产β-香树脂醇酿酒酵母细胞构建及高密度发酵

该研究通过异源表达甘草来源β-香树脂醇合成酶(β-AS),成功在实验室前期保存的酿酒酵母底盘细胞中构β-香树脂醇的合成途径,实现了利用酿酒酵母生产β-香树脂醇,发酵质量浓度达5.97 mg·L~(-1)。通过进一步过表达酵母MVA途径的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(ERG19),甲羟戊酸激酶基因(ERG12),3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶基因(ERG13),磷酸甲羟戊酸激酶基因(ERG8)和异戊烯二磷酸酯异构酶基因(IDI1),促进酵母代谢流走向β-香树脂醇合成方向,最终成功获得Y2-C2-4工程菌株,将β-香树脂醇浓度提高一倍,达到10.3 mg·L~(-1)。通过高密度发酵策略,该菌株其β-香树脂醇的产量可达到157.4 mg·L~(-1),相对于原始菌株提高了26倍,为公开报道基因工程酵母合成β-香树脂醇的较高产量。该研究不仅为β-香树脂醇生物合成奠定了基础,也为后期研究细胞色素氧化酶及糖基转移酶的挖掘提供优势底盘菌株。     

葫芦二烯醇的异源高效合成研究

葫芦二烯醇具有抑制炎症和抗癌活性,同时为罗汉果甜苷和葫芦素等重要中药有效成分生物合成途径中的基本前体。为获得高效生产葫芦二烯醇的酿酒酵母细胞工厂,该研究首先从罗汉果中克隆到葫芦二烯醇合酶(CBS)基因,通过在三萜化合物底盘菌WD-2091中异源表达和发酵后,产物经过GC-MS鉴定获得产量为27.44 mg·L~(-1)工程菌。再进一步调控工程菌中葫芦二烯醇合酶基因表达,最终成功获得葫芦二烯醇提高202.07%,产量为82.89 mg·L~(-1),高密度发酵达到1 724.10 mg·L~(-1)的酿酒酵母细胞工厂313-SL-CB。该研究为推动葫芦烷型四环三萜生物合成途径解析及高效细胞工厂创建提供了基础。     

千里光橙花叔醇合酶SsNES的功能鉴定北大核心CSCD

通过对千里光转录组数据筛选得到一个较短的萜类合酶基因。对其进行系统进化树和序列比对分析,初步确定为一个橙花叔醇合酶,命名为SsNES (GenBank登录号MH518312)。通过蛋白同源建模表明SsNES虽然序列较短,但具有完整的保守功能域,并且能正确折叠。通过对该基因的克隆,原核表达载体的构建,成功在大肠杆菌中表达出可溶性蛋白;用大肠杆菌代谢工程鉴定SsNES的体外催化功能,结果表明SsNES可以催化反式法尼烯焦磷酸(FPP)生成反式橙花叔醇。在千里光茎叶的提取物中也检测到反式橙花叔醇,表明该基因作为橙花叔醇合酶在千里光中行使功能;通过RT-PCR表达模式的分析,SsNES在茎中表达最高,其次是花、叶,在根中不表达;在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、丙甲菌素(Ala)的处理后该基因均能在6 h时就被诱导表达,表明该基因可能参与到千里光应对胁迫响应的防御过程中。SsNES生化功能的鉴定不仅为倍半萜合酶的研究提供多样性,也解析了千里光中橙花叔醇的生物合成,为千里光萜类化合物介导的病虫害防御提供理论基础。     

酿酒酵母细胞中β-香树脂醇代谢流调控的研究

该研究通过使用CRISPR/CAS9基因编辑技术,成功在实验室前期保存的产β-香树脂醇酿酒酵母细胞中敲除编码胞质苹果酸合成酶(citrate synthase,CIT2)和过氧化物酶体柠檬酸合酶(malate synthase,MLS1)的CIT2和MLS1基因,并将编码磷酸葡糖异构酶(phosphoglucose isomerase,PGI1)的PGI1基因启动子替换成编码酵母线粒体蛋白细胞色素c氧化酶亚基Ⅶa(cytochrome c oxidase subunitⅦa)的核基因Cox9的启动子,从而弱化PGI1基因的表达,调节乙酰辅酶A和胞内NADPH供给,进而调控β-香树脂醇的产量。发酵实验结果表明,删除CIT2基因对β-香树脂醇的产量没有影响;删除MLS1基因后,β-香树脂醇的产量是对照菌株的1.85倍,达到了3.3 mg·L~(-1)。弱化PGI1基因表达后,β-香树脂醇的产量是对照菌株的3.75倍,达6.7 mg·L~(-1)。该研究通过使用CRISPR/CAS9基因敲除技术成功的敲除CIT2和MLS1基因并弱化PGI1基因,提高了β-香树脂醇的产量,也为后期研究β-香树脂醇的酵母异源合成提供一定的借鉴意义。     

千里光橙花叔醇合酶SsNES的功能鉴定

通过对千里光转录组数据筛选得到一个较短的萜类合酶基因。对其进行系统进化树和序列比对分析,初步确定为一个橙花叔醇合酶,命名为SsNES (GenBank登录号MH518312)。通过蛋白同源建模表明SsNES虽然序列较短,但具有完整的保守功能域,并且能正确折叠。通过对该基因的克隆,原核表达载体的构建,成功在大肠杆菌中表达出可溶性蛋白;用大肠杆菌代谢工程鉴定SsNES的体外催化功能,结果表明SsNES可以催化反式法尼烯焦磷酸(FPP)生成反式橙花叔醇。在千里光茎叶的提取物中也检测到反式橙花叔醇,表明该基因作为橙花叔醇合酶在千里光中行使功能;通过RT-PCR表达模式的分析,SsNES在茎中表达最高,其次是花、叶,在根中不表达;在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、丙甲菌素(Ala)的处理后该基因均能在6 h时就被诱导表达,表明该基因可能参与到千里光应对胁迫响应的防御过程中。SsNES生化功能的鉴定不仅为倍半萜合酶的研究提供多样性,也解析了千里光中橙花叔醇的生物合成,为千里光萜类化合物介导的病虫害防御提供理论基础。     

构建酿酒酵母细胞工厂生产番茄红素

为构建高效生产番茄红素的酿酒酵母细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母中引入番茄红素生物合成途径基因Crt B和Crt I,获得能生产0.17 mg·L-1番茄红素的初始工程菌ZD-L-000。在此基础上,在工程菌ZD-L-000中分别过表达MVA途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因t HMG1、萜类合成调控的转录因子编码基因upc2.1、二萜生物合成的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶与法呢基焦磷酸合酶编码基因BTS1-ERG20,以及来自嗜酸热硫化叶菌的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因Sa GGPS,考察这些基因过表达对番茄红素合成的影响,结果发现过表达upc2.1基因未能提高番茄红素的产量,但过表达t HMG1、BTS1-EGR20和Sa GGPS基因均能显著提高番茄红素的产量,分别为初始菌株的2.0,16.9和20.5倍。在进一步研究中,t HMG1、BTS1-EGR20和Sa GGPS等有效基因被一同整合入工程菌ZD-L-000,获得的高产菌株ZD-L-201中番茄红素的产量提高77.0倍,达到13.23 mg·L-1;在高密度-两相发酵体系中工程菌ZD-L-201的番茄红素产量能进一步提高到135.21 mg·L-1(提高10.2倍)。本研究获得的工程菌为微生物发酵法生产番茄红素提供了基础。     

动态调控酿酒酵母ERG20基因表达提高单萜化合物的生产北大核心CSCD

单萜类化合物被广泛应用于化妆品、食品、医药、农业等领域。随着合成生物学的发展,利用合成生物学技术创建"微生物细胞工厂"进行单萜类化合物生产被认为是一种非常有潜力的方式。然而,在酿酒酵母中牻牛儿基焦磷酸(GPP)和法尼基焦磷酸(FPP)是由一种双功能酶法尼基焦磷酸合成酶(ERG20基因编码)连续催化产生,而且ERG20更加倾向于合成酵母生长必需的FPP,因此合理控制FPP合成是在酵母细胞工厂中实现单萜高效合成的基础。为了实现酿酒酵母工程菌中生物合成GPP到FPP的动态节流,该研究应用基因编辑技术将底盘菌HP001的ERG20的启动子替换为环氧鲨烯环合酶(ERG1基因编码)启动子pERG1,获得新型单萜底盘菌HP001-pERG1-ERG20。进一步,分别利用以GPP和橙花基焦磷酸(NPP,cis-GPP)为底物的生物合成途径对底盘菌生产能力进行了验证,其中以GPP为前体的芳樟醇产量达到7.6 mg·L^(-1),提升了42.5%;以NPP为前体的橙花醇的产量达到8.3 mg·L^(-1),提升了1436.4%。该研究为微生物发酵法生产单萜化合物提供了基础。     

创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇

羽扇豆醇、桦木酸等羽扇豆型三萜化合物具有抗HIV、抗肿瘤等多种生物学活性,其中羽扇豆醇为这类化合物的基本前体。为了实现羽扇豆烷型三萜的异源发酵法生产,研究首先运用高通量同源重组法在酿酒酵母中进行萜类甲羟戊酸(MVA)途径的一步法调控,以提高三萜通用前体鲨烯的供给;在进一步工作中,拟南芥来源的羽扇豆醇合成酶基因(At LUP)被整入三萜底盘菌株中实现羽扇豆醇酵母人工细胞工厂的创建。结果表明该实验能一次完成MVA途径的7个基因的整合,组装总长度达到20kb,同时多倍化MVA途径能显著提高鲨烯产量约500倍,达到354.00 mg·L~(-1);At LUP基因在染色体上整合后获得的工程菌NK2-LUP在摇瓶中发酵能生产8.23 mg·L~(-1)羽扇豆醇。该研究可为在酵母中实施大规模生物合成途径组装提供技术支持,同时为进一步获高产羽扇豆烷型三萜的人工酵母细胞提供了重要基础。     

创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产广藿香醇

广藿香醇是存在于中药广藿香挥发油中的一种重要倍半萜类化合物，被认为是广藿香油药理功效和香味的主要贡献成分，具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学活性。目前，全球广藿香醇及其混合精油需求量大，传统植提法存在浪费土地，污染环境等诸多问题，因而亟需一种新的方法高效、低成本的生产广藿香醇。为了拓宽广藿香醇的生产方式，实现在酿酒酵母中异源生产广藿香醇，该研究首先将来源于广藿香Pogostemon cablin的广藿香醇合酶(PS)基因进行密码子优化后置于诱导型强启动子GAL1下，转入萜类底盘菌YTT-T5,成功获得可发酵生产(4.0±0.3)mg·L^-1广藿香醇的工程菌PS00。为了提高转化率，采用了蛋白质融合手段将丹参来源的SmFPS基因与PS基因进行融合，广藿香醇摇瓶产量提高25倍，达(100.9±7.4)mg·L^-1。在此基础上，进一步优化融合基因的拷贝数，广藿香醇的产量提升了90%,达到(191.1±32.7)mg·L^-1。最终通过发酵工艺优化，该菌在精确发酵体系中广藿香醇产量能达到2.1 g·L^-1,...     

樟树化学型形成关键萜类合酶的系统鉴定

樟树Cinnamomum camphora为我国重要的经济树种。根据叶片挥发油中主要成分的种类和含量,樟树通常被分为龙脑型、樟脑型、芳樟醇型、桉叶油型和橙花叔醇型5种化学型,萜类合酶(terpene synthase, TPS)是形成这些化合物的关键酶。虽然多个关键酶基因已得到鉴定,但最具经济价值的(+)-龙脑的生物合成途径未见报道。该研究通过对4种化学型叶片的转录组分析,克隆了9个萜类合酶基因CcTPS1～CcTPS9。经过大肠杆菌诱导表达重组蛋白后分别以香叶基焦磷酸(GPP)和法尼基焦磷酸(FPP)为底物进行酶促反应,结果CcTPS1和CcTPS9均可催化GPP生成冰片基焦磷酸,并在磷酸水解酶的作用下得到(+)-龙脑,产物占比分别为0.4%、89.3%。CcTPS3和CcTPS6均可催化GPP生成单一产物芳樟醇,CcTPS6还可与FPP反应生成橙花叔醇。CcTPS8与GPP反应生成1,8-桉叶油(30.71%)。9个萜类合酶共计产生9个单萜和6个倍半萜类化合物。该研究首次确定樟树中负责(+)-龙脑生物合成的关键酶基因,为进一步阐明化学型形成的分子机制及利用生物工程技术培育高产龙脑新...     

不同激素配比对远志愈伤诱导及其黄酮积累的影响

目的:研究不同激素配比对远志根、茎、叶愈伤组织诱导的影响,并对远志根、茎、叶愈伤组织中的黄酮量进行测定分析。方法:以MS为基本培养基,分别以远志无菌苗的根、茎、叶为外植体,应用正交试验法确定2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D),萘乙酸(NAA),6-苄氨基嘌呤(6-BA)这3种激素对远志根、茎、叶不同部位愈伤组织诱导及其黄酮积累量的影响。结果:2,4-D,NAA,6-BA对远志根、茎、叶愈伤诱导率均有显著影响。叶的最佳愈伤诱导组合为MS+3. 0 mg·L~(-1)2,4-D+1. 0 mg·L~(-1)NAA+1. 5 mg·L~(-1)6-BA;茎的最佳愈伤诱导组合为MS+1. 0 mg·L~(-1)2,4-D+3. 0 mg·L~(-1)NAA+1. 5 mg·L~(-1)6-BA;根的最佳愈伤诱导组合为MS+1. 0 mg·L~(-1)2,4-D+1. 0 mg·L~(-1)NAA+1. 0 mg·L~(-1)6-BA。2,4-D,NAA,6-BA对远志茎愈伤组织中黄酮积累均影响显著,以MS+3. 0 mg·L~(-1)2,4-D+1. 0 mg·L~(-1)NAA+0. 5 mg·L~(-1)6-BA为最佳黄酮积累组合; NAA,6-BA对远志叶愈伤组织中黄酮积累影响均显著,而2,4-D则无明显影响,以MS+3. 0 mg·L~(-1)2,4-D+2. 0 mg·L~(-1)NAA+1. 0 mg·L~(-1)6-BA为最佳黄酮积累组合; 3种激素分别对远志根愈伤组织中黄酮积累无明显影响,以MS+2. 0 mg·L~(-1)2,4-D+1. 0 mg·L~(-1)NAA+1. 5 mg·L~(-1)6-BA为最佳黄酮积累组合。结论:在该条件下远志根、茎、叶愈伤组织诱导率均达100%,其中尤以远志叶愈伤组织长势最好,其次分别是远志茎和远志根。在该条件下远志根、茎、叶愈伤组织中黄酮量分别达到21. 31,24. 56,23. 61 mg·g-1。     

藤梨根对RKO结肠癌细胞失巢凋亡的作用

目的:观察藤梨根对人结肠癌RKO细胞悬浮生长及失巢凋亡作用.方法:200～800 mg·L-1藤梨根作用于RKO细胞,CCK-8(CCK-8)法检测藤梨根对RKO细胞悬浮生长作用,双嵌入剂乙锭均二聚物(EthD-1)染色检测失巢凋亡,比色法检测半胱天冬酶-3(caspase-3)活性,2-7-二氯氢化荧光素乙二脂染色法结合荧光酶标仪检测细胞内活性氧的产生.结果:200 ～800 mg·L-1藤梨根可显著抑制RKO悬浮生长,呈剂量依赖性(P＜0.01).200 ～800 mg·L-1藤梨根作用后悬浮生长RKO细胞吸收EthD-1散发红色荧光,部分细胞可见核碎裂,呈现凋亡形态改变;藤梨根组EthD-1荧光吸光度与对照组比较差异显著(P＜0.01).终质量浓度200 ～800 mg·L-1藤梨根可显著增强RKO细胞caspase-3活性以及细胞内活性氧的产生(P＜0.01).结论:藤梨根可抑制RKO细胞悬浮生长,促使RKO细胞发生失巢凋亡,可能与活化caspase-3以及升高细胞内活性氧水平相关.     

不同基质条件下西洋参皂苷提取物的自毒作用

人参皂苷是西洋参Panax quinquefolium中所含的主要次生代谢产物,西洋参生长过程中,植株内的人参皂苷可以通过根系分泌及腐解进入到土壤环境中.研究利用高效液相色谱法(HPLC)测定了土壤中人参皂苷含量,根据西洋参田间的实测数据设计皂苷提取物的系列浓度(0.2 ～125 mg· L-1溶液或0.2 ～ 125 mg·kg-1土壤),通过在溶液及土壤基质中的添加实验,观察环境中的皂苷提取物对西洋参种胚和成株苗生长的作用.结果表明,在北京市怀柔区三至四年生西洋参根际土中,检测到人参皂苷Rb1,Rb2,Rd,总量为0.80 ～ 3.19 mg·kg-,按照田间持水量为20％计算,总皂苷在土壤溶液中的质量浓度为4～ 16 mg·L-1.在溶液基质中,0.2～125 mg·L-1西洋参皂苷提取物对西洋参种胚胚根的抑制作用在6％ ～23％,在125mg·L-1时达到显著水平(P＜0.05);对西洋参胚芽无显著抑制作用.营养液中添加25 mg·L-1皂苷提取物,培养20 d时,三年生西洋参成株苗株高下降28％,地上部的生物量下降50％(P＜0.05);对新生须根生长的抑制作用不显著.在土壤基质中,添加同样浓度的皂苷提取物在灭菌和未灭菌土中对西洋参胚根、胚芽生长均无显著影响.由此推论,西洋参的皂苷成分对自身胚根和成株苗生长有自毒作用,但在田间土壤条件下,这种作用有所下降.     

款冬叶柄愈伤组织培养与再生体系建立

以款冬幼嫩叶柄为材料,研究植物生长调节剂对其离休培养与植株再生的影响,建立了款冬离体快繁技术体系。结果表明:款冬叶柄切段较理想的灭菌方法为75%乙醇浸泡30 s,转入饱和漂白粉上清液浸泡15 min;适合愈伤诱导的培养基为MS+6-BA 3.0 mg·L~(-1)+2,4-D 2.0 mg·L~(-1),诱导率96.2%;在培养基MS+ZT 2.0 mg·L~(-1)+NAA 0.3 mg·L~(-1)上芽苗分化效果较好,分化率91%,平均芽数8.26个;较佳的不定芽增殖培养基为MS+KT 1.0 mg·L~(-1)+IBA 0.3 mg·L~(-1),增殖倍数为11.81,平均苗高4.9 cm;生根培养基为1/2MS+IBA 0.2 mg·L~(-1),生根数平均为5.68条,生根率为95.22%以上;瓶苗移栽于河沙-有机肥3∶1的基质中生长良好,成活率达90%以上;大田试验表明:同等栽培条件下款冬组培株、栽培株和野生株在生长量与花粒产量等方面存在显著差异,以组培株生长量与花粒产量相对较高。组培品与野生品有效成分含量基本一致。     

新疆阿魏树脂不同分离部位对结肠癌细胞HCT116的抑制作用

目的: 分析新疆阿魏树脂不同分离部位对结肠癌细胞HCT116抑制作用的活性,并确定其有效活性部位。 方法: 通过磺酰罗丹明B比色法（SRB）与流式细胞术以细胞密度1×10⁵个mL,药物质量浓度250,125,62.5,31.25,15.6 mg·L^-1（流式细胞术药物浓度为62.5 mg·L^-1）,检测新疆阿魏树脂不同分离部位（石油醚部位、乙酸乙酯部位,甲醇部位）对结肠癌细胞 HCT116药物作用24 h后的增殖抑制与凋亡作用,以IC₅₀和总凋亡率作为指标衡量其各分离部位抑制肿瘤的活性效能。 结果: 石油醚部位:对结肠癌细胞HCT116增殖抑制IC₅₀ 68.7 mg·L^-1,总凋亡率为（43.4±1.1）%;乙酸乙酯部位:IC₅₀43.7 mg·L^-1, 总凋亡率为（56.2±0.9）%;甲醇部位:IC₅₀59.6 mg·L^-1,总凋亡率为（46.7±3.1）%。 结论: 新疆阿魏树脂乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位对结肠癌细胞HCT116细胞毒性作用较强并能促进其大量凋亡,初步确定为新疆阿魏树脂抗肿瘤活性部位。     

胶束电动毛细管电泳法快速分离测定南、北五味子中木脂素类成分

目的：建立胶束电动毛细管电泳法测定五味子中6种木脂素类成分的方法。方法：探讨了缓冲溶液、添加剂、分离电压、温度和进样条件等因素对分离检测的影响。在10 mmol·L^-1 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液（35%乙腈,37.5 mmol·L^-1 SDS,pH 8.0）、分离电压为28.0 kV的优化条件下,9 min内可实现五味子样品溶液的分析。结果：线性范围分别为25.5~1 020,25.75~1 030,12.0~480,25.5~1 020,24.25~970,19.75~790 mg·L^-1;检出限为0.5,0.8,1.0,1.0,1.0,1.5 mg·L^-1。结论：该方法与高效液相色谱法比较,在分离效果、柱效和分析速度方面具有明显优势。     

芦荟中1个具有抗菌活性的多取代基萘类新化合物

对库拉索芦荟的化学成分进行研究。运用硅胶、凝胶、MCI-gel树脂及RP-HPLC等多种色谱技术从库拉索芦荟70%乙醇提取物中分离鉴定了1个多取代基萘类化合物,该化合物鉴定为3-羟基-1-(1,7-二羟基-3,6-二甲氧基萘-2-基)-1-丙酮(1)。生物活性测试表明,其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株的MIC90为(48±4)mg·L~(-1),小于左氧氟沙星的MIC90(58±5)mg·L~(-1),具有突出的抗菌活性。     

白头翁汤正丁醇提取物对碱性pH条件下白念珠菌VVC临床株形态转化的影响

目的:探讨白头翁汤正丁醇提取物(butyl alcohol extract of Baitouweng decoction,BAEB)在碱性条件下对白念珠菌VVC(vulvovaginal candidiasis)临床分离株酵母-菌丝形态转化的影响。方法:采用肉汤稀释法测定白头翁汤不同溶剂萃取物对VVC临床株的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);倒置显微镜观察不同p H环境下VVC临床株形态;采用XTT还原法评价在p H 8.0时菌丝活性;扫描电镜观察白念珠菌菌丝形态;荧光显微镜观察菌体代谢活力;固体培养基上观测菌落形态;半固体培养基上观察菌丝侵袭能力;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测菌丝特异性基因ALS3,CSH1,SUN41,HWP1和Ca PDE2的表达量。结果:白头翁汤正丁醇提取物(BAEB)对VVC临床株的MIC为64~128 mg·L-1,低于总提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的MIC;p H 8.0时VVC临床株的菌丝形成能力最强;扫描电镜结果显示512,1 024 mg·L-1的BAEB明显抑制VVC临床株的形态转化,荧光显微镜结果显示1 024 mg·L-1的BAEB可以降低VVC临床株的代谢活性;512,1 024 mg·L-1BAEB浓度的固体菌落未出现褶皱,1 024 mg·L-1BAEB浓度的半固体培养基内部未见菌丝侵袭;qRT-PCR检测显示1 024 mg·L-1时,ALS3,CSH1,SUN41,HWP1分别下调4.26,3.2,2.74,5.12倍,Ca PDE2上调2.38倍。结论:BAEB在碱性p H条件下对白念珠菌VVC临床株的形态转化具有抑制作用。