RNA干扰HIF-1α对血管生成拟态相关基因表达的影响

目的: 探讨常氧及缺氧培养条件下RNA干扰沉默人食管鳞癌细胞Ec a-109缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对血管生成拟态相关基因表达的影响.方法: 选择未转染处理的食管鳞癌Eca-109细胞和3株稳定转染HIF-1α SiRNA的Eca-109细胞, 分别予以常氧和缺氧培养, 缺氧培养12、24、36、48、60、72、96 h, 采用Western blot法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HIF-1α蛋白及mRNA表达, 同时Western blot法检测上皮细胞激酶(EphA2)、血管上皮钙黏附素(VE-cadherin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、层粘连蛋白5γ2链(LN-5γ2)等血管生成拟态相关基因的表达.结果: 缺氧条件下培养Eca-109细胞HIF-1α蛋白表达较常氧时增高, 以24-48 h为明显, 72-96h开始减弱, 而HIF-1α mRNA检测差异无统计学意义( F = 0.70, P = 0.67);RNA干扰后细胞在常氧下HIF-1α、EphA2、LN-5γ2蛋白几乎无表达, 缺氧后亦无增强现象, VE-cadherin、MMP-2蛋白表达较未干扰细胞稍有减弱, 缺氧后表达稍增强, 但差异无显著性(均P>0.05).结论: RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达, HIF-1α基因沉默后可以不同程度减少EphA2、LN-5γ2等血管生成拟态相关基因的表达.     

RNA干扰HIF-1α对食管鳞癌血管生成拟态的影响

背景:研究表明大量高度恶性肿瘤组织中存在血管生成拟态(VM),其分子机制已形成相关假说,但确切机制和关键信号通路尚未明确。目的:探讨缺氧诱导因子(HIF)-1α在食管鳞癌VM形成中的作用。方法:设计合成3种HIF-1α-siRNA质粒,测序后瞬时转染293T细胞,蛋白质印迹法鉴定质粒的干扰效果。将筛选出的pGCsi-HIF3质粒稳定转染食管鳞癌细胞株Eca109和TE13,以蛋白质印迹法检测干扰效果,三维培养法观察VM形成情况,蛋白质印迹法检测VE-cadherin、EphA2、LN5γ2和MMP2蛋白表达。结果:成功构建了3个靶位的质粒,其中pGCsiHIF3的干扰效果最好。pGCsi-HIF3稳定转染食管鳞癌细胞株Eca109和TE13后,与对照组相比,HIF-1α表达明显降低,细胞体外管道形成能力被明显抑制(P0.05)。常氧下转染组细胞中VE-cadherin、EphA2、LN5γ2均显著下调(P0.05),MMP2表达无明显差异,且缺氧条件下上述指标蛋白表达无明显增加。结论:Eca109和TE13细胞能形成管状结构,HIF-1α可能通过调节VE-cadherin、EphA2、LN5γ2等的表达而调节食管鳞癌VM的形成。     

胃癌组织中血管生成拟态的临床意义

血管生成拟态为肿瘤组织提供了不同于经典血管的血供途径,抗血管生成拟态治疗已成为抗肿瘤研究的热点,并已成为判断肿瘤预后不良的标志。本篇就胃癌血管生成拟态的历史、分子调节机制及其临床意义作一综述。     

肿瘤血管生成拟态的研究进展

恶性肿瘤的生长和转移必须以匹配合适的血液供应为前提，而阻断肿瘤的血液供应是攻克肿瘤治疗的一大策略，因此，肿瘤治疗的微循环机制及其结构与功能等，一直是国内外学者们研究的热点。以往的研究认为肿瘤血管是宿主正常的血管系统在肿瘤血管生成因子（Tumor angiogenesis factor，TAF）作用下，血管在形态和功能上发生了一系列改变而形成的。     

HIF-1α、VEGF、p53、CD31对小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态作用的研究

目的 探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、p53、CD31在黑色素移植瘤血管生成拟态(vasculogenesis mimicry,VM)形成中的作用.方法 制作小鼠黑色素移植瘤动物模型,成瘤后每天随机抽取1只小鼠处死,共12 d,获得肿瘤样本114例;HE染色、HIF-1α、VEGF、p53、CD31免疫组化染色和PAS染色.动态观察HIF-1α、VEGF、p53、CD31在黑色素移植瘤VM中的表达.结果 在移植瘤形成的1～8 d,肿瘤组织内存在VM;9～12 d移植瘤中的VM被内皮依赖性血管替代;VM周围肿瘤细胞中CD31、HIF-1α阳性百分率高于远离VM区域的阳性百分率(P＜0.01);内皮依赖性血管周围肿瘤细胞CD31阳性百分率高于远离内皮依赖性血管区域的阳性百分率(P＜0.01);VM周围肿瘤细胞VEGF、p53阳性百分率高于内皮依赖性血管周围的阳性百分率;VM密度与VM周围肿瘤细胞CD31、HIF-1α、VEGF阳性百分率之间存在相关;内皮依赖性血管密度只与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞中CD31阳性百分率之间存在相关.结论 移植瘤中VM是暂时性血液供应方式,渐被内皮依赖性血管替代;HIF-1α、VEGF、p53、CD31均与黑色素移植瘤VM形成有关,其中CD31、HIF-1α作用尤其重要.     

血管生成拟态与肿瘤微循环

血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)是近几年在少数高度恶性肿瘤中发现的一种独立于血管生成的全新肿瘤内微循环模式, 即由恶性肿瘤细胞而非血管内皮细胞围成、细胞外基质界限的血管样结构. VM与肿瘤侵袭、转移及患者预后密切相关, 其发生和肿瘤细胞呈现多潜能胚胎样表型及多种蛋白分子的生物学效应有关, 肿瘤局部微环境也起着重要作用. 现就VM的特点、发生机制及临床意义等研究进展作一综述.     

缺氧诱导因子与食管鳞癌血管生成

食管癌是我国常见的恶性肿瘤 ,且以鳞癌最为多见。食管鳞癌的发生、发展与肿瘤血管生成密切相关。缺氧诱导因子是近期肿瘤血管生成研究的热点因子 ,此文就该因子与食管鳞癌血管生成的研究现状作一综述。     

血管生成拟态是对经典肿瘤血管生成理论的补充

实体瘤的生长需要新生血管输送营养。当肿瘤超过2mm3时要维持持续性生长则依赖降解宿主毛细血管静脉端的基底膜,刺激血管内皮细胞迅速增殖并向肿瘤迁徙,逐步发育成有功能的毛细血管袢,并与宿主血管相互吻合,构成肿瘤的血液循环系统。随着对肿瘤生物学研究的不断深     

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在动脉粥样硬化斑块中的表达及血管生成关系

目的:观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在动脉粥样硬化(As)斑块中的表达,探讨HIF-1α与斑块血管生成的关系。方法:24只Wistar大鼠随机分为正常组8只(普通饲料)和As模型组16只(高脂饮食+VitD3)。实验3个月后,检测血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG);取主动脉石蜡包埋切片,HE染色;测量主动脉斑块占内膜总面积比(RAAPIs),内膜中膜面积比(I/M);免疫组化SP法检测HIF-1α蛋白的表达情况,鼠单克隆抗体CD34计数新生血管数目(MVD)。结果:实验后模型组血清TC、TG水平较正常组明显升高[(3.30±0.35)vs(1.51±0.19);(0.85±0.12)vs(0.50±0.14)],差异有统计学意义(P<0.01);模型组中RAAPIs,I/M明显高于正常组(P<0.05);模型组中HIF-1α蛋白表达增高;正常组中HIF-1α未见表达(87.5%vs 0%,P<0.01);模型组中微血管密度(MVD)明显高于正常组[(13.14±2.45)vs 0,P<0.05];不稳定斑块组HIF-1α、MVD均高于稳定斑块组[(100%vs 66.6%),(14.30±1.70)vs(10.25±1.26),P<0.05)],HIF-1α蛋白表达与MVD表达呈正相关(r=0.704,P=0.005)。结论:HIF-1α可通过促进As斑块内血管生成,从而增加斑块的不稳定性;HIF-1α的含量可能是影响斑块稳定性的重要因素。     

肝细胞肝癌中血管生成拟态的研究

目的探讨肝细胞肝癌（HCC）中是否存在血管生成拟态（VM），并进一步闸述VM存在的临床意义。方法收集99例手术切除并死于HCC临床资料和随访资料完整的病例，进行过碘酸雪夫氏反应（PAS）与CD31双重染色以及CD105、CD31、Hepatocyte免疫组织化学染色检测HCC中是否存在VM。结果12．12％（12／99）的患者HCC具有VM。Edmondson分级Ⅰ～Ⅱ级HCC中VM阳性率（2．5％）低于Ⅲ～Ⅳ级HCC中VM阳性率（18．64％）（x^2=4．416，P〈0．05）；VM组的国际癌症病期分期与无VM组的相比差异无统计学意义，但VM组更易于发生远处转移（x^2=8．873，P〈0．01）。Kaplan-Meier生存分析显示VM阳性组的生存率低于VM阴性组（P〈0．01）。结论HCC中存在VM，恶性度越高HCC形成拟态的能力越强。具有VM的HCC易发生转移，预后差。     

VEGF-A对人肝癌细胞体外形成血管生成拟态能力的影响

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）对人肝癌细胞体外形成血管生成拟态（VM）能力的影响。方法采用不同浓度的VEGF-A诱导人肝癌PLC细胞,分别用划痕实验、明胶酶谱法分析不同浓度VEGF-A对PLC细胞迁移性和侵袭性的影响;三维培养观察VEGF-A对PLC细胞形成VM能力的影响;Western blot法检测VEGF-A处理后的血管内皮钙黏附素（VE-cadherin）表达。结果 VEGF-A呈剂量依赖性增强肝癌PLC细胞的迁移率和侵袭相关蛋白MMP-9的活性,促进管道样结构形成及VE-cadherin表达（P均〈0.05）。VEGF-A水平与管道数量呈正相关（r=0.929,P〈0.05）。结论 VEGF-A可增强肝癌PLC细胞的迁移和侵袭能力,促进其VM形成,使肿瘤组织血供丰富,促进肿瘤浸润和转移。     

NOTCH4基因表达对肝细胞癌血管生成拟态形成的影响

目的研究NOTCH4基因表达对肝细胞癌血管生成拟态(VM)形成的影响。方法收集2010年-2014年间85例病理确诊为肝细胞癌的组织标本,免疫组织化学染色及PAS/CD31双染检测NOTCH4表达与VM的相关性;在体外三维细胞培养体系中靶向抑制肝癌细胞NOTCH4的表达,观察其对VM管状结构形成的影响。采用Mann-Whitney U秩和检验和单因素方差分析处理数据。结果 VM阳性的组织标本中NOTCH4高表达(P=0.019);siRNA组相对于阴性对照组及空白对照组,NOTCH4基因的mRNA表达(P值分别为0.007、0.003)及蛋白表达(P值均为0.000)均明显下调,差异具有统计学意义;靶向抑制NOTCH4的表达影响肝癌细胞在三维细胞培养体系中VM管状结构的形成。结论 NOTCH4基因表达影响肝细胞癌中VM的形成,可能成为肝细胞癌抗血管生成治疗的新靶点。     

乳腺癌组织HER-2扩增状态及其与组织微血管生成拟态的相关性

目的 探讨乳腺癌人类表皮生长因子受体2 （HER-2）蛋白表达及基因扩增状态与组织微血管生成拟态（VM）的关系.方法 选取已确诊乳腺癌患者的石蜡标本组织200例,观察肿瘤组织中VM病理改变.采用免疫组化和荧光原位杂交法检测肿瘤组织中HER-2蛋白和基因的扩增情况,采用CD34和PAS双重染色法观察肿瘤组织中VM的情况,分析HER-2蛋白表达和基因扩增状态与VM的关系,分析HER-2蛋白表达、基因扩增及VM与乳腺癌临床病理参数的相关性.结果 乳腺癌组织中HER-2蛋白阳性率和基因扩增率分别为67.5％（135/200）、19.0％ （38/200）.HER-2蛋白表达及HER-2基因扩增与肿瘤大小和组织学分级相关（P均＜0.05）,VM阳性与淋巴结转移和组织学分级相关（P均＜0.05）.结论 乳腺癌组织中HER-2的表达与肿瘤的恶性进展存在相关性,且HER-2的表达可以促进乳腺癌组织中VM的形成,VM的存在与组织学分级和淋巴结转移关系密切.     

HIF-1α induces VE-cadherin expression and modulates vasculogenic mimicry in esophageal carcinoma cells

AIM: To investigate whether hypoxia inducible factor (HIF)-1α modulates vasculogenic mimicry (VM) by upregulating VE-cadherin expression in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).METHODS: Esophageal squamous cancer cell lines Eca109 and TE13 were transfected with plasmids harboring small interfering RNAs targeting HIF-1α or VE-cadherin. The proliferation and invasion of esophageal carcinoma cells were detected by MTT and Transwell migration assays. The formation of tubular networks of cells was analyzed by 3D culture in vitro. BALB/c nude mice were used to observe xenograft tumor formation. The relationship between the expression of HIF-1α and VE-cadherin, ephrinA2 (EphA2) and laminin5γ2 (LN5γ2) was measured by Western blot and real-time polymerase chain reaction.RESULTS: Knockdown of HIF-1α inhibited cell proliferation (32.3% ± 6.1% for Eca109 cells and 38.6% ± 6.8% for TE13 cells, P < 0.05). Both Eca109 and TE13 cells formed typical tubular networks. The number of tubular networks markedly decreased when HIF-1α or VE-cadherin was knocked down. Expression of VE-cadherin, EphA2 and LN5γ2 was dramatically inhibited, but the expression of matrix metalloproteinase 2 had no obvious change in HIF-1α-silenced cells. Knockdown of VE-cadherin significantly decreased expression of both EphA2 and LN5γ2 (P < 0.05), while HIF-1α expression was unchanged. The time for xenograft tumor formation was 6 ± 1.2 d for Eca109 cells and Eca109 cells transfected with HIF-1α Neo control short hairpin RNA (shRNA) vector, and 8.4 ± 2.1 d for Eca109 cells transfected with an shRNA against HIF-1α. Knockdown of HIF-1α inhibited vasculogenic mimicry (VM) and tumorigenicity in vivo.CONCLUSION: HIF-1α may modulate VM in ESCC by regulating VE-cadherin expression, which affects VM formation through EphA2 and LN5γ2.     

模拟寒区冷暴露环境大鼠胃黏膜内皮素-1与缺氧诱导因子-1α的改变及冬胃颗粒对其影响

[目的]观察模拟寒区冷暴露环境下大鼠胃黏膜内皮素-1（ET-1）与缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）改变及冬胃颗粒保护作用。[方法]健康雄性Wistar大鼠40只，随机分为4组：正常组、模型组、冬胃颗粒组、0．9％氯化钠溶液组，每组10只；正常组室温喂养，正常饮食，其他各组均以寒冷暴露法模拟寒区低温[（-10±2）℃]，处理5d，冬胃颗粒组在其过程中给予冬胃颗粒保护。5d后取各组大鼠胃黏膜以免疫组化方法检测其ET-1与HIF-1α表达。[结果]正常组未见异常；模型组及0．9％氯化钠溶液组大鼠冷暴露后出现寒战、蜷缩少动、尾部紫暗等症状，肉眼可见胃黏膜充血水肿与糜烂，光镜下可见有明显损伤；冬胃颗粒组仅表现有轻微的畏寒喜暖、少动等症状，肉眼与镜下仅可见胃黏膜轻微损伤。冬胃颗粒组胃黏膜ET-1与HIF-1α表达明显低于0．9％氯化钠溶液组与模型组，差异有统计学意义（P〈0．05）。[结论]冬胃颗粒可减轻冷暴露大鼠症状，减轻胃黏膜损伤，并使其胃黏膜ET-1与HIF-1α表达减弱。     

溃疡性结肠炎患者血清低氧诱导因子-1α的检测及意义

[目的]检测溃疡性结肠炎患者血清低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的含量,探讨其在溃疡性结肠炎发病机制中的调控作用及其与患者病情活动性和严重性的关系。[方法]采用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测13例缓解期(缓解期组)、47例活动期(活动期组)UC患者及10例健康体检者(正常对照组)血清中HIF-1α含量,并对活动期组患者行肠镜检查,评价病情轻重程度。[结果]活动期组HIF-1α含量[(73.21±28.65)ng/L]显著高于缓解期组[(44.54±14.75)ng/L]与正常对照组[(42.83±15.49)ng/L],P0.05;缓解期组与正常对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。HIF-1α与病情活动性、病情分型及内镜表现分级呈正相关。[结论]HIF-1α作为一种转录因子可能在UC发病机制中充当重要角色,并可能作为评价UC患者病情活动性及严重程度的良好指标。     

低氧对L02细胞脂肪代谢的影响及其机制

目的 研究低氧对L02细胞脂质代谢的影响及其可能的机制. 方法 以正常人肝细胞株L02细胞为研究靶细胞,对照组和低氧处理组细胞分别在21％和1％氧浓度下培养.油红O染色、甘油三酯(TG)测定检测肝细胞脂肪变程度;RT-PCR法检测细胞内低氧诱导因子(HIF) 2α、固醇调节元件结合蛋白(SREBP) -lc mRNA的表达情况; Western blot法检测HIF-2α亚基、脂肪分化相关蛋白(ADRP)、脂肪酸合成酶(FAS)蛋白的表达量.各组甘油三酯测定值行2×3的析因设计方差分析;两样本均数间比较采用t检验;其他多个样本均数的比较采用单因素方差分析与NewmanKeulS法检验.结果 与对照组比较,低氧组L02细胞内出现脂质沉积,TG含量增多,且随低氧处理时间延长逐渐增多(F=115.04,P＜0.01).低氧12、24、48 h组SREBP-1c mRNA表达水平校对照组下调(0.236±0.043、0.287±0.044、0.342±0.049与0.503±0.037,F=28.37,P＜0.01),FAS蛋白表达水平较对照组下调(0.562±0.054、0.674±0.062、0.682±0.057与0.857±0.069,F=16.08,P＜0.0l).对照组未检测到HIF-2α表达,而低氧处理3h后HIF-2 α蛋白表达逐渐增加,6h后达高峰,12、24h又逐渐降低,各时间点分别为0.609±0.031、0.973±0.067、0.792±0.056、0.437±0.038(F=85.30,P＜0.01);低氧12、24、48h各组ADRP蛋白相对含量分别为0.319±0.043、0.732±0.056、0.873±0.066,均明显高于对照组0.211±0.019(P值均＜0.05),且随低氧时间延长,表达量逐渐增多(F=167.49,P＜0.01).结论 低氧通过HIF-2 α-ADRP途径诱导肝细胞脂肪沉积.     

Hyperphosphorylation of retinoblastoma protein and stimulation of growth by okadaic acid in human pancreatic cancer

Phosphorylation/dephosphorylation of intracellular proteins are important steps in the regulation of cell growth. Okadaic acid, an inhibitor of the serine/threonine protein phosphatases 1 and 2A, is a potent tumor promoter. This effect may be through the inhibition of dephosphorylation (termed hyperphosphorylation) and subsequent inactivation of tumor-suppressor proteins. We examined whether okadaic acid regulates growth of human pancreatic cancer cells (MIA PaCa-2 and Panc-1) or alters the phosphorylation of the retinoblastoma tumor-suppressor protein. Growth studies, nuclear labeling analyses, and Western blotting for retinoblastoma protein were performed. Okadaic acid stimulated cell growth and induced hyperphosphorylation of the retinoblastoma protein. The growth-stimulatory effect of okadaic acid on these human pancreatic cancer cells may be mediated by inactivation of the growth suppressive effect of the retinoblastoma protein by hyperphosphorylation. These studies suggest that the growth of these human pancreatic cancer cells is still regulated by tumor-suppressor proteins.This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5P01 DK35608, 2R01 DK15241, T32 DK07639), the American Cancer Society (CB-571), and the John Sealy Memorial Endowment Fund.     

冠心病患者缺氧诱导因子-1α与血管内皮细胞生长因子的关系

目的探讨冠心病患者体内缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的关系。方法选取经皮冠状动脉造影确定的冠心病患者105例分为3组,其中急性心肌梗死(AMI)组37例,不稳定性心绞痛(UAP)组39例,稳定性心绞痛(SAP)组29例。另设经冠脉造影未发现异常者30例为对照组。采用酶联免疫吸附法测定所有入选对象血清VEGF与HIF-1α水平,采用相关分析法分析两者的相关性。结果 AMI和UAP组HIF-1α、VEGF表达水平明显高于SAP组和对照组(P均<0.05);AMI组HIF-1α和VEGF水平明显高于UAP组(P<0.05);SAP组与对照组比较差异无统计学意义。相关性分析发现,总体水平上HIF-1α、VEGF表达水平呈正相关(r=0.49,P<0.05),AMI、UAP、SAP各组中HIF-1α、VEGF表达水平也呈正相关(rAMI=0.47,rUAP=0.53,rSAP=0.41,P均<0.05)。结论不同类型冠心病患者HIF-1α、VEGF水平有所不同,心肌缺血程度越重则患者体内表达的HIF-1α、VEGF水平越高。冠心病患者VEGF水平的升高可能是心肌缺血诱导的HIF-1α所调控的。