胎儿LAK／IL—2治疗长期HBV无症状携带者的临床研究

应用儿脾ＬＡＫ细胞，配合ｒＩＬ－２和ｒＩＦＮ－γ治疗８例长期ＨＢＶ无症状携带者，结果表明：有７５％（６／８）的患者ＨＢｅＡｇ转阴，其中有２５％（２／８）的患者ＨＢｅＡｇ和ＨＢｓＡｇ均转阴，治疗后ＣＤ＾＋８Ｔ细胞稍有增高，Ｔａｃ抗原比治疗前和对照组均显著增高，血ｓＩＬ－２Ｒ，ＩＬ－８和ＮＴＦ－α治疗后均显著增高。     

LAK细胞治疗慢性活动型乙型肝炎的疗效与机理研究

目的观察淋巴因子激活杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）治疗慢性活动型乙型肝炎（ＣＡＨ）的疗效，探讨治疗机理。方法ＬＡＫ细胞治疗４０例患者，治疗前、疗程结束时，分别检测ＨＢＶＭ，ＡＬＴ，Ｔ细胞亚群，Ｂ细胞，ＩＬ－２，ｍＩＬ－２Ｒ，ＮＫ及ＬＡＫ细胞活性。疗程结束１ａ复查ＨＢＶＭ。对照组４０例。结果ＬＡＫ治疗组疗程结束时，ＨＢｅＡｇ和ＨＢＶＤＮＡ转阴率分别为２２．５％和４０．０％，与对照组相比差异显著（Ｐ均＜０．００１）。疗程结束１ａ复查ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶＤＮＡ转阴率分别达４０．０％和６８．６％。治疗后患者ＣＤ＋４细胞数及ＣＤ＋４／ＣＤ＋８比值，ＩＬ－２水平及ｍＩＬ－２Ｒ表达，ＮＫ细胞及ＬＡＫ细胞活性均较治疗前明显升高（Ｐ均＜０．０１）。尤以ＨＢｅＡｇ转阴者，ＩＬ－２升高更显著（Ｐ均＜０．００５）。结论ＬＡＫ细胞疗法有增强免疫功能、调节免疫紊乱和清除乙肝病毒的效用，但主要不是ＬＡＫ细胞的溶细胞作用。     

人白细胞介素2基因转移表达及抗乙型肝炎病毒和诱导LAK细胞活性的研究

为了探讨白细胞介素（ＩＬ）－２转基因表达抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用，应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳｖ（Ｘ）－包装细胞系ＰＡ３１７基因转移系统，研究了人ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移和表达，以及抗ＨＢＶ和诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）的作用。所构建的人ＩＬ－２重组表达载体ｐＺＩＰｈｕＩＬ－２，以ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀技术转染ＰＡ３１７细胞，筛选到Ｇ４１８抗性克隆，分泌假病毒颗粒达１０６ＣＦＵ／ｍｌ。以假病毒颗粒感染２．２．１５细胞系及正常人外周血单个核细胞，分泌ＩＬ－２水平可达６ＩＵ／ｍｌ，明显抑制２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ的分泌表达，与１００ＩＵ／ｍｌ重组的ＩＬ－２一样可诱导出相似的ＬＡＫ细胞活性。而不含ＩＬ－２ｃＤＮＡ的ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）的假病毒颗粒则无此作用。提示逆转录病毒载体。包装细胞系可以成功地实现人ＩＬ－２ｃＤＮＡ的转移和低水平的分泌和表达，并可明显抑制２．２．１５细胞分泌ＨＢｓＡｇ及诱导ＬＡＫ细胞活性。     

柯萨奇B组病毒感染患儿细胞免疫状态及对干扰素疗效的影响

系统探讨柯萨奇病毒Ｂ感染血症的机体免疫特征及干扰素应用的评价。采用ＥＬＩＳＡ法测定ＣＶＢ－Ａｇ和ＣＶＢ－ＩｇＭ，采用单克隆抗体标记的间接ＡＢＣ免疫组化法测定Ｔ细胞亚群；＾３Ｈ－ＴｄＲ标记法测定，ＮＫ细胞和ＬＡＫ细胞活性。结果：１．ＣＶＢ感染机体ＮＫ细胞活性。ＬＡＫ细胞活性和ＣＤ４／ＣＤ８比值明显低于对照组；２．机体ＮＫ和ＬＡＫ细胞活性轻中度降低，ＣＶＢ－Ａｇ可自然清除或应用α干扰素清除．若ＮＫ和Ｌ     

重组白细胞介素－2治疗慢性肝炎22例观察

应用重组白细胞介素－２（ｒＩＬ－２）治疗慢性活动性肝炎（ＣＡＨ），对治疗前后外周血淋巴细胞亚群、乙肝病毒５项标志进行了检测，结果治疗后ＣＤ４＋Ｔ细胞明显增加，ＣＤ８＋Ｔ细胞明显降低（Ｐ＜０．０１），ＣＤ４＋／ＣＤ８＋倒置情况有明显改善。有２例ＣＡＨ血ＨＢｅＡｇ转阴，但未见抗－ＨＢｓ阳转。本文还就ｒＩＬ－２对ＣＡＨ肝功能的影响进行了讨论。     

LAK细胞对人肝癌细胞及乙型肝炎病毒的杀伤活性

由健康人外周血制备的ＬＡＫ细胞加ｒＩＬ－２体外培养时间分别为４天和７天，其对人肝癌细胞的杀伤活性分别是５８．７％及４３．２％；其对人肝癌细胞所分泌的ＨＢＶ表面抗原和ｅ抗原也有一定的杀灭活性；结果揭示，ＬＡＫ细胞对与肝炎病毒密切相关的肝癌治疗有着潜在的临床意义。     

Th1／Th2细胞在慢性乙型肝炎病毒感染中的作用

目的 了解慢性ＨＢＶ感染者外周血单核细胞（ＰＭＢＣ）中ＣＤ４＾＋Ｔ细胞内ＩＬ－４和ＩＦＮ－γ的表达情况,以测定Ｔｈ０／ＴＨ１／Ｔｈ２细胞的百分数,探明Ｔｈ、、Ｔｈ２细胞在慢性ＨＢＶ感染中的作用。方法 常规分离ＰＢＭＣ,在ＰＭＡ,ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、莫能菌素的刺激下,采用工细胞检测（ＦＡＣＳ）对慢性ＨＢＶ感染者ＰＢＭＣ中ＣＤ４＾＋Ｔ细胞内ＩＬ－４和ＩＦＮ－γ表达进行分析。结果 正常对照组,２．３％～     

Th1/Th2细胞在慢性乙型肝炎病毒感染中的作用

目的了解慢性ＨＢＶ感染者外周血单核细胞（ＰＤＭＣ）中ＣＤ４~＋Ｔ细胞内ＩＬ－４和ＩＦＮ－γ的表达情况,以测定Ｔｈ０／Ｔｈ１／Ｔｈ２细胞的百分数,探明Ｔｈ１、Ｔｈ２细胞在慢性ＨＢＶ感染中的作用。方法常规分离ＰＢＭＣ,在ＰＭＡ、ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、莫能菌素的刺激下,采用流式细胞检测（ＦＡＣＳ）对慢性ＨＢＶ感染者ＰＢＭＣ中ＣＤ４~＋Ｔ细胞内ＩＬ－４和ＩＦＮ－γ表达进行分析。结果正常对照组,２．３％－１８.６％的ＣＤ４~＋Ｔ细胞为Ｔｈ１细胞,０.９％－９．２％为Ｔｈ２细胞;在慢性ＨＢＶ感染者外周血单个ＣＤ４~＋Ｔ细胞中,以Ｔｈ０细胞居多：而Ｔｈ１细胞则随着慢性乙型肝炎肝脏炎症活动的加剧而明显增多,在炎症活动明显的慢性乙型肝炎患者中,Ｔｈ１细胞百分数明显高于炎症活动呈静止状态的慢性乙型肝炎;Ｔｈ２细胞在慢性ＨＢＶ感染的不同阶段则较为恒定,但明显高于对照组。结论Ｔｈ１细胞与炎症活动呈正相关,Ｔｈ２细胞可能与ＨＢＶ感染的慢性化相关联。     

反义基因转移表达及抗乙型肝炎病毒的作用

目的观察重组逆转录病毒载体－包装细胞系统介导反义基因转移表达和抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法将ＨＢＶａｙｗ１４０２－２９０６片段和２８３９－１９８６片段反向插入重组逆转录病毒载体质粒，分别转染ＰＡ３１７包装细胞，分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和２．２．１５细胞。结果转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。ＨＢＶ反义基因重组逆转录病毒感染２．２．１５细胞后第３天，表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）表达量减少，感染后第５天，ＨＢＶ抗原表达抑制率达高峰。ｐｒｅＳ／Ｓ片段反义基因转移后，ＨＢｓＡｇ表达抑制率为７１％，ＨＢｅＡｇ抑制率为２３％；ｐｒｅＣ／Ｃ片段反义基因转移后，ＨＢ－ｓＡｇ表达抑制率为２３％，ＨＢｅＡｇ抑制率为５９％。结论逆转录病毒载体－包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞内转移和表达，并对ＨＢＶ复制和表达均有抑制作用。     

乙型和丙型肝炎重叠感染患者肝组织免疫组织化学双标记研究

探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）重叠感染患者肝组织中病毒的复制状况和相互关系。方法采用免疫组织化学双标记技术，以抗－ＨＣＶＮＳ３、抗－ＨＣＶＮＳ５单克隆抗体和抗－ＨＢｓ、抗－ＨＢｃ多克隆抗体，检测２５例尸检肝组织中ＨＣＶＡｇ和ＨＢＶＡｇ的分布和表达。结果ＨＢ－ｓＡｇ和ＨＣＶＮＳ３Ａｇ同时阳性１１例，ＨＢｓＡｇ和ＮＳ５Ａｇ阳性１２例，ＨＢｃＡｇ和ＨＣＶＮＳ３Ａｇ及ＨＣＶＮＳ５Ａｇ阳性各１０例。几乎所有单标记染色阳性切片，其双标记染色也阳性。感染ＨＣＶ或ＨＢＶ的肝细胞各呈灶性、散在或弥散混杂分布，在重叠感染肝组织中，与ＨＢＶ复制有关的表达类型，如ＨＢｓＡｇ膜、浆型和ＨＢｃＡｇ浆型以及ＨＣＶＮＳ３Ａｇ和ＨＣＶＮＳ５Ａｇ的检出例数，同单纯感染组相比差异无显著意义（χ２＝０．１５４及０．１９８，Ｐ＞０．０５）。结论乙型和丙型肝炎病毒在重叠感染时，两种病毒在肝组织内可能不存在互相干扰和抑制。     

重组白细胞介素-2对急性白血病及MDS患者NK活性异常的逆转作用

用标准的~(51)Cr 释放法观察了12例急性白血病及白血病前期(MDS)患者的外周单个核细胞(PBMNCs)经重组白细胞介素-2(rIL-2)诱导3～4周后 NK活性及 LAK 活性的变化。结果诱导前 NK 活性(5.3±4.5%)较健康人(56.2±9.9%)明显减低(P<0.01)。rIL-2(1000u//ml)诱导3～4周后 NK 活性(46.9±8.6%)较培养前显著提高(P<0.01)。LAK 活性由0.80±0.83%升高到49.4±9.6%。同时在培养过程中也观察到淋巴细胞逐渐增多,而白血病幼稚细胞逐渐减少。这提示 rIL-2在体外能够逆转急性白血病及 MDS 患者 NK 杀伤功能缺陷,其 LAK 活性的诱导过程也是对白血病细胞的清除过程。     

淋巴因子对人PBMNC的LAK细胞形成、增殖和细胞毒作用的影响

应用乳酸脱氢酶释放法对重组白介素２，粗制天然白介素２，重组肿瘤坏死因子和天然免疫活性肽等淋巴因子诱导人ＰＢＭＮＣ为ＬＡＫ细胞以及ＬＡＫ细胞对靶细胞（人外周血淋巴细胞，人食管癌１０９细胞株和人红白血病细胞株＿（５６２）的细胞毒作用分别于培养的第４ｄ和第７ｄ进行了检测。结果显示：①四个配伍组和一个重组白介素２组的多克隆ＬＡＫ细胞攻击溶解１０９细胞株和Ｋ＿（５６２）细胞株的水平波动子２８％和６６％之间，中位数为４７％，而对正常人外周血淋巴细胞均无细胞毒作用；②重组白介素２和粗制天然白介素２配伍培养ＬＡＫ细胞的增殖协力约高于重组白介素２和重组肿瘤坏死因子组，以及重组白介素２和免疫活性肽组增殖协力的３倍，③在诱导ＬＡＫ细胞的过程中其增殖量和其细胞毒活性可以不同步。建议临床上治疗晚期肿瘤病人除用ＬＡＫ细胞和重组白介素２外，首先选用天然白介素２。     

重组白细胞介素2对乙型肝炎患者自然杀伤活性的调节

应用~(125)I释放法同时观察了38例乙型病毒性肝炎病人及22例正常人外周血单个核细胞经重组白细胞介素2作用前后自然杀伤细胞活性,并对其活性改变及调节机制进行探讨。发现慢性活动性肝炎和重症肝炎病人血清中存在某种抑制因子,该抑制因子能抑制白细胞介素2活性或阻断其作用的发挥。     

rIL-2对慢性HBV感染者淋巴细胞转化功能的影响

本文采用~3H-TdR渗入技术,观察到慢性HBV感染者休外淋巴细胞转化功能受到明显的损害。HBsAgrHBeAg和rHBeAg可明显抑制正常人淋巴细胞转化,且有剂量依赖性。上述情况在加入外源性重组白细胞介素Ⅱ(rIL-2)后仍不能得到纠正。实验提示,慢性HBV感染者淋巴细胞转化功能低下的原因除了IL-2生成减少外,还有HBV或其产物对它的直接抑制或通过某种机制间接干扰。     

Ge—132对荷瘤小鼠NK细胞活性及红细胞免疫功能的影响

为了探讨Ｇｅ－１３２抗癌作用机制，本文进行了Ｇｅ－１３２对荷瘤小鼠脾脏ＮＫ细胞活性和红细胞免疫粘附功能影响的体内实验研究。实验采用Ｃ５７ＢＬ／６荷瘤小鼠，腹腔注射Ｇｅ－１３２（剂量分别为１００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ），每日１次，连续１４天后，取小鼠脾细胞和血液进行ＮＫ细胞活性及红细胞免疫粘附功能测定，并摘除瘤块称重，计算抑瘤率。结果表明，Ｇｅ－１３２对小鼠抑植瘤（Ｓ１８０）的生长具有显著的抑制效应，抑瘤率达５５％；荷瘤小鼠脾细胞ＮＫ活性明显低于正常对照组，Ｇｅ－１３２能使其得以恢复；荷瘤小鼠ＲＢＣ－Ｃ３ｂ受体花环率和肿瘤ＲＢＣ花环率明显低于正常对照组（Ｐ＜００１），ＲＢＣ－ＩＣ花环率则高于正常对照组（Ｐ＜００１），注射Ｇｅ－１３２可显著提高ＲＢＣ－Ｃ３ｂ受体花环率和肿瘤ＲＢＣ花环率，降低ＲＢＣ－ＩＣ花环率。表明Ｇｅ－１３２能增强荷瘤小鼠ＮＫ细胞杀伤活性和红细胞免疫粘附功能。     

PHA胸导管来源诱生的LAK细胞的作用

利用胸导管引流治疗哮喘病的机会,研究了PHA在rIL-2诱导胸导管淋巴细胞成为LAK细胞中的作用。结果表明:PHA和rIL-2共同诱导TDL2周,细胞数量扩增约34倍。同时明显促进了DL的~3H-TdR和~3H-Leucine的参入,较对照组有明显差异(P<0.01)。其中rIL-2 100～1000U/ml和PHA组作用最佳,但PHA和rIL-2的协同作用持续时间短,第6d即开始下降,而且PHA参与诱导的TDL-LAK细胞的杀伤活性有所下降。     

HBVPreS2反义寡核苷酸对HepG 2.2.15细胞系HLA-I类抗原表达及生物活性的影响

目的 :观察针对乙型肝炎病毒 (HBV)PreS2 基因特异性反义寡核苷酸 (asON)对转基因细胞HepG2 .2 .15表面的人类白细胞I类抗原 (HLA I)基因表达的影响。方法 :设计合成互补于HBVPreS2 翻译起始区的反义寡核苷酸即序列I ,并设非互补序列作对照即序列II ,免疫细胞化学染色观察asON对HepG2 .2 .15表面表达的HLA I类抗原的影响 ,用ELISA法动态检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg的变化 ,放射免疫测定法检测asON对宿主细胞自身分泌蛋白 血清铁蛋白的影响。结果 :HepG2 .2 .15细胞表面HLA I类抗原表达降低 ,用药组和对照组相比有统计学意义 (P <0 .0 5 )。asON能够抑制HBV表达HBsAg和HBeAg ,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为 6 6 %和 91% ,而序列II对HBsAg和HBeAg的抑制率均为 11%。asON对宿主细胞自身分泌蛋白无影响 ,即对宿主细胞无毒性作用。结论 :asON以序列特异性方式抑制HBV基因表达而对宿主细胞无毒性作用 ,HLA I类抗原表达降低 ,这对减轻过度炎症反应 ,阻止慢性肝炎至重症肝炎的发生具有重要意义     

食管鳞癌上皮细胞间质转化对NK细胞活化及其生物学作用的研究

目的 探讨食管鳞癌上皮细胞间质化（EMT）对自然杀伤（NK）细胞生物学活性的影响。方法 通过Western blot检测EMT化相关蛋白E-cadherin和Vimentin表达,从6株细胞系中筛选出 EMT化和非EMT化食管鳞癌细胞株;收集10例正常人外周血,负性分选NK细胞;根据共培养不同的条件培养基分为RPMI 1640正常培养基刺激-NK组（NC组）、EC9706细胞上清液刺激-NK组（EC9706组）与KYSE150细胞上清液刺激-NK组（KYSE150组）,将不同的条件培养基加入NK细胞共培养72 h,流式细胞术检测NK细胞表面/胞内分子的表达。10 ng/mL 转化生长因子-β（TGF-β）处理KYSE150细胞株7 d诱导EMT化后,收集KYSE150 EMT和KYSE150上清液,分别与NK细胞共培养,72 h后以流式细胞术检测NK细胞表面/胞内分子的表达、CD107a脱颗粒能力、靶细胞K562杀伤效应、NK细胞增殖及凋亡。结果 6株细胞系中筛选出2株EMT化和4株非EMT化的食管鳞癌细胞株,从中各选出一株（EC9706和KYSE150）用于后续实验;NK细胞负性筛选达到90%以上的纯度,T细胞<1%。不同的食管鳞癌细胞上清液刺激后,3组NK细胞表面活化型、抑制型受体,效应分子结果显示:与NC组和KYSE150组比较,EC9706组活化型受体NKP30、NKG2D、NKP44表达,颗粒酶释放均降低（ P<0.05）;抑制型受体NKG2A和CD158b表达增加（ P<0.05）;NKP46、CD226、CD16表达和穿孔素释放在3组间差异无统计学意义。与KYSE150上清刺激比较,KYSE150 EMT上清刺激后,NK细胞活化型受体NKP30、NKG2D、NKP44表达,穿孔素释放均降低;CD107a脱颗粒作用、靶细胞K562杀伤效应均减弱,NK细胞Ki67增殖指数下降（ P<0.05）;抑制型受体NKG2A和CD158b表达增加（ P<0.05）;NKP46、CD226、CD16表达,颗粒酶释放及NK细胞凋亡在两组间差异无统计学意义。结论 食管鳞癌细胞EMT化可能通过抑制NK细胞活化、减少NK细胞杀伤效应分子的分泌来降低NK细胞杀伤效应,从机体免疫监视中逃逸。     

妊娠中期注射HBV免疫球蛋白对其宫内阻断作用

目的探讨妊娠中期开始注射乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)对HBsAg和HBeAg双阳性孕妇乙型肝炎病毒(HBV)的宫内阻断作用。方法将病人随机分为2组,治疗组32例,孕16周起肌注HBIG,每4周1次至分娩;对照组31例未予用药。结果治疗组孕妇HBV DNA水平比对照组显著下降(t=24.202,P<0.05),其新生儿宫内感染率明显低于对照组(χ2=5.671,P<0.05)。两组孕妇及其新生儿未发现有不良反应。结论HBsAg和HBeAg双阳性孕妇孕中期多次注射HBIG可有效减少HBV宫内感染发生率。     

自然杀伤细胞分泌干扰素γ促进乙肝病毒的清除

目的 探讨自然杀伤细胞(NK)在乙型肝炎病毒(HBV)清除过程中的作用机制.方法 通过对成年小鼠高压注射20μg pGEM4Z/HBV1.2质粒建立HBV急性排斥小鼠模型,采用放射免疫试剂盒定量检测不同时间点(1、2、3、4、5周)小鼠血清中HBsAg、免疫组化检测肝脏组织中HB-cAg来评估模型的建立.流式细胞术分析对照小鼠和HBV小鼠肝脏中NK细胞比例和绝对数量变化,进一步分析两种小鼠NK细胞活化情况和分泌干扰素(IFN)-γ的能力变化.通过肝脏组织切片HE染色以及谷丙转氨酶检测判断小鼠肝脏损伤状况.最后,通过PK136抗体清除小鼠NK细胞以及IFN-γ中和抗体进一步证实NK细胞分泌的IFN-γ是否参与HBV的清除过程.结果 小鼠高压注射20μg pGEM4Z/HBV1.2质粒后,第1周血清中HBsAg和肝脏组织中HBcAg表达量都较高,但呈降低趋势,在4~5周后几乎转阴,很好地模拟了临床上急性感染HBV的病例.与对照组相比,HBV小鼠肝脏中NK细胞比例和绝对数量明显增高;进一步研究显示HBV小鼠NK细胞活化分子CD69表达也显著上升,同时IFN-γ分泌增加.与此同时,小鼠肝脏呈无损伤状态.预先清除NK细胞或阻断IFN-γ 的功能能显著增加HBV小鼠中相关抗原的含量,延缓HBV的排斥.结论 在HBV急性排斥模型中,NK细胞通过分泌IFN-γ促进HBV的清除.