24 h后取卵巢组织,免疫组化检测GDF-9的表达,原位杂交技术检测GDF-9B的表达,比较两组间GDF-9、GDF-9B的表达差异.（2）体外实验：小鼠卵巢组织经胶原酶消化后收取卵泡58个,随机分为两组进行体外培养,C组32个卵泡,培养液中加入卵泡刺激素（FSH）100 IU/L,D组26个卵泡,培养液中不加FSH.C、D组卵泡培养72 h后收集卵母细胞,行免疫组化检测,根据细胞着色强度（＋～＋＋＋＋）判定GDF-9表达情况.结果 （1）免疫组化：共计数370个卵泡,其中A组186个,染色强度为＋～＋＋＋＋的卵泡数分别为41（22.0%）、86（46.2%）、42（22.6%）、17（9.1%）个,B组184个,染色强度为＋～＋＋＋＋的卵泡数分别为78（42.4%）、79（42.9%）、26（14.1%）、1（0.5%）个,A组较B组卵巢组织GDF-9表达增强,差异有统计学意义（P＜0.01）.卵泡培养后共收集卵母细胞58 个,C 组32个,染色强度为＋～＋＋＋的卵泡数分别为9（28.1%）、17（53.1%）、6（18.8%）个;D组26个,染色强度为＋～＋＋＋卵泡数分别为16（61.5%）、8（30.8%）、2（7.7%）个,C组较D组GDF-9的表达增强,差异也有统计学意义（P＜0.05）.（2）原位杂交：共计数卵泡362个,其中A组184个,染色强度为＋～＋＋＋＋的卵泡数分别为58（31.5%）、85（46.2%）、39（21.2%）、2（1.1%）个,B组178个,染色强度为＋～＋＋＋＋的卵泡数分别为71（39.9%）、74（41.6%）、28（15.7%）、5（2.8%）个,A组与B组卵巢组织中GDF-9B的表达强度比较,差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 促性腺激素在体内可增加卵巢组织GDF-9的表达,FSH在体外可增加卵泡GDF-9的表达,促性腺激素不影响GDF-9B的表达.     

生长分化因子-9和骨形态发生蛋白-15与卵巢反应性的相关性研究

目的 探讨生长分化因子-9(growth differentiation factor-9,GDF-9)和骨形态发生蛋白-15(bone morphogenetic protein 15,BMP-15)在卵母细胞和卵冠丘颗粒细胞(cumulus granulosa cell,CGC)的表达与人卵巢反应性的关系.方法 应用免疫荧光结合激光共聚焦显微术检测31例卵巢中反应患者的34枚、23例高反应患者的29枚未成熟生发泡(germinal vesicle,GV)期卵母细胞GDF-9蛋白的表达,33例中反应患者的37枚、29例高反应患者的34枚第一次减数分裂中期(metaphase I,MI)的卵母细胞BMP-15蛋白的表达;应用免疫细胞化学方法检测两种蛋白在34例低反应、41例中反应和36例高反应患者第2次减数分裂中期(MII)CGC的表达.结果 卵巢中、高反应组间卵母细胞GDF-9的表达差异无显著性,卵巢高反应组"卵母细胞"BMP-15表达强度为(39.19±8.84)显著高于中反应组(29.23±7.83,P＜0.01),并与获卵数中度正相关,(r=0.492,P=0.002);卵巢不同反应组间CGC中GDF-9和BMP-15蛋白表达强度无统计学意义,但两种因子的表达呈中度正相关关系,(r=0.415,P=0.000).结论 卵巢高反应与卵母细胞BMP-15的表达升高有关;GDF-9和BMP-15共表达于CGC中,且具有同步性,并可能存在协同作用.     

生长分化因子-9与PCOS的卵泡发育异常

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种多起因、临床特征为多态性的综合征,卵泡发育异常为其重要特征。由卵母细胞所分泌的生长分化因子-9(GDF-9)是卵泡正常生长发育所必需的细胞因子,对早期卵泡正常生长、卵母细胞的有丝分裂、颗粒细胞的增殖、卵泡膜的形成均有促进作用,但GDF-9却在PCOS患者的卵巢中表达延迟、降低,因此,GDF-9在PCOS发生机制中所起的作用令人侧目。本文将在PCOS卵泡发育异常的基础上,综述PCOS与GDF-9的相关性研究。     

人生长分化因子-9(GDF-9)基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建人生长分化因子-9(GDF-9)基因真核表达载体并分离纯化获得重组GDF-9蛋白。方法:以cDNA克隆为模板,PCR法扩增出人GDF-9基因,将目的基因连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/GDF-9,脂质体法将重组质粒转染到HEK293T细胞,通过Western blotting检测GDF-9蛋白表达。结果:以双酶切及基因测序鉴定构建的重组真核质粒,Western blotting方法证实人GDF-9基因正确表达。结论:成功构建人GDF-9基因pcDNA3.1(+)/GDF-9重组质粒,并在真核细胞系表达,获得重组GDF-9蛋白,为进一步研究GDF-9基因提供便利工具。     

生长分化因子-9和骨形成蛋白-15对多囊卵巢综合征患者卵丘细胞凋亡的影响

目的探讨控制性超促排卵(COH)周期多囊卵巢综合征(PCOS)患者生长分化因子-9(GDF-9)、骨形成蛋白-15(BMP-15)的表达对卵丘细胞凋亡的影响。方法收集本院行卵胞质内单精子注射(ICSI)治疗的PCOS组(n=30)和对照组(n=60)患者的卵丘细胞。TUNEL法及流式细胞术检测卵丘细胞凋亡;免疫组织化学方法检测卵丘细胞GDF-9、BMP-15蛋白表达,运用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对染色强度定量分析;Real-time PCR技术检测卵丘细胞GDF-9、BMP-15、B细胞淋巴瘤/白血病-2(BCL)-2、BCL-2相关X蛋白(BAX)mRNA表达。结果 PCOS组穿刺卵泡数、获卵数高于对照组(P0.01);PCOS组卵丘细胞凋亡率高于对照组(P0.05);GDF-9、BMP-15蛋白在PCOS组和对照组卵丘细胞胞质中均呈阳性表达;PCOS患者卵丘细胞GDF-9、BMP-15、BCL-2、BAX mRNA的表达低于对照组(P0.05),BAX/BCL-2比值高于对照组(P0.05)。Pearson相关分析结果显示PCOS患者GDF-9、BMP-15与BCL-2 mRNA表达呈正相关,与BAX mRNA的表达呈负相关。结论 PCOS患者卵丘细胞GDF-9、BMP-15异常表达可能是卵丘细胞凋亡增加的原因之一。     

卵母细胞分泌的生长分化因子-9和骨形成蛋白-15与卵母细胞发育潜能的关系

目的:探讨卵母细胞分泌的生长分化因子-9(GDF-9)和骨形成蛋白-15(BMP-15)与卵母细胞发育潜能的关系。方法:收集因输卵管性不孕接受IVF-ET治疗患者的卵泡,每侧卵巢穿刺取卵时首先选择一个直径≥18 mm卵泡抽吸,对卵母细胞进行成熟度分型,并观察其受精、卵裂及胚胎评分情况。受精后按是否形成优质胚胎将将卵泡分为优质卵母细胞组和非优质卵母细胞组,采用Western blotting方法检测比较各组卵泡液中GDF-9和BMP-15的含量。结果:①优质卵母细胞组的GDF-9蛋白相对含量为2.498±0.133,非优质卵母细胞组为1.305±0.406,差异有统计学意义(P=0.008)。②优质卵母细胞组的BMP-15蛋白相对含量为3.379±0.482,非优质卵母细胞组为1.336±0.214,差异有统计学意义(P=0.003)。结论:在优质卵母细胞组卵泡液中GDF-9和BMP-15水平均较高,提示人卵泡液中GDF-9、BMP-15水平可以反映卵母细胞的发育潜能,GDF-9、BMP-15水平可以作为评价卵母细胞质量的指标。     

骨形成蛋白15/生长分化因子9与原发性卵巢功能不全的相关性研究进展

原发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency, POI)是关乎全世界女性的健康问题,表现为40岁前闭经或月经稀发,伴有促性腺激素升高和雌激素降低等;经隐匿期、生化异常期和临床异常期,最终导致卵巢早衰(premature ovary failure, POF)。感染、遗传、自身免疫等很多因素都能引起POI。近年来,作为女性生殖细胞重要调节因子的骨形成蛋白15(bone morphogenetic protein, BMP15)/生长分化因子9(growth and development factor, GDF9)成为研究POI的普遍候选基因,它们的错义突变可能导致卵巢储备减少或耗竭从而造成POI。BMP15与其常染色体旁系同源的GDF9属于转化生长因子β(transforming growth factorβ, TGFβ)超家族成员,二者影响着卵泡发育及卵巢功能。本文就BMP15/GDF9导致POI的研究现状做一总结,为进一步研究POI发病机制、易感因素及诊断、预测遗传度等提供参考。     

重组人黄体生成素在体外受精-胚胎移植促排卵治疗中的应用

目的 评价重组人黄体生成素(r-hLH)在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)促排卵治疗中的应用及其对妊娠结局的影响.方法 回顾性分析2009年4-7月在山东大学附属省立医院生殖医学中心进行IVF-ET治疗、垂体降调节后月经第3天血清黄体生成素(LH)水平较低(<1 U/L)的患者,其中给予r-hLH补充治疗的66例患者为r-hLH组,未给予r-hLH补充治疗的57例患者为非r-hLH组;另选择同期行IVF-ET治疗、垂体降调节后月经第3天血清LH水平正常(1～2 U/L)且未给予r-hLH补充治疗的145例患者为对照组.比较3组患者的促性腺激素(Gn)总量、注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)日血清雌二醇及LH水平、获卵数、双原核胚胎率、优质胚胎率、着床率及临床妊娠率等.结果 r-hLH组、非r-hLH组及对照组患者注射hCG日的LH水平分别为(1.59±0.77)、(0.54±0.25)及(2.39±1.01)U/L,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);优质胚胎率分别为59.36%、57.79%和65.94%,r-hLH组及非r-hLH组均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);双原核胚胎率分别为67.62%、62.84%和68.32%,r-hLH组及对照组均高于非r-hLH组,差异均有统计学意义(P<0.05);着床率分别为29.77%、18.26%和24.47%,r-hLH组高于非r-hLH组,差异有统计学意义(P<0.05);3组患者的Gn总量、注射hCG日雌二醇水平、平均获卵数、临床妊娠率分别比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 对于长方案垂体降调节后LH过度抑制的患者,补充r-hLH可以获得较高的优质胚胎率、双原核胚胎率和着床率.     

重组人黄体生成素在体外受精-胚胎移植促排卵治疗中的应用

Objective To evaluate application of recombinant human luteinizing hormone (r-hLH)used in ovarian stimulation of assisted reproductive technique and impact on outcome of pregnancy. Methods From Apr. To Jul. 2009, 123 patients with low LH level ( < 1 U/L) at day 3 of menstruation and downregulation of pituitary function undergoing in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET) in Reproductive Medical Center, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University were enrolled in this study, whom were classified into 66 cases treated by r-hLH in r-hLH group and 57 cases without r-hLH treatment in non-r-hLH group. In the mean time, 145 patients with normal level of serum LH ( 1-2 U/L) not given by r-hLH treatment and undergoing IVF-ET were matched as control group. Total amount of gonadotropin, estradiol levels and LH levels on the administration of human chorionic gonadotropin ( hCG), number of oocytes retrieved, number of 2PN zygotes, rate of high quality embryos, the rates of implantation and clinical pregnancy were compared among these three groups. Results The level of serum LH on the day of hCG administration were ( 1.59 ± 0.77 ) U/L in r-hLH group, (0.54 ± 0.25 ) U/L in non-r-hLH group and (2.39 ± 1.01 ) U/L in control group, which reached tatistical difference between every two groups (P < 0.05). The rates of high quality embryo were 59.36％ in r-hLH group, 57.79％ in non-r-hLH group,which were significantly lower than 65.94％ in control group, respectively (P < 0. 05 ). The rates of 2PN were 67.62％ in r-hLH group and 68. 32％ in control group, which were significantly higher than 62. 84％ in non-r-hLH group, respectively ( P < 0.05 ). The rates of implantation of 29.77％ in r-hLH group were significantly higher than 18.26％ in non-r-hLH group ( P < 0.05 ). The total amount of gonadotropin,estradiol level on the day of hCG administration, the number of oocytes retrieved, and clinical pregnancy rate were not significantly different among those three groups ( P > 0.05 ). Conclusion The administration of recombinant human uteinizing hormone in patients who are profoundly suppressed after down-regulation with long protocol can get more quality embryos, the higher rates of 2PN and implantation.     

重组人黄体生成素在体外受精-胚胎移植促排卵治疗中的应用

Objective To evaluate application of recombinant human luteinizing hormone (r-hLH)used in ovarian stimulation of assisted reproductive technique and impact on outcome of pregnancy. Methods From Apr. To Jul. 2009, 123 patients with low LH level ( < 1 U/L) at day 3 of menstruation and downregulation of pituitary function undergoing in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET) in Reproductive Medical Center, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University were enrolled in this study, whom were classified into 66 cases treated by r-hLH in r-hLH group and 57 cases without r-hLH treatment in non-r-hLH group. In the mean time, 145 patients with normal level of serum LH ( 1-2 U/L) not given by r-hLH treatment and undergoing IVF-ET were matched as control group. Total amount of gonadotropin, estradiol levels and LH levels on the administration of human chorionic gonadotropin ( hCG), number of oocytes retrieved, number of 2PN zygotes, rate of high quality embryos, the rates of implantation and clinical pregnancy were compared among these three groups. Results The level of serum LH on the day of hCG administration were ( 1.59 ± 0.77 ) U/L in r-hLH group, (0.54 ± 0.25 ) U/L in non-r-hLH group and (2.39 ± 1.01 ) U/L in control group, which reached tatistical difference between every two groups (P < 0.05). The rates of high quality embryo were 59.36％ in r-hLH group, 57.79％ in non-r-hLH group,which were significantly lower than 65.94％ in control group, respectively (P < 0. 05 ). The rates of 2PN were 67.62％ in r-hLH group and 68. 32％ in control group, which were significantly higher than 62. 84％ in non-r-hLH group, respectively ( P < 0.05 ). The rates of implantation of 29.77％ in r-hLH group were significantly higher than 18.26％ in non-r-hLH group ( P < 0.05 ). The total amount of gonadotropin,estradiol level on the day of hCG administration, the number of oocytes retrieved, and clinical pregnancy rate were not significantly different among those three groups ( P > 0.05 ). Conclusion The administration of recombinant human uteinizing hormone in patients who are profoundly suppressed after down-regulation with long protocol can get more quality embryos, the higher rates of 2PN and implantation.     

骨形态发生蛋白15(BMP15)/生长分化因子9(GDF9)在卵巢功能及女性生育过程中的作用

人类卵巢功能的调节机制极其复杂,是由多个卵巢内旁分泌信号整合的中枢神经系统、垂体及卵巢之间进行复杂对话的过程。卵子来源的骨形态发生蛋白15(BMP15)及生长分化因子9(GDF9)是近年来新发现的卵巢内旁分泌调节机制相关调节分子,已逐渐成为卵巢功能维持及卵子发生调节的研究热点。BMP15/GDF9在女性生育中的主要的生物学功能包括:1促进卵泡生长及成熟(从不依赖于促性腺激素的原始卵泡期开始);2调节颗粒细胞对促卵泡生成素(FSH)作用的敏感性,决定卵泡排出的比例;3预防颗粒细胞凋亡;4促进卵泡的发育潜能。BMP15/GDF9异常将导致Tunner综合征、卵巢功能不全,还可能与PCOS,异卵双胎有关;而卵泡液中BMP15水平是预测卵巢低反应患者IVF结局的一个潜在指标。     

多囊卵巢综合征患者未成熟卵母细胞体外成熟培养后生长分化因子-9的表达

目的:探讨生长分化因子-9(GDF-9)与多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵母细胞体外成熟及胚胎发育的关系。方法:采集PCOS患者自然周期月经未成熟卵母细胞,经体外成熟培养(IVM)后,免疫组化比较不同成熟度的卵母细胞及其周围颗粒细胞中GDF-9的表达差异;同时收集行IVM后受精的胚胎以及同期因输卵管因素行常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的胚胎及未受精的卵子,免疫组化比较这些胚胎中GDF-9表达的差异。结果:①IVM后共获弃卵70个,其中MII期21个、MI期26个、GV期23个,染色结果显示GDF-9的表达在培养后成熟的卵母细胞MII期中表达较MI期、GV期增强,差异有显著性;而MI期、GV期两组间表达无差异;②共对343个卵子的颗粒细胞进行了免疫组化染色,MII期、MI期、GV期、退变卵周围颗粒细胞中GDF-9表达的阳性率随着卵母细胞成熟度的降低,逐渐降低,退变卵中最低。③共获IVF弃胚胎75个,GDF-9在各期胚胎中的表达均为阳性,且各期胚胎间的表达水平无差异。④对62个IVF中未受精的弃卵进行了染色,结果显示GDF-9的表达水平较IVF胚胎降低,差异有显著性。⑤共获IVM弃胚胎57个,各期胚胎间GDF-9的表达也无显著性差异,但IVF组胚胎中GDF-9的表达水平较IVM组高,差异有显著性。结论:GDF-9可能与人类卵母细胞的体外成熟及胚胎发育有关。     

卵泡生长分化因子-9(GDF-9)在高胰岛素血症大鼠卵巢中的表达与意义

目的:探讨卵泡生长分化因子-9(GDF-9)在卵泡发育异常及激素水平变化等方面的作用机制。方法:①利用改良Poretsky方法建立高胰岛素血症动物模型(模型组,n=20):hCG×9d+胰岛素×22d。采用下列方法验证模型:测定空腹血糖、空腹胰岛素(FINS)、睾酮(T)、E2、LH、FSH,并计算胰岛素抵抗指数(HOMA1-IR);测定大鼠体重及卵巢重量;HE染色方法观察卵巢病理变化。②采用免疫组化和RT-PCR法检测模型动物及正常对照组(n=20)卵巢组织GDF-9 mRNA及蛋白的表达。结果:①与对照组比较,模型组FPG、FINS、HOMA1-IR、T升高(P<0.05)。②组间体重无统计学差异,但模型组卵巢重量显著大于对照组(P<0.05)。模型组各发育阶段卵泡明显减少,但囊性扩张的卵泡和闭锁卵泡增多,卵泡膜细胞增生,卵泡间质明显增厚。③模型组卵巢组织GDF-9 mRNA和蛋白的表达均显著低于对照组(P<0.05)。结论:高胰岛素血症减弱卵巢组织GDF-9 mRNA和蛋白的表达强度;表达降低的GDF-9可能与PCOS卵泡发育异常及激素水平变化有关。     

重组人黄体生成素在体外受精-胚胎移植高龄患者促排卵中的应用

目的:评价重组人黄体生成素(r-hLH)在高龄患者促排卵中的应用价值以及对临床结局的影响。方法:选择协和医院生殖中心进行试管婴儿治疗,长方案降调节,年龄≥35岁,卵泡刺激素促排卵第7天,血清LH水平低于2U/L的患者146例。根据是否使用r-hLH进行分组:A组78例给予r-hLH治疗,B组68例未给予r-hLH治疗。比较两组患者的血清LH水平变化、平均促性腺激素(Gn)使用量、获卵数、双原核胚胎数、优质胚胎率、着床率及临床妊娠率。结果:两组患者血清LH变化情况、平均Gn用量、获卵数、优质胚胎率差异无统计学意义(P>0.05);A组的平均双原核胚胎数、着床率及临床妊娠率均显著高于B组(P<0.05)。结论:对于卵泡刺激素促排卵第7天血清LH<2U/L的高龄患者,补充r-hLH可以获得较高的双原核胚胎数、着床率及临床妊娠率。