当归挥发油通过抑制自噬减轻拟缺血再灌注神经细胞损伤

目的:探讨自噬在拟缺血再灌注损伤神经细胞中的作用以及当归挥发油对自噬的影响。方法:采用"缺糖-复糖"结合"缺氧-复氧"的方法,在体外用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理高分化PC12细胞,模拟"缺血再灌注"损伤,用CCK-8比色法检测当归挥发油对细胞增殖的影响,AO荧光染色观察自噬细胞形态,Western-blot检测自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5、LC3B-Ⅱ的表达。结果:在6.25~25μg/ml的浓度范围内,当归挥发能够显著提高PC12细胞存活率,减少受损细胞酸性自噬泡的数量,25μg/ml的当归挥发油能够抑制自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5、LC3B-Ⅱ的表达。结论:当归挥发油可能通过抑制自噬减轻拟缺血再灌注神经细胞的损伤。     

PC12细胞氧糖剥夺模型细胞自噬与损伤的关系及黄芪甲苷的保护作用研究

目的:研究PC12细胞OGD/R后自噬与损伤的经时性变化以及黄芪甲苷的干预效应。方法:探讨PC12细胞OGD/R后不同时间自噬的变化及与细胞损伤的关系,初步确定细胞发生自噬性损伤的时间点,再制作PC12细胞OGD/R自噬性损伤模型,研究黄芪甲苷抗自噬性损伤的作用。结果:复糖复氧6~36 h后,细胞存活率降低、LDH漏出率增加;用3-MA预处理后,可使复糖复氧6~12 h细胞存活率降低、LDH漏出率增加,复糖复氧后24~36 h相反。激光共聚焦和western-blot检测显示,复糖复氧后6 h LC3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加,至24 h达高峰;p62蛋白表达随再复糖复氧时间的延长逐渐降低。黄芪甲苷对OGD 2 h复糖复氧24 h的PC12细胞自噬具有显著抑制作用,且呈剂量依赖性。结论:PC12在在OGD复糖复氧6~12 h,自噬减轻神经细胞的损伤,而在24~36 h后加重细胞损伤;黄芪甲苷可通过抑制细胞过度自噬诱导的细胞损伤,从而发挥对受损细胞的神经保护作用。     

中医药治疗心肌缺血再灌注损伤的实验研究进展

从抑制氧化应激损伤、抑制炎症反应、抑制细胞自噬、降低细胞凋亡率、诱导延迟保护作用等方面出发,综述中医药预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤实验模型的保护机制,分析研究中的不足并提出解决方法,为今后临床治疗心肌缺血再灌注损伤提供更扎实的理论基础。     

黄芪多糖对缺氧再复氧后人心脏微血管内皮细胞ICAM-1 VCAM-1表达的影响

目的:观察黄芪多糖对缺氧再复氧损伤的人心脏微血管内皮细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)蛋白表达的影响。方法:以体外缺氧缺糖模拟体内缺血,复氧复糖模拟再灌注复制缺血再灌注损伤模型;采用免疫细胞化学法和图象定量分析系统观察ICAM-1、VCAM-1蛋白表达的变化。结果:人心脏微血管内皮细胞复苏48~72h后呈铺路石样生长,在15个细胞倍增周期内,其形态、生物、生理学特性稳定。与正常对照组比较,缺氧再复氧可明显增加ICAM-1、VCAM-1蛋白在人心脏微血管内皮细胞的表达(P<0.01)。黄芪多糖能降低两者的表达,其中100μg/mL抑制ICAM-1表达的作用显著(P<0.05),100、50μg/mL减少VCAM-1表达的作用明显(P<0.01)。结论:黄芪多糖通过减少缺血再灌注损伤的人心脏微血管内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达,抑制白细胞的浸润,从而减轻心肌缺血再灌注损伤。     

缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞Necroptosis模型的建立

目的:采用拟缺血再灌注损伤结合z-VAD-FMK(Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone,z-VAD-FMK)干预,探索一种脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs)Necroptosis模型。方法:首先利用原代大鼠脑微血管内皮细胞,采用氧糖剥夺及复氧复糖方法,筛选出拟缺血再灌注损伤时间点。在拟缺血再灌注模型基础上,予Casepase抑制剂z-VAD-FMK 20μmol/L干预,采用CCK-8检测细胞活性;透射电镜观察细胞超微结构;Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)双染色法检测细胞死亡方式。结果:确定氧糖剥夺2 h复氧复糖8 h,作为拟缺血再灌注时间点;z-VADFMK作用于拟缺血再灌注损伤BMECs后,细胞活性无统计学意义;z-VAD-FMK干预组在电镜下呈现明显的Necroptosis特征;流式检测显示,各象限细胞比率无明显变化,但Necroptosis特异性抑制剂Nec-1可显著降低Q2象限细胞比率,提示z-VAD-FMK干预抑制了细胞晚期凋亡,诱导了Necroptosis的发生。结论:z-VAD-FMK可诱导拟缺血再灌注脑微血管内皮细胞发生Necroptosis,为以后研究缺血性脑中风necroptosis机制提供了细胞实验模型。     

痰瘀同治方对缺氧复氧诱导心肌细胞AMPK-mTOR自噬信号通路的影响及机制

目的研究痰瘀同治方对缺氧/复氧(H/R)心肌细胞自噬的影响及AMPK-mTOR信号通路在其中可能发挥的作用。方法体外培养H9C2心肌细胞,随机分为空白对照组、H/R模型组(缺氧10 h后复氧2 h)、痰瘀同治方组、血府逐瘀汤组及栝蒌薤白半夏汤组,各组给予相应方剂肠吸收液18 mg/m L孵育2 h后H/R处理。电镜下观察细胞自噬体结构,检测细胞上清液中LDH释放量和SOD活性,蛋白免疫印迹测定细胞内LC3、Beclin-1、P-AMPK和P-mTOR蛋白表达。结果心肌细胞缺氧复氧后自噬体形成并增多。与空白对照组比较,H/R模型组心肌细胞LDH含量、LC3及Beclin-1蛋白表达量增加,p-AMPK表达增强,SOD活性下降且p-mTOR表达减弱(P0.05,P0.01)。与H/R模型组比较,各中药组干预后均能降低LDH、Beclin-1表达,痰瘀同治方组与血府逐瘀汤组可同时提高SOD活性,抑制LC3高表达(P0.05,P0.01)。同时痰瘀同治方组与血府逐瘀汤组可下调p-AMPK水平,并上调p-mTOR蛋白表达(P0.05,P0.01)。结论缺氧复氧可激活心肌细胞AMPK-mTOR信号通路,从而诱导自噬过度表达加重心肌损伤,痰瘀同治方可通过调控AMPK-mTOR信号通路、抑制自噬而起到心肌保护作用。     

黄芩苷、栀子苷对神经细胞缺氧缺糖/再灌注损伤的保护作用

 目的 观察黄芩苷、栀子苷对神经细胞缺氧缺糖/再灌注损伤的保护作用,在细胞水平阐明黄芩苷、栀子苷治疗脑缺血/再灌注损伤的作用机制。方法 选用SH-SY5Y细胞,采用缺氧、复氧结合缺糖、复糖的方法,对其进行攻击,模拟人体神经细胞的缺血再灌注损伤,观察黄芩苷、栀子苷对此损伤的治疗作用。结果 缺氧、缺糖8 h结合复氧、复糖12 h对神经细胞可造成明显损伤,导致SH-SY5Y细胞突起皱缩、变圆,可见有部分细胞漂起,细胞轮廓不清,凋亡率明显上升,线粒体的活性下降;而黄芩苷、栀子苷可以显著减轻上述损伤。结论 黄芩苷、栀子苷对缺氧缺糖/再灌注损伤的神经细胞有保护作用。     

黄芩苷对神经细胞缺氧缺糖-再灌注损伤的保护作用

目的观察黄芩苷对神经细胞缺氧缺糖-再灌注损伤的保护作用,在细胞水平阐明黄芩苷治疗脑缺血-再灌注损伤的作用机制。方法选用SH-SY5Y神经细胞,采用缺氧-复氧结合缺糖-复糖的方法,对其进行攻击,模拟人体神经细胞的缺血-再灌注损伤,观察黄芩苷对此损伤的治疗作用。结果缺氧、缺糖8h结合复氧、复糖12h对神经细胞可造成明显损伤,导致SH-SY5Y细胞线粒体的活性下降,凋亡率明显上升;而黄芩苷可以显著减轻上述损伤。结论黄芩苷对缺氧、缺糖-再灌注损伤的神经细胞有保护作用。     

加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧H9C2心肌细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ及Beclin1表达的影响

目的探讨加味丹参饮治疗心肌缺血再灌注损伤的可能作用机制。方法将体外培养的H9C2心肌细胞随机分为6组,每组6个复孔。空白血清组在含15%空白血清培养液中常规培养29 h;缺氧预处理组更换缺氧培养液缺氧20 min,复氧20 min,再缺氧20 min后换为空白血清培养液常规培养24 h,缺氧2 h,再给氧3 h;缺氧/复氧组在含15%空白血清培养液中常规培养24 h,更换缺氧培养液,缺氧2 h,再给氧3 h;含药血清组在含15%药物血清中常规培养24 h,缺氧2 h,再给氧3 h;含药血清+自噬抑制剂组用3-甲基腺嘌呤10 mmol/L预处理30 min,余同含药血清组;含药血清+自噬激动剂组用雷帕霉素100 nmol/L预处理30 min,余同含药血清组。倒置显微镜观察各组心肌细胞生长及形态变化,比色法检测定各组细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,透射电子显微镜观察心肌细胞自噬体形态及数量变化,Western blot法检测各组自噬相关蛋白LC3Ⅱ及Beclin1表达。结果与空白血清组比较,缺氧/复氧组镜下心肌细胞变性坏死程度增加,电镜下有少量自噬体,培养液中LDH漏出率增加,Beclin1蛋白水平增加(P0.05或P0.01);与缺氧/复氧组比较,含药血清组及含药血清+自噬激动剂组镜下心肌细胞变性坏死程度减轻,电镜下自噬体数量增多,培养液中LDH漏出率显著降低,LC3Ⅱ及Beclin1蛋白表达上升(P0.05)。结论加味丹参饮可能通过上调自噬相关蛋白LC3Ⅱ及Beclin1表达,增强细胞自噬,从而保护损伤的心肌细胞。     

银杏提取物对心肌细胞缺氧缺糖和氧糖复供时钙内流的抑制作用

目的:观察银杏提取物(GbE)对心肌细胞缺血和缺血/再灌注损伤时细胞钙内流的影响。方法:以心肌细胞缺氧缺糖模拟缺血,用缺氧缺糖后一定时间氧糖复供作为再灌注,采用改良“冷镧”法测定细胞~(45)Ca 摄取率。结果:GbE 在一定浓度(35-350mg/L)范围内可显著降低缺血和缺血/再灌注时细胞~(45)Ca 摄取,其抑制作用呈一定的量效关系。结论:GbE可能具有通过抑制钙内流而减轻缺血和缺血/再灌注后心肌细胞损伤的作用。     

制冰片介导Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路改善心肌细胞H/R损伤

目的 研究天竺黄制冰片对缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation, H/R)诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用及潜在作用机制。方法 通过给予H9C2心肌细胞不同的缺氧时间体外模拟缺血再灌注损伤,测定损伤后H9C2心肌细胞中超氧化物歧化酶(superioxide diamutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogense, LDH)水平,评估模型是否成功建立。MTT方法测定天竺黄、冰片及制冰片对H9C2细胞的安全浓度范围,并检测天竺黄、冰片及制冰片对H/R诱导后心肌细胞中MDA、SOD和LDH生成的影响。采用Real-time PCR和Western blot方法检测天竺黄制冰片对H/R诱导H9C2细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3基因和蛋白的表达。结果 缺氧6 h,复氧4 h,心肌细胞存活率小于50%,细胞中MDA和LDH水平显著增加,SOD活性显著降低,成功模拟缺血再灌注模型。天竺黄、冰片及制冰片在12.5～100μg/mL浓度范围内,对心肌细胞活力均没有影响。天竺黄(6.25～10...     

山核桃叶总黄酮对H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用

目的:研究山核桃叶总黄酮对H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用。方法:体外培养大鼠H9C2心肌细胞,用不同浓度氯化钴并优化不同缺氧及复氧时间建立缺氧复氧损伤模型。缺氧复氧前加入终浓度为2.5、5、10μg/m L的山核桃叶总黄酮预处理,通过检测细胞上清液中LDH释放量,细胞内MDA含量和SOD活性;并采用MTS检测缺氧复氧损伤后细胞的成活率以及Hoechst-PI双染和流式细胞术观察细胞凋亡情况,蛋白免疫印迹检测细胞内HIF-1α蛋白表达,来考察山核桃叶总黄酮保护心肌细胞缺氧复氧损伤的作用。结果:利用1 200μmol/L氯化钴缺氧18 h,复氧2 h可建立缺氧损伤心肌细胞模型。与模型组比较,山核桃叶总黄酮能降低H9C2细胞缺氧复氧损伤后LDH释放量及细胞内MDA含量,提高SOD活性,减少细胞凋亡,并使细胞HIF-1α蛋白表达恢复正常水平。结论:山核桃叶总黄酮对心肌细胞缺氧复氧损伤具有一定的保护作用,其机制可能与抗氧化、增强细胞清除自由基能力、减少脂质过氧化物产生及抑制细胞凋亡有关。     

黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞缺氧再复氧损伤后核因子-κB表达的影响

目的:观察人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)缺血再灌注损伤后核因子-κB(NF-κB)的表达变化,探讨黄芪多糖治疗心肌缺血再灌注损伤的机制。方法:以体外缺氧再复氧复制缺血再灌注损伤模型。免疫细胞化学染色法观察NF-κB的蛋白分布,荧光实时定量PCR检测NF-κB mRNA的表达。结果:缺氧再复氧后,NF-κB发生核转位,其mRNA表达较正常对照组明显增加(P<0.05)。黄芪多糖可抑制NF-κB的核转位,并降低NF-κBmRNA的表达,其中黄芪多糖50μg/mL剂量组降低NF-κBmRNA表达的作用与缺氧再复氧组比较差异显著(P<0.05)。结论:黄芪多糖通过抑制缺氧再复氧后HCMEC的NF-κB信号通路,降低炎症相关基因的激活,从而减轻心肌缺血再灌注损伤时的炎症反应。     

山楂叶总黄酮通过调控miR-133b改善缺氧复氧诱导的神经细胞损伤

目的探讨山楂叶总黄酮通过调控miR-133b改善缺氧复氧诱导的神经细胞损伤。方法山楂叶总黄酮(10、30、90 mg/L)培养SH-SY5Y细胞24 h后,构建缺氧复氧(H/R)细胞模型;将miR-NC、miR-133b、anti-miR-NC、anti-miR-133b质粒转染至SH-SY5Y细胞6 h,加入90 mg/L山楂叶总黄酮处理24 h,再进行缺氧复氧处理。RT-PCR检测miR-133b、RBMX mRNA表达,Western blot检测RBMX、Bax、Bcl-2蛋白表达,采用试剂盒分别检测LDH、SOD、MDA水平,流式细胞术检测细胞凋亡,双荧光素酶报告基因实验检测荧光活性。结果预处理SH-SY5Y细胞,山楂叶总黄酮能上调H/R诱导的神经细胞SOD水平,下调LDH、MDA水平,抑制Bax、RBMX表达及细胞凋亡率,促进Bcl-2、miR-133b表达(P0.05),与H/R诱导的神经细胞过表达miR-133b结果一致。且miR-133b靶向调控RBMX的表达,抑制miR-133b表达逆转了山楂叶总黄酮对H/R诱导的神经细胞损伤的改善作用。结论山楂叶总黄酮通过调控miR-133b靶向调控RBMX的表达改善缺氧复氧诱导的神经细胞损伤。     

黄芩茎叶总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响

目的:探讨黄芩茎叶总黄酮(scutellaria baicalelensis stem leaf total flavonoid SSTF)对培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧时凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法:原代培养乳鼠心肌细胞,缺氧(hypoxia H)2h后,复氧(reoxygenation R)4h制备缺氧/复氧损伤模型。以免疫组织化学方法检测心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达变化。心肌细胞损伤程度以心肌细胞存活率表示。结果:缺氧2h再复氧4h,心肌细胞Bcl-2蛋白阳性表达指数(positive expressionindex PEI)显著低于对照组(P<0.01),Bax蛋白PEI显著高于对照组(P<0.01)。细胞存活率明显低于对照组(P<0.05)。SSTF干预组Bcl-2蛋白PEI明显高于缺氧/复氧组(P<0.05),Bax蛋白PEI显著低于缺氧/复氧组(P<0.05),细胞存活率明显高于缺氧/复氧组(P<0.05)。结论:心肌细胞缺氧再复氧时,Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达增强;细胞存活率降低。SSTF可通过上调Bcl-2蛋白表达,抑制Bax蛋白表达,减少细胞凋亡,从而减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

荭草花提取物对H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用

目的:探究荭草花提取物对H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用。方法:利用氯化钴(CoCl_2)建立缺氧复氧损伤H9c2细胞模型,实验分正常对照组、模型组及荭草花提取物不同浓度组。应用MTS检测细胞存活率;生化试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)释放量及细胞内丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)水平;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western blot测定cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果:利用800μmol/L CoCl_2缺氧22 h,复氧2 h可建立缺氧复氧损伤心肌细胞模型。与模型组比较,荭草花提取物能显著升高心肌细胞存活率,降低LDH、CK释放量及细胞内MDA含量,提高细胞内SOD、CAT活性,并呈浓度依赖性抑制CoCl_2诱导的缺氧复氧损伤。荭草花提取物能下调促凋亡蛋白cleaved Caspase-3、Bax的表达,上调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,减少心肌细胞凋亡。结论:荭草花提取物对心肌细胞缺氧复氧损伤具有一定的保护作用,其机制可能与增强细胞清除自由基能力及抑制细胞凋亡有关。     

强心复脉颗粒对兔缺血再灌注窦房结细胞凋亡及Bax,Bcl-2,Fas-L蛋白表达的影响

目的:探讨临床有效中药复方强心复脉颗粒防治病窦综合征的分子作用机制。方法:采用兔右冠状动脉根部结扎/放松法制备兔窦房结缺血再灌注模型,运用原位末端标记(TUNEL)法观察强心复脉颗粒对兔右冠状动脉缺血再灌注致窦房结细胞凋亡的影响,并运用免疫组化的方法观察其对细胞凋亡相关基因Bax,Bcl-2,Fas-L蛋白表达的影响,用Imagepro Plus图象分析系统计算Bax,Bcl-2,Fas-L表达平均吸光度值。结果:兔右冠状动脉缺血再灌注所致窦房结损伤可明显诱导兔窦房结细胞发生凋亡,引发Fas-L基因蛋白表达增强,同时显著引发Bax基因蛋白表达增强,Bcl-2/Bax下降;强心复脉颗粒可显著下调Fas-L和Bax基因的蛋白表达,上调Bcl-2/Bax,明显抑制和阻断窦房结细胞发生凋亡。结论:通过调节缺血再灌注后窦房结Bax,Bcl,Fas-L基因的蛋白表达从而抑制和阻断细胞凋亡的发生,可能是中药复方强心复脉颗粒防治病窦综合征窦房结缺血再灌注损伤的分子作用机制。     

银杏二萜内酯K抗血小板聚集及神经保护作用研究

观察不同浓度的银杏二萜内酯K(GK)对血小板活化因子(PAF)诱导血小板聚集的拮抗作用及对缺血再灌注损伤细胞和动物模型的神经保护作用。制备GK家兔含药血清,用血小板聚集功能测定法观察GK含药血清对PAF诱导的家兔血小板聚集的影响。建立缺糖缺氧复氧(OGD/R)细胞模型,采用Hoechst/PI双染考察不同浓度的GK对OGD/R损伤的SHSY5 Y细胞凋亡的影响;建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型(I/R),检测GK对神经行为评分及脑梗死体积的影响。GK能剂量依赖性的抑制PAF诱导的血小板聚集,逆转OGD/R损伤造成的细胞凋亡并改善大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经行为评分及脑组织梗死体积。GK能抑制PAF诱导的血小板聚集、改善脑缺血再灌注神经损伤。     

黄芩素对大鼠心肌缺血和乳鼠心肌细胞损伤的影响(英文)

目的:研究黄芩素对冠脉结扎引起的大鼠心肌缺血损伤及H2O2诱导的乳鼠心肌细胞氧化损伤或Na2S2O4诱导的缺氧/复氧损伤的影响和相关机制。方法:连续灌胃给予大鼠黄芩素7d,最后一次给药后进行冠脉结扎手术,记录结扎前后的心电图,6h后处死大鼠,TTC染色法评估心肌梗死比重,并测定血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)的含量。体外实验中乳鼠心肌细胞与黄芩素共培养3d后用H2O2诱导氧化损伤或用Na2S2O4诱导的缺氧/复氧损伤,MTT法测定细胞活力并测定培养液上清LDH活性。结果:与假手术组相比,冠脉结扎后大鼠心肌梗死率、血清CK、LDH活性和MDA含量明显增加,SOD活性则显著下降;H2O2及缺氧/复氧可造成心肌细胞活力的下降和LDH的释放。与模型组相比,黄芩素的预治疗能有效地抑制缺血引起的大鼠J点抬高,显著降低心肌梗死率,减少血清中CK、LDH活性及MDA含量,但剂量依赖性地降低血清SOD活性。黄芩素的预适应亦可明显地抑制H2O2诱导的心肌细胞活力下降和LDH释放;而对于缺氧/复氧损伤,缺氧时黄芩素的存在与否可影响其心肌保护作用。结论:黄芩素对体内缺血或...     

小胶质细胞缺氧再复氧模型的建立方法

目的建立小胶质细胞体外缺血再灌注模型,并观察小胶质细胞生存活性、炎症因子表达的变化。方法体外培养小鼠小胶质细胞BV2,三气培养箱中1％氧气缺氧12h再复氧12h模拟脑缺血再灌注损伤,用MTT比色法检测细胞生存活性,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度变化,实时荧光定量PCR检测细胞环氧酶-2（COX-2）mRNA的表达。结果缺氧12h再复氧12h可造成小鼠小胶质细胞活化损伤,模型组A值明显低于正常组（P％0．01）,TNF—α浓度、COX2mRNA的表达明显高于正常组（P％0．01）。结论成功建立小胶质细胞体外缺血再灌注模型。