小干扰RNA沉默EGFR基因对卵巢癌细胞侵袭力的影响

目的 通过小干扰RNA(siRNA)沉默表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,旨在探讨其对卵巢癌SKOV3细胞体外侵袭力影响.方法 体外构建靶向EGFR基因siRNA质粒和阴性对照质粒, Lipofectamin 2000介导转染到SKOV3细胞中.实验分空白对照组、非特异性转染组、特异性转染组.采用RT-PCR和免疫细胞化学法检测EGFR基因mRNA和蛋白表达水平;采用平板克隆形成法检测细胞生长增殖能力;采用Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭力.结果 特异性转染组细胞EGFR mRNA 的表达与其他两组相比明显减弱(F=50.45,q=12.87、11.72,P<0.01),EGFR 蛋白表达明显下调(F=61.54,q=14.58、11.46,P<0.01);细胞生长增殖能力减弱(F=130.12,q=21.12、18.15,P<0.01);体外侵袭力明显降低(F=34.09,q=11.26、8.34,P<0.01).结论 siRNA可以有效抑制SKOV3细胞EGFR基因的表达,从而抑制SKOV3细胞增殖和侵袭能力.     

RNA干扰EGFR基因对卵巢癌细胞放疗敏感性影响的实验研究

目的:构建针对表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)基因的小于扰RNA(Small interference RNA,siRNA)质粒,转染人卵巢癌SKOV3细胞株后,检测RNA干扰(RNA interference,RNAi)对EGFR基因表达及评估细胞对放疗敏感性的影响.方法:体外构建EGFR小发卡状RNA(Short hairpin RNA,shRNA)的表达质粒,脂质体法转染入SKOV3细胞及G418筛选阳性克隆.实验随机分为阳性RNA干扰组(A组)、阴性RNA干扰组(B组)、空白对照组(C组).采用RT-PCR、Western Blot技术检测EGFR mRNA及其蛋白质的表达情况.分别给予不同放射剂量(0、2、4、6、8 Gy)照射,MTF法绘制细胞存活曲线.结果:靶向EGFR的序列特异性shRNA可明显抑制EGFR基因的表达,EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为77.5%和76.1%;序列特异性shRNA-EGFR可明显提高SKOV3细胞对放疗的敏感性,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:体外研究表明RNAi沉默EGFR基因可以提高卵巢癌SKOV3细胞对放疗的敏感性.     

小分子干扰RNA下调星形细胞上调基因1的表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)下调星形细胞上调基因1(AEG-1)表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响。方法卵巢癌细胞株SKOV3分为3组:空白对照组(不做任何处理)、阴性对照组(对照siRNA转染)和观察组(AEG-1 siRNA转染)。用反转录聚合酶链反应观察AEG-1 siRNA对AEG-1基因表达的影响;甲基噻唑基四唑法观察AEG-1 siRNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测AEG-1 siRNA对卵巢癌SKOV3细胞凋亡和细胞周期的影响。结果空白对照组和阴性对照组AEG-1 mRNA表达、SKOV3细胞增殖、细胞凋亡率及在DNA合成前期(G0/G1期)、合成期(S期)、合成后期(G2/M期)的细胞比例差异均无统计学意义(P>0.05)。观察组SKOV3细胞AEG-1 mRNA表达显著低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。观察组SKOV3细胞增殖在24、48、72 h较空白对照组和阴性对照组均显著减慢,差异有统计学意义(P<0.01)。观察组SKOV3细胞凋亡率显著高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01);观察组SKOV3细胞在DNA合成前期(G0/G1期)细胞比例显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),而合成期(S期)、合成后期(G2/M期)的细胞比例均显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),差异均有统计学意义。结论 siRNA可通过下调卵巢癌SKOV3细胞AEG-1基因的表达,抑制其增殖,促进其凋亡。     

ARLTS1基因重组质粒对卵巢癌细胞株SKOV3生长和凋亡的影响

目的 探讨Ras超家族成员ARLTS1基因对卵巢癌细胞株SKOV3生长及凋亡的影响.方法 构建真核表达质粒pCMV-Tag 3B-ARLTSI,并转染卵巢癌SKOV3细胞株,采用RT-PCR技术和Western blot方法检测ARLTS1基因转染组、空载体pCMV-Tag 3B转染组和未转染组中ARLTS1 mRNA及蛋白表达水平,用MTT及流式细胞仪检测各组细胞生长、周期及凋亡率等生物学行为的变化,Western blot检测细胞easpase-3和bcl-2蛋白表达水平的变化.结果 真核表达质粒pCMV-Tag 3B-ARLTSI转染SKOV3细胞后,经PCR和Western blot证实转染成功.ARLTSI转染SKOV3细胞后,细胞生长明显受抑(P<0.05).流式细胞术检测发现ARLTS1基因转染组与空载体转染组及未转染组细胞相比,S期细胞比例明显增多(P=0.035和0.011,细胞凋亡率(36.7%)显著高于另两组细胞(P均<0.001).ARLTS1基因转染组细胞中caspase-3和bel-2蛋白表达水平分别下降34.9%和47.7%,与未转染组细胞相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 ARLTS1基因转染后能抑制人卵巢癌细胞SKOV3的生长,调控SKOV3细胞周期,可能通过caspase途径促进肿瘤细胞凋亡·     

RNAi抑制EGFR基因增强卵巢癌细胞对泰素敏感性的研究

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因在卵巢癌细胞对泰素敏感性的增强作用.方法 构建针对EGFR基因序列特异性shRNA的表达载体,用脂质体转染卵巢癌SKOV3细胞及G418筛选阳性克隆.采用RT-PCR、Western blot检测EGFR基因的抑制情况,用MTT法检测卵巢癌细胞对泰素的敏感性.结果 靶向EGFR的序列特异性shRNA可明显抑制EGFR基因的表达,EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为77.5%和76.1%;序列特异性shRNA-EGFR可明显提高卵巢癌细胞对泰素的敏感性,差异有统计学意义(P<0.01).结论 体外实验证实抑制EGFR基因的表达可提高卵巢癌细胞的化疗敏感性.     

WT1反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

[目的]研究WT1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。[方法]实验分4组:正常对照组(加入转染液)、反义组(脂质体+反义寡合苷酸转染)、正义组(脂质体+正义寡合苷酸转染)和脂质体组(只加入脂质体)。分组转染卵巢癌SKOV3细胞株后,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR检测WT1 mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平。[结果]脂质体介导的WT1反义寡核苷酸转染明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,抑制率为49.48%,G0-G1期细胞分布率增加达(79.10±2.79)%,凋亡细胞群明显增多,凋亡率为(13.18±2.00)%,同时转染后细胞WT1 mRNA及蛋白表达水平下降,与对照组及其他各组相比较差异均有显著性意义(P<0.05)。[结论]WT1反义核酸能抑制卵巢癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。WT1反义核酸用于卵巢癌的基因治疗具有一定的潜在意义。     

RNAi沉默EGFR基因在卵巢癌裸鼠移植瘤的成瘤抑制作用

目的:探讨应用RNA干扰技术沉默EGFR基因对卵巢癌SKOV3细胞成瘤力的抑制作用.方法:构建针对EGFR序列特异性dsRNA的表达载体,用脂质体转染SKOV3细胞及G418筛选阳性克隆.建立裸鼠移植瘤模型,分为阳性干扰组、阴性对照组、空白对照组.监测瘤体积,测量瘤质量,采用RT-PCR、Western Blot、免疫组化检测移植瘤EGFR基因的表达.结果:阳性干扰组成瘤力明显降低,EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为78.8%和76.4%.结论:动物实验证实RNAi沉默EGFR基因可明显抑制卵巢癌的成瘤力.     

微小RNA-134-5p靶向作用于EGFR对卵巢癌SKOV3和A2780细胞生长的影响

目的 探讨微小RNA-134-5p(miR-134-5p)靶向作用于表皮生长因子受体(EGFR)基因对卵巢癌细胞生长的影响.方法 以卵巢癌细胞系SKOV3和A2780为研究对象,根据处理方法分为对照组(转染miR-NC)和实验组(转染miR-134-5p).采用qRT-PCR和Western blot检测EGFR基因及下游靶蛋白的表达量;流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡情况;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成实验检测卵巢癌细胞增殖能力.结果 实验组EGFR基因及下游靶蛋白表达显著下调,其中SKOV3细胞中EGFR mRNA下调至48％(P＜0.05),A2780细胞中EGFR mRNA下调至47％(P＜0.05).实验组细胞的细胞周期明显受到抑制(P＜0.05),miR-134-5p通过EGFR靶蛋白诱导细胞凋亡(P＜0.05).实验组细胞的增殖活性和集落形成能力明显受到抑制(P＜0.05).结论 miR-134-5p可通过靶向抑制EGFR基因,促进细胞周期停滞和细胞凋亡,降低卵巢癌细胞的增殖能力.     

Eg5基因在神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡中的作用

目的探讨Eg5基因对神经母细胞瘤(NB)细胞增殖和凋亡的影响。方法取2株NB细胞株SHSY-5Y和NBL-S,分别转染针对Eg5基因的小干扰RNA(siRNA),分为细胞对照组(用等体积的水代替siRNA,只含有脂质体,未转染细胞)、siRNA对照组(转染siRNA对照)和siRNA干扰组(转染Eg5 siRNA),每组6孔,每孔1×10~6个细胞。使用实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测Eg5 mRNA表达水平的变化;使用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入实验和克隆形成实验检测下调Eg5表达对NB细胞增殖的影响;使用流式细胞术检测下调Eg5表达对NB细胞凋亡和细胞周期的影响。结果荧光定量PCR检测结果显示,siRNA干扰组Eg5 mRNA表达水平与细胞对照组和siRNA对照组相比显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);EdU掺入实验和克隆形成结果表明,siRNA干扰组细胞中DNA的合成量和细胞克隆数量低于细胞对照和siRNA对照组,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,细胞对照组和siRNA对照组细胞的凋亡比率低于siRNA干扰组细胞的凋亡比率,差异有统计学意义(P<0.05);细胞周期的检测结果显示,细胞对照组和siRNA对照组细胞中G0/G1期所占比率<50%,而siRNA干扰组细胞中G0/G1期所占比率>70%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在NB细胞中使用siRNA下调Eg5表达,能够抑制NB细胞增殖,促进细胞凋亡。     

RNA干扰技术对SKOV3细胞EGFR表达的抑制作用

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术对卵巢腺癌细胞株SKOV3表皮生长因子受体(EGFR)表达的抑制作用。方法体外化学合成EGFR序列特异性双链RNA(dsRNA),用lipofectamin 2000转染SKOV3细胞,采用RT-PCR和Western blotting技术检测EGFR mRNA和蛋白水平的变化,通过水溶性四唑盐(WST-1)比色法检测细胞增殖力,采用细胞黏附和移动实验检测细胞体外黏附和移动能力,通过细胞侵袭重建基底膜实验检测细胞体外侵袭能力。结果序列特异性dsRNA-EGFR对SKOV3细胞EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为73.65%和58.94%。dsRNA-EGFR组在转染后24、48、72 h细胞增殖抑制率分别为22.54%、35.76%、31.07%;dsRNA-EGFR组在30 min和90 min黏附实验中的黏附率分别下降12.11%和18.66%;转染dsRNA-EGFR后细胞体外移动和侵袭能力的抑制率分别为25.47%和22.08%。结论化学合成的dsRNA可抑制卵巢癌SKOV3细胞EGFR表达,抑制细胞增殖、移动、黏附和侵袭力。     

靶向EGFR基因RNA干扰对胃癌细胞BGC823细胞增殖和凋亡的影响

目的利用R NA干扰技术下调表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,观察其对胃癌BGC823细胞增殖和凋亡的影响。方法将细胞分为3组,空白对照组、空载体组和实验组(转染EGFRshRNA组)。构建针对EGFR基因的s和R NA真核表达载体,转染入胃癌BGC823细胞中,运用R T-PCR和Western blot检测EGFR在mRNA和蛋白水平的变化;WST-1法检测细胞增殖的影响:Hoechst33258染色观察细胞核形态学变化。实验重复3次。结果成功构建表达质粒pGenSil-EGFR并转染BGC823细胞,shRNA下调EGFR的表达后,与空白对照组相比EGFR在mR NA和蛋白水平的表达均下降,抑制率分别为58.6%和75.2%。shR NA转染24、48、72 h,WST-1法检测胃癌细胞BGC823的增殖情况,与空白对照组相比,24 h后三组差异不明显(F=0.326,P>0.05),48 h及72 h后,细胞增殖明显下降(F=68.25及274.45,P<0.001),有统计学意义。EGFR shR NA作用BGC823细胞72 h后,经Hoechst33258染色发现,实验组细胞核染色质边集,出现凋亡小体。结论靶向EGFR基因RNA干扰能够阻抑胃癌细胞BGC823细胞的EGFR表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,EGFR基因有望成为胃癌基因治疗靶点。     

外加磁场对SPIO-shRNA分子探针转染卵巢癌SKOV3细胞的影响

目的 探讨外加磁场对SPIO-shRNA分子探针转染人卵巢癌SKOV3细胞的影响。方法 设定质量浓度为45 mg/L的SPIO-shRNA分子探针转染人卵巢癌SKOV3细胞,并将SKOV3细胞分为3组:未转染的细胞组(空白对照组),SPIO-shRNA分子探针转染的细胞组(阴性对照组),培养皿底部外加磁场的SPIO-shRNA分子探针转染的细胞组(实验组)。采用流式细胞术检测细胞转染率,CCK-8法检测细胞增殖及活性,Western blot法检测细胞表皮生长因子受体(EGFR)蛋白水平,荧光定量PCR检测EGFR mRNA 水平,磁共振(MR)扫描检测细胞内信号强度变化。结果 与阴性对照组比较,实验组的细胞转染率[(79.20±3.31)%]显著增加(P=0.001);实验组的细胞活性(P=0.011)、EGFR蛋白及mRNA表达量均明显降低(P均＜0.05);实验组的MR图像信号强度明显降低( P=0.0004)。结论 外加磁场可以诱导SPIO-shRNA分子探针进入卵巢癌SKOV3细胞,从而提高细胞的转染率。     

CD146过表达对SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响

目的：研究 CD146基因在卵巢癌细胞 SKOV3中过表达对其接种裸鼠皮下生成肿瘤能力的影响。方法:以脂质体介 导的CD146基因转染卵巢癌细胞SKOV3,G418筛选阳性克隆细胞,并经Western blot鉴定其过表达CD146蛋白。分别应用MTT 与软琼脂克隆形成试验评价过表达 CD146克隆细胞对细胞增殖与体外集落形成能力的影响,并将这些细胞接种裸鼠皮下组 织,每周观察、记录肿瘤的生长状况至裸鼠处死,称量肿瘤重量并对肿瘤组织进行免疫组织化学染色观察。结果:SKOV3细胞经 脂质体转染与 G418筛选后,可获得过表达 CD146的阳性克隆细胞。CD146过表达明显抑制了 SKOV3细胞的体外增殖能力与 集落形成能力,亦明显抑制了裸鼠皮下的肿瘤生成能力,其肿瘤重量与体积明显比对照组小（P < 0.05）。免疫组织化学染色结 果表明过表达CD146的SKOV3细胞接种裸鼠生成的肿瘤组织仍可高表达CD146蛋白分子。结论:CD146过表达明显抑制卵巢 癌细胞SKOV3的体外增殖能力与裸鼠体内的致瘤性,可能是卵巢癌预后的一个潜在分子标记。     

Survivin反义核酸对SKOV3细胞生长及Survivin基因表达的影响

目的 :观察Survivin反义核酸对人卵巢癌细胞系SKOV3的生长及Survivin基因表达的影响。方法 :应用基因重组技术 ,将在真核细胞中能稳定表达反义Survivin的pcDNA3 SVVas经脂质体LipofectamineTM2 0 0 0 介导转染人卵巢癌细胞株SKOV3,经G4 1 8筛选得到抗性克隆 (SKOV3/SVVas) ,同时以空载体pcDNA3转染SKOV3作为对照(SKOV3/neo) ;绘制细胞生长曲线 ;采用免疫组化、RT PCR和流式细胞仪检测SKOV3、SKOV3/neo及SKOV3/SVVas细胞的内源性SurvivinmRNA及蛋白的表达和凋亡细胞。结果 :与SKOV3及SKOV3/neo细胞比较 ,SKOV3/SVVas细胞增殖和代谢能力均明显降低 ,Survivin蛋白阳性表达率及mRNA相对表达量明显降低 (P <0 .0 1 ) ,细胞凋亡率显著增加 (P <0 .0 1 )。结论 :稳定表达的反义Survivin能够有效抑制SKOV3细胞内源性Survivin蛋白的表达 ,诱导SKOV3细胞凋亡。     

杨梅素对人卵巢癌SKOV3细胞的凋亡诱导作用

目的:观察杨梅素对人卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制及凋亡诱导作用,并探讨其可能机制。方法:体外培养人卵巢癌SKOV3细胞,按杨梅素给药浓度将细胞分为对照组和低、中、高浓度杨梅素组,杨梅素给药浓度分别为0、20、40和60 mg·L^-1。MTT法检测各组SKOV3细胞存活率;激光共聚焦显微镜观察各组SKOV3细胞核形态变化并计算异常细胞核比率;免疫荧光法检测各组SKOV3细胞中凋亡相关蛋白-活化半胱氨酸蛋白酶3(active Caspase-3)的表达;Western blotting法检测各组SKOV3细胞中DNA损伤相关蛋白γ-H₂AX的表达水平。结果:与对照组比较,低、中和高浓度杨梅素组SKOV3细胞存活率明显下降(t=-12.35,t=-11.42,t=-10.21,P<0.05);激光共聚焦显微镜下各浓度杨梅素组细胞出现核皱缩等凋亡形态学改变,且细胞中异常细胞核比率高于对照组(t=6.87,t=9.35,t=7.22,P<0.05),高浓度杨梅素组异常细胞核比率高于低、中浓度杨梅素组(t=9.55,t=7.25,P<0.05);随着杨梅素给药浓度的增加,SKOV3细胞中active Caspase-3的表达水平有升高趋势,各浓度杨梅素组SKOV3细胞中γ-H₂AX的表达水平高于对照组(t=5.41,t=3.21,t=6.58,P<0.05)。结论:杨梅素可抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导其凋亡,DNA双链断裂可能是其促凋亡的机制之一。     

Nek2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响

目的研究RNA干扰Nek2表达对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响以及相关的分子机制。方法设计合成3条针对Nek2基因的siRNA,转染至SKOV3细胞中,采用Real-time RT-PCR和Western blot技术筛选出抑制效率最高的Nek2-siRNA序列,用Transwell方法检测转染该序列的SKOV3细胞侵袭能力的改变,并用Western blot方法检测Nek2-siRNA转染后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白表达的变化。结果①RNA干扰序列2对SKOV3细胞中Nek2的抑制效果最明显;②与未转染组和阴性对照组相比,转染了Nek2-siRNA的SKOV3细胞侵袭能力明显下降(P<0.01);③Western blot检测表明,与未转染组和阴性对照组相比,Nek2-siRNA转染48 h后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9的表达明显下调,而TIMP-1的表达明显上调(P<0.01)。结论 Nek2-siRNA能有效得沉默SKOV3细胞中Nek2的表达,通过下调MMP-2、MMP-9的表达,上调TIMP-1的表达,从而抑制SKOV3细胞的侵袭转移。