溶藻弧菌抗独特型抗体scFv的原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建溶藻弧菌抗独特型单链抗体(scFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定.方法从分泌溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中已获得的该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建scFv及原核表达载体pET32a-AL,转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达.表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定.结果 scFv基因序列全长747碱基对,编码249个氨基酸,符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有框架区(FRs)、抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的半胱氨酸残基.ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有藻弧菌一样的免疫原性.结论 成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体scFv原核表达载体并表达于包涵体中,表达的融合蛋白具有与溶藻弧菌一样的免疫原性,为溶藻弧菌抗独特型单链抗体scFv成为鱼用基因工程疫苗奠定了初步基础.     

基因工程双功能抗体的分子设计及表达

基因工程双功能抗体在临床肿瘤、病毒病等治疗和诊断方面具有广阔的应用前景,是抗体研究的热点之一。要获得有活性的双功能产物,关键在于分子设计及表达系统的选择。本文着重论述近年来基因工程双功能抗体在分子设计及表达研究方面的新进展。     

基因工程双功能抗体的分子设计及表达

基因工程双功能抗体在临床肿瘤、病毒病等治疗和诊断方面具有广阔的应用前景 ,是抗体研究的热点之一。要获得有活性的双功能产物 ,关键在于分子设计及表达系统的选择。本文着重论述近年来基因工程双功能抗体在分子设计及表达研究方面的新进展。     

人精胺氧化酶的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆、原核表达有酶活性的重组人精胺氧化酶(SMO)蛋白,并制备兔抗人SMO多克隆抗体.方法:采用RT-PCR法从人非小细胞肺腺癌A549细胞株总RNA中克隆人精胺氧化酶cDNA,构建SMO原核表达质粒pET-15b/SMO.将SMO原核表达质粒转化E.coli的BL21(DE3)菌并使用IPTG诱导重组SMO表达.表达的蛋白产物经Ni-NTA亲和层析纯化、透析复性后,化学荧光法测定其酶活性.使用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、纯化重组人SMO蛋白,以此蛋白作为抗原皮内接种日本大耳白兔来制备抗人SMO多克隆抗体.分别以ELISA、Western blot和免疫细胞化学法检测兔血清中抗体的滴度和抗原特异性.结果:纯化并透析复性后的重组人SMO蛋白具备快速氧化精胺的酶活性.用此重组蛋白制备的抗体具有较高抗体滴度和针对人SMO的特异性.结论:建立了人SMO原核表达、纯化系统,获得了有酶活性的高纯度人SMO蛋白并成功制备了兔抗人SMO的多克隆抗体,为以SMO为靶点的抗肿瘤基础和临床研究提供了有力的研究工具.     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体的原核表达及复性

目的　分别在大肠杆菌中高效表达嵌合Fd及嵌合轻链 ,并进行嵌合Fab复性的研究。方法　分别将嵌合Fd及嵌合轻链基因插入到原核表达载体pET32a中 ,构建成重组载体pET32a/cFd和pET32a/cL。转化大肠杆菌后诱导其表达。大量制备表达的嵌合Fd及嵌合轻链后 ,按二者绝对量等摩尔比混合后进行透析复性。然后 ,分别利用SDS PAGE、Westernblot和ELISA进行分析和鉴定。结果　成功获得了嵌合Fd及嵌合轻链的原核非融合高效表达 ,表达蛋白相对分子质量 (Mr)均在 2 4×10 3 左右。表达量分别约占菌体总蛋白的 2 8.3%和 32 .3% ,2种目的蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在。另外 ,嵌合Fd与嵌合轻链在缓慢透析的条件下成功地复性为嵌合Fab抗体 ,Mr 约为 4 2×10 3 ,具有特异性抗原结合活性和良好的亲和力。在起始总蛋白浓度为 10 0 μg/ml时 ,复性效率约为4 9 %。结论　成功实现了嵌合Fab抗体的高效表达及高效复性 ,为进一步探讨其在肝癌治疗中的应用奠定了基础     

抗人红细胞血型A抗原单链抗体原核表达及活性测定

目的 构建并表达抗人红细胞血型A抗原单链小分子抗体（single-chain Fv)蛋白。方法 设计合成抗重、轻链可变区引物,通过重叠延伸拼接PCR技术,在50A mAb VH和VL基因间引入连结短肽,体外构建50A ScFv基因并进行序列分析;将克隆入表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中诱导表达;并以免疫印迹测定重组蛋白的生物学活性。结果 序列分析表明,50A ScFv基因全长747bp,编码249个氨基酸;重组体表达产物聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,融合蛋白的相对分子质量（Mr)为29000左右,与预期的结果一致,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在;光密度扫描结果表明,重组蛋白占菌体总蛋白的16．2％,免疫印迹试验显示,重组小分子抗体保留了亲本mAb的特异性亲和力。结论 成功地构建50A ScFv基因,并在原核细胞中获得较高水平的表达,为进一步研制基因工程血型检定抗体奠定了基础。     

Rig-I蛋白C端Helicase结构域的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

目的:为Rig-I蛋白结构与模式识别功能的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测试剂。方法:PCR法克隆小鼠Rig-I基因Helicase区编码序列(726～2240bp,编码241～746位氨基酸),构建带组氨酸标签的原核表达载体pET15b-mRig-I-H,阳性克隆经酶切、测序鉴定后转化E.coliBL21进行诱导表达。目的蛋白电泳分离并割胶纯化后免疫家兔制备抗血清。抗血清用ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法进行鉴定。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,制备的抗Rig-I抗体效价达到1∶100000,Western blot、细胞免疫荧光结果显示该抗体能够有效地对细胞内Rig-I蛋白的表达水平进行检测。结论:成功地对mRig-I-H进行了原核表达、纯化,抗mRig-I-H的多克隆抗体具有较高的特异性,为进一步研究Rig-I尤其是Helicase区的结构与功能奠定了坚实的基础。     

人心肌肌钙蛋白I的原核表达及其兔抗体的制备

目的:构建人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,并制备兔抗hcTnI抗体。方法:以化学方法合成hcTnI基因并插入融合表达载体pET21a( )的多克隆位点,构建重组表达质粒pET21a( )hcTnI。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,筛选阳性重组子,经IPTG诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Westernblot进行鉴定。以表达的hcTnI蛋白免疫家兔,制备抗hcTnI的抗体并进行纯化及特性鉴定。结果:成功地合成hcTnI基因,测序证实序列正确后亚克隆于表达载体pET21a( )中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,序列分析表明其中的插入序列与cTnI基因完全一致。在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为24000的目的蛋白,约占菌体总蛋白的28%,Westernblot分析显示,表达的hcTnI蛋白具有良好的免疫反应性。以纯化的hcTnI免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价为3×10-4,且具有良好的特异性。结论:成功地构建hcTnI基因的原核表达载体pET21a( )hcTnI,并在大肠杆菌中获得高效表达。制备出兔抗hcTnI的抗体,且效价及特异性均较良好,为进一步建立酶联免疫吸附法检测hcTnI奠定了基础。     

基因工程抗体研究进展

王琰,男,５４岁,教授,解放军海军总医院中心实验科主任,北京医科大学临床肿瘤学院及基础医学院免疫学系兼职教授,第三军医大学兼职教授,主要从事抗体工程研究。抗体是机体内最复杂的分子,以其特有的基因结构和重组形成了巨大的多样性,可结合任何一种抗原,不仅为...     

人白细胞介素18的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化人白细胞介素18（hIL-18)，制备兔抗人白细胞介素18多克隆抗体，方法：用RT－PCR扩增出hIL-18的cDNA克隆到原核表达载体pJW2中，转化大肠杆菌JM101中诱导表达并纯化。用纯化的人白细胞介素18免疫新西兰兔制备多克隆抗体，结果：克隆得到序列正确的IL-18 cDNA，与载体连接后转化入大肠杆菌JM101中诱导表达并成功纯化，并用纯化的人白细胞介素18成功制备了兔抗人白细胞介素18多克隆抗体。结论：制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

基因工程单链抗体的研究进展

抗体的ＶＨ基因的ＶＬ基因经寡核苷酸接头连接成ＳｃＦｙ基因，转入原核或真核表达系统中表达，表达产物具有与亲本抗体相同的抗原结合特性和能力。在ＳｃＦｖ基因的ＶＬＣ端连连接柔曲的铰链和易形成螺旋束或卷曲螺旋结构的寡核苷酸，表达产物能在活细胞内折叠成具有活性的双价ＳｃＦｖ。ＳｃＦｖ是研究蛋白质结构与功能最理想的实验系统，本文拟就有关问题作一综述。     

人磷脂转移蛋白的原核表达及其抗体的制备与鉴定

目的利用大肠杆菌表达人磷脂转移蛋白(PLTP),制备兔抗人PLTP的多克隆抗血清。方法采用RT-PCR技术,将人PLTP蛋白编码序列克隆入pET-30b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备PLTP抗血清。用间接ELISA法、Western blot、细胞免疫荧光检测对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果SDS-PAGE分析表明,PLTP基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为3h;将纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶256000;Western blot及细胞免疫荧光检测显示,抗血清可以与PLTP原核及真核表达蛋白特异结合。结论成功地将PLTP进行了原核表达,制备了高效价、高特异性的兔抗人PLTP抗血清,为PLTP的临床检测及其结构与功能的进一步研究提供了有力工具。     

HSV-1 UL15 exon-Ⅱ的原核表达及抗体制备

目的 构建pQE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ原核表达载体,在大肠埃希菌中高效表达并免疫家兔制备抗体.方法 以HSV-1感染后的Vero细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增HSV-1 UL15 exon-Ⅱ基因,克隆入原核表达载体pQE-31;重组质粒经酶切、测序鉴定无误后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;SDS-PAGE检测蛋白表达情况;表达蛋白用Ni-NTA亲和层析纯化及透析复性处理后免疫家兔制备特异性抗体,抗体的免疫原性用Western blotting进行检测.结果 通过RT-PCR扩增获得了HSV-1 UL15 exon-Ⅱ全长基因;构建的pOE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ重组质粒经酶切及测序鉴定无误;阳性转化菌株经WIG诱导后SDS-PAGE电泳显示表达蛋白的相对分子质量约为43 000,与理论值一致,蛋白表达率约为35%～40%;表达蛋白经纯化及透析复性后免疫家兔获得的抗血清经Western blotting鉴定具有较好的特异性和敏感性.结论 成功构建了pQE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ原核表达载体,诱导蛋白表达并进一步用表达的蛋白制备了特异性抗体,为HSV-1末端酶全长基因表达情况的鉴定及最终构建抗病毒组装药物的分子筛选模型奠定了前期实验基础.     

重组Rab8截短体蛋白的原核表达、纯化和抗体制备

目的 获得Rab8纯化蛋白,制备多克隆抗体,为深入研究Rab8在病毒感染宿主细胞过程中的作用奠定基础.方法 首先从HepG2细胞中克隆Rab基因,然后从Rab8质粒中亚克隆Rab8 C端编码122个氨基酸的基因片段,构建Rab8与6His的融合蛋白原核表达质粒.原核表达与蛋白纯化后,免疫动物,制备Rab8多克隆抗体.采用ELISA法检测其效价.Western检验抗体特异性,间接免疫荧光染色法验证其免疫组化特性.结果 克隆了人Rab8编码基因,构建了表达Rab8 C端编码122个氨基酸的原核表达质粒pQE31-Rab8-122,经过大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,获得相对分子量约15 000的融合蛋白,免疫Balb/c小鼠后收获抗血清.ELISA显示抗体效价达1/20 000.Western blot和免疫荧光染色结果显示此多克隆抗体能够与原核表达的Rab8蛋白发生特异性反应,并能够识别HepG2细胞中内源性Rab8蛋白.结论 本研究获得原核表达的Rab8纯化蛋白,成功的制备了Rab8多克隆抗体,为进一步研究Rab8参与病毒感染宿主细胞提供了重要的实验材料.     

Syncytin蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的克隆人syncytin基因并在大肠杆菌中表达,并用表达后的融合蛋白制备syncytin蛋白多克隆抗体。方法 PCR扩增人syncytin基因编码区的DNA片段,将其克隆入原核表达质粒pET30a(+),转化大肠杆菌BL21,诱导产生syncytin-His融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA、Western-Blot和免疫组织化学等方法来检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功表达并纯化了syncytin-His融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白主要以包涵体形式存在;ELISA法测定抗体效价为1:10 000;Western-Blot和免疫组织化学结果显示所制备的抗体能特异性识别syncytin蛋白。结论成功制备和鉴定了人syncytin多克隆抗体,多克隆抗体特异性强和效价高,为下一步研究Syncytin的生物学功能奠定了基础。