肠道病毒71型外壳蛋白VP1在大肠杆菌的表达和纯化

目的分析重组肠道病毒71型外壳蛋白VP1（EV71 VP1）在大肠杆菌的表达及其部位,纯化重组蛋白VP1,为后续制备抗VP1单克隆抗体奠定基础。方法采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导VP1在质粒转化菌BL21中的表达;用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE和Western blot分析VP1的表达形式和抗原性;优化EV71 VP1原核表达条件。结果 SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后的VP1为一单一条带,相对分子质量约36 000,与预期大小相符;Western blot检测证实该蛋白能分别与兔抗EV71外膜蛋白和兔抗His-tag多克隆抗体发生特异性结合,其最佳表达条件为37℃,1.25 mmol/L IPTG诱导4 h。结论原核表达了EV71 VP1,经纯化复性后VP1具有良好的抗原性,为后续工作奠定了基础。     

龙门县2009年手足口病病原基线调查

目的：了解惠州市龙门县2009年引起手足口病的病原体分型,为保护不同人群特别是高危人群的健康提供科学理论依据。方法：采用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）方法,采集临床诊断为手足口病患者的咽拭子、肛拭子、疱疹液及粪便等标本进行肠道总病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型核酸检测;运用描述性流行病学研究方法分析龙门县手足口病流行病学特征。结果：从46例手足口病患者中共采集90份标本,经Real-timePCR检测,84份肠道总病毒阳性,阳性率为93.33%;5份为肠道病毒71型（EV71）阳性,阳性率为5.56%;68份为柯萨奇病毒A16型（CoxA16）阳性,阳性率为75.56%;CoxA16和EV71两者阳性率之比为13.6：1。结论：从该组手足口病患儿检测到的病原体以CoxA16感染为主,其次是EV71,开展手足口病流行病学和病原学研究,为制定更好的预防控制措施提供实验依据。     

EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒的构建

目的利用昆虫杆状病毒表达系统构建肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)联合P1基因(HP1)重组杆状病毒。方法利用重叠PCR的原理,设计合成HP1基因;HP1基因与载体pFastBac1连接后转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组穿梭杆粒HP1-bacmid;提取纯化重组杆粒转染Sf9细胞,收获重组杆状病毒;以SDS-PAGE、Western blot进行重组蛋白鉴定。结果成功合成HP1基因;完成HP1与pFastBac1载体连接;获得了重组穿梭杆粒HP1-bacmid;并通过转染Sf9细胞,获得具有感染活性的重组杆状病毒;SDS-PAGE电泳结果显示重组病毒感染的Sf9细胞表达了大小约为100×103 Mr的目的蛋白条带,经Western blot鉴定,该条带能与EV71单克隆抗体特异结合。结论成功构建了EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒,为下一步EV71/CA16联合P1蛋白的免疫鉴定奠定基础,并为兼抗EV71、CA16疫苗的研究提供参考。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1的可溶性表达、纯化及活性鉴定

目的克隆、表达和鉴定肠道病毒71型(EV71)VP1基因,得到可溶性的蛋白VP1,为制备EV71的抗体和诊断试剂的开发打下基础。方法优化EV71VP1蛋白基因,克隆并构建重组表达质粒pET15b/VP1,转化大肠杆菌BL21。使用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Westernblotting检测目的蛋白。以重组蛋白VP1为抗原,ELISA检测抗原活性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量为36000,与预计大小一致。ELISA实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了EV71VP1蛋白,并得到可溶性的蛋白,对肠道病毒71型诊断试剂的开发有进一步潜在的应用价值。     

我国手足口病病原体变迁及EV71疫苗上市的潜在影响研究进展

预防接种疫苗,是全球公认的最经济、最有效的手段。我国于2015年12月到2017年5月,先后有3种手足口病疫苗（包括中国医学科学院医学生物研究所EV71人二倍体细胞疫苗、北京科兴生物制品有限公司EV71灭活疫苗和武汉生物制品研究所EV71灭活疫苗）经国家食品药品监督管理总局上市。手足口病疫苗作为一种预防控制手足口病的措施,其效果和对手足口病流行的影响受到业内高度关注。HFMD在我国流行有明显的季节性,最常见的病原体为肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A16型（CoxA16）。本文就上述3种HFMD疫苗（EV71）的免疫对象、免疫程序、免疫原性、免疫效果、交叉免疫以及EV71疫苗上市后普通病例、重症病例和死亡病例的病原学变迁情况进行综述,旨在为手足口病防控措施提供科学依据。     

肠道病毒71型VP1基因的表达纯化及初步应用

摘　要：目的 表达纯化肠道病毒71型（EV71）VP1蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA检测方法。方法 通过化学法合成肠道病毒EV71型VP1全基因序列,构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,转化大肠杆菌Bl21（DE）3 ,IPTG诱导表达,镍金属亲和层析纯化目的蛋白,产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定。以目的蛋白作为包被抗原,初步建立间接ELISA 检测方法。结果 成功构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,表达纯化出较高纯度的EV71 VP1融合蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA 检测方法。检测77份6-10岁健康儿童、手足口病现症患儿血清中抗EV71 VP1 IgG抗体阳性率分别为51.22%、61.11%。结论 表达产物具有较好的免疫原性,可用于肠道病毒EV71抗体检测试剂盒的研制。     

肠道病毒71型VP1蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP1外壳蛋白单克隆抗体。方法:利用重组纯化的EV71-VP1蛋白为抗原免疫BALB/c鼠,按常规杂交瘤技术进行细胞融合,对阳性杂交瘤细胞进行筛选及亚克隆,获得1株能稳定分泌抗EV71-VP1抗体的杂交瘤细胞株6F2B9,细胞体外扩大培养后的上清用Protein G柱纯化,超滤后用BCA法测其浓度,用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,间接ELISA方法检测其效价和特异性,间接免疫荧光法检测其与EV71病毒的特异性结合能力。结果:本研究得到的抗EV71-VP1抗体DSE-136,纯化后浓度为1.9 g/L,免疫球蛋白亚类为IgG2b,轻链属于κ链;间接ELISA检测效价为1∶3.2×105;间接免疫荧光结果显示其可与EV71病毒特异性结合。结论:成功制备出1个效价高、特异性好的抗EV71-VP1单克隆抗体DSE-136,为VP1抗原诊断、疫苗研发及其效果评价奠定了基础。     

Bioinformatics analysis and B-cell epitope prediction of VP1 gene of enterovirus 71 isolated in Lu′an city

目的 对肠道病毒71型(EV71)VP1基因编码衣壳蛋白进行系统结构与功能预测,为制备EV71疫苗和诊断抗原的研究提供理论基础.方法 基于编号为1404-Luan(CHN)-08的EV71六安地区分离株VP1基因编码蛋白的氨基酸序列,应用ProtParam、SigalP、TMPRED、Sosui、SOPMA、Phyre、Bepipred等生物信息学方法预测其信号肽、跨膜区、疏水性、二级结构、三级结构等性质和潜在的B细胞表位.结果 EV71六安地区分离株VP1基因编码蛋白没有信号肽,无跨膜区,是一个亲水性蛋白;VP1蛋白二级结构以无规则卷曲和β-片层为主,含有少量的α-螺旋,少见β-转角; VP1的三级结构中4～121氨基酸部分在蛋白表面形成一环状结构(VPl GH loop);EV71 VP1潜在的B细胞表位共有6个可能的抗原表位.其中,预测分值最高的线性表位区域位于157～177位氨基酸残基.结论 成功预测了EV71六安地区分离株VP1二级结构、三级结构和B细胞表位,为制备EV71基因工程疫苗和诊断抗原的开发提供了理论基础.     

肠道病毒71型六安地区分离株VP1基因的生物信息学分析及B细胞表位预测

目的对肠道病毒71型(EV71)VP1基因编码衣壳蛋白进行系统结构与功能预测,为制备EV71疫苗和诊断抗原的研究提供理论基础。方法基于编号为1404-Luan(CHN)-08的EV71六安地区分离株VP1基因编码蛋白的氨基酸序列,应用ProtParam、SigalP、TMPRED、Sosui、SOPMA、Phyre、Bepipred等生物信息学方法预测其信号肽、跨膜区、疏水性、二级结构、三级结构等性质和潜在的B细胞表位。结果 EV71六安地区分离株VP1基因编码蛋白没有信号肽,无跨膜区,是一个亲水性蛋白;VP1蛋白二级结构以无规则卷曲和β-片层为主,含有少量的α-螺旋,少见β-转角;VP1的三级结构中4～121氨基酸部分在蛋白表面形成一环状结构(VPl GH loop);EV71 VP1潜在的B细胞表位共有6个可能的抗原表位。其中,预测分值最高的线性表位区域位于157～177位氨基酸残基。结论成功预测了EV71六安地区分离株VP1二级结构、三级结构和B细胞表位,为制备EV71基因工程疫苗和诊断抗原的开发提供了理论基础。     

肠道病毒71致神经系统损害及肺水肿的研究进展

肠道病毒71（Enterovirus type 71,EV71）属小RNA病毒科,1969年首先从美国加利福尼亚州1例死于脑炎的9月龄婴儿粪便中发现。其后,美国、澳大利亚、瑞典、日本、保加利亚、匈牙利、中国香港、马来西亚、新加坡等国家和地区均有EV71感染流行的报道。EV71感染的发病高峰在夏秋季,婴幼儿为易感     

镇江地区肠道病毒71型VP1基因的检测及系统进化分析

目的检测我国镇江地区2008年手足口病(HFMD)散发病例中的肠道病毒71型(EV71),并进行毒株的种系进化分析。方法采集临床HFMD患者粪便标本,抽提病毒RNA,通过巢式聚合酶链反应技术进行特异性扩增。经琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的标本,采用EV71特异性引物对其VP1区的核苷酸序列进行扩增。扩增的VP1片段经纯化后与测序载体PET32a(+)连接,转化大肠埃希菌DH5α,并对阳性质粒进行酶切和测序鉴定。利用Clustalx和MEGA4.0分析软件,进行系统进化分析。结果通过聚合酶链反应扩增获得EV71VP1基因,根据遗传进化分析发现该病毒株与1999、2000年在美国亚特兰大以及2000年中国北京地区流行的EV71型遗传距离较近,均属于C型。结论镇江地区HFMD患者中分离的EV71病毒株属C基因型。     

肠道病毒71型特异性单克隆抗体的制备及其在病毒鉴定中的应用

目的：建立肠道病毒71型（ EV71）特异性检测的免疫荧光方法用于病毒分离培养后的EV71鉴定,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法：以EV71 VP1为免疫原制备单克隆抗体,用经测序鉴定的肠道病毒毒株建立EV71特异性免疫荧光方法;将不同地区收集的手足口病患儿的临床标本进行病毒分离,利用EV71特异性单抗进行分离培养后的病毒鉴定。结果：制备获得2株单抗,经鉴定其中1株3 E12为EV71特异性单抗;以此单抗建立的免疫荧光方法对EV71感染细胞呈阳性反应,而与柯萨基病毒A16和埃可病毒6等非EV71肠道病毒不反应。从104份手足口病临床标本中共分离到35株病毒,产生肠道病毒典型的细胞病变;用3E12特异性单抗免疫荧光鉴定分离病毒,其中29株为EV71,与RT-PCR验证结果完全一致。结论：成功制备获得EV71特异性单克隆抗体,以此单抗建立的EV71特异性免疫荧光方法敏感性高、特异性强,可用于分离培养EV71的鉴定。     

泰安市2013年手足口病病原体检测结果分析

目的对2013年泰安市手足口病病例进行病原体检测和分析。方法对临床诊断为手足口病病例的粪便标本505份,用实时荧光定量PCR筛选出肠道病毒通用引物阳性的标本,再分别使用Cox A 16和EV71型的特异引物进行分类检测。结果标本总肠道病毒阳性率为95.05%（408/505）,Cox A 16阳性率为31.09%（157/505）,EV71阳性率为27.92%（141/505）,其他肠道病毒阳性率为36.24%（183/505）,Cox A 16的阳性率高于EV71。发病年龄多为1-6岁,男性多于女性。结论 2013年度泰安市的手足口病疫情以EV71和Cox A 16并发为主,采用分子生物学方法检测手足口病的病原体,对手足口病的监测及防控具有重要作用。     

2010年东莞市手足口病病原监测分析

目的了解东莞市手足口病病原谱构成及其流行特征。方法采用实时荧光PCR检测2010年手足口哨点监测医院上送的标本,应用Excel和SPSS分析。结果380例病原阳性病例中,EV71（占29.47%）所占构成比略高于CoxA16（占24.47%）,未分型肠道病毒占46.05%。病原感染构成比无性别差异,以5岁以下人群感染为主（占96.72%）。EV71与CoxA16在0~1岁人群感染构成比最低（各为14.43%与11.34%）,在1～5岁人群感染构成比较稳定（占36.13%）,6岁后以EV71感染为主（占40.0%）;3～7月以EV71与CoxA16流行为主,其中6～7月以EV71为主（约占47.91%）;8月后以未分型感染为主,其中10～12月感染构成比最高（占87.50%）;各监测点EV71与CoxA16呈交替流行,未分型肠道病毒占较大比例。病例样品检出率较高（达89.41%,380/425）,以粪便为主（占87.29%）,其检出率明显高于肛拭子（73.08%）。结论东莞市手足口病病原谱构成与流行在人群年龄、时间、地域方面均呈动态变化,以CoxA16伴随EV71流行为主,其它未分型肠道病毒也占相当比重。     

2011-2012年深圳市重症手足口病的病原学和流行病学分析

目的了解深圳市手足口病(HFMD)重症病例的病原学类型和流行病学特征,为本地区手足口病的预防控制提供理论依据。方法收集2011-2012年深圳市各医院送检的220例手足口病重症病例的粪便样本,应用Real-time RT-PCR技术检测肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)、肠道病毒通用型(EN)。结果 2011-2012年深圳市共发现220例重症手足口病病例,其中,2012年HFMD重症患者数量为2011年的32.53%。220例重症手足口病病例中,EV71型占80.45%,CA16型占5.00%,其他肠道病毒则占13.19%。2011年5、6月为深圳市手足口病重症的高发月份,而2012年5月和7月为高发月份。1岁组重症病例最多有82人,占重症病例总数的37.27%。重症病例人群男性多于女性(1.62∶1)。结论 EV71是引起深圳市手足口病重症病例的最主要原因,其他肠道病毒比CA16更容易引起手足口病重症。     

一步法RT-PCR检测手足口病EV71、CA16病毒核酸

目的检测手足口病病原核酸,了解濮阳市手足口病病因和不同标本检测状况。方法对濮阳市辖区内手足口病43例住院患者的咽拭子、疱疹液和血清样本进行一步法RT-PCR检测。结果 43例患者的72份标本中,病原核酸EV71阳性23份,阳性率为31.94%。其中,咽拭子阳性率为39.53%(17/43),疱疹液阳性率为66.67%(6/9),血清阳性率为0%(0/20),CoxA16未检出。结论濮阳市手足口病流行由肠道病毒EV71引起,不同标本中疱疹液和咽拭子病毒含量多。     

病毒性脑炎患者脑脊液肠道病毒和EV71检测与分析

目的 探讨肠道病毒和EV71所致脑炎的发病情况及荧光定量PCR诊断病毒性脑炎的意义.方法 收集银川市118例临床诊断病毒性脑炎、脑膜炎患者脑脊液和血清,用荧光定量PCR检测肠道病毒和EV71阳性率及病毒拷贝数,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）定性检测血清EV71病毒IgM抗体.结果 荧光定量PCR检测肠道病毒阳性病例42例,检测阳性率为35.6％;EV71阳性病例22例,检测阳性率为18.6％,占EV阳性病例的52.3％;ELISA定性检测EV71病毒IgM抗体,阳性病例30例,检测阳性率25.4％,肠道病毒和EV71病毒性脑炎患者6岁以内幼儿明显多见于其他年龄组.结论 肠道病毒是本地区病毒性脑炎、脑膜炎患者最常见的病原体,EV71可能是本地区肠道病毒性脑炎中最多见的一种,肠道病毒和EV71感染所致脑炎都以6以内幼儿为主;荧光定量PCR对EV71检测特异性高于ELISA.     

OAS基因多态性与肠道病毒71感染易感性关系

目的探讨2′-5′寡聚腺苷酸合成酶（OAS）1、2、3基因单核苷酸多态性（SNP）与肠道病毒71型（EV71）感染遗传易感性的关系,探讨不同基因型对EV71感染患病风险及病情程度的影响。方法收集2011年11月—2012年12月山东青岛地区的EV71检测为阳性的手足口病病儿163例,提取病儿外周血白细胞基因组DNA,采用序列特异性引物-聚合酶链反应技术检测EV71感染病儿和正常对照儿童OAS1外显子-6区rs1131476（G/A）位点、OAS2内含子-2区rs1293767（G/C）位点及OAS3的5′端rs7132797（C/A）位点SNP。结果组间OAS2内含子-2区rs1293767（G/C）位点基因型CC＋GC、GG及等位基因G、C频数分布与OAS3的5′端rs7132797（C/A）位点基因型AA、CA、CC及等位基因A、C频数分布差异无显著性（P〉0.05）;OAS1外显子-6区rs1131476（G/A）位点基因多态性中基因型AA和等位基因A在重症病儿分布频数较轻症者组明显增高（χ2=6.389、7.002,P〈0.05）,而EV71感染组与正常对照组差异无显著性（P〉0.05）。结论 OAS1rs1131476（G/A）基因SNP与EV71感染病儿疾病严重程度关系密切;基因型AA和等位基因A携带者在EV71感染中易发展为重症。