呼吸链酶复合体Ⅰ研究进展

上世纪80年代,首次报道线粒体肌病和Leber视神经病患者线粒体DNA有突变,提示此疾病患者线粒体呼吸链有缺失,拉开了线粒体呼吸链缺失与疾病关系研究的序幕.现已发现100多种疾病(包括成人和儿童)与线粒体呼吸链缺失有密切关系.呼吸链酶复合体Ⅰ是线粒体呼吸链上第1个蛋白复合物,是线粒体呼吸第1个门户,在维持线粒体功能方面起中枢作用.有研究发现呼吸链酶复合体Ⅰ缺失不仅存在于帕金森等老年疾病,而且是神经变性疾病儿童阶段发病的动因[1].     

腺苷预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注后线粒体活性氧含量及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性和脑组织总抗氧化能力的影响

目的观察腺苷预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注后线粒体活性氧(ROS)含量及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性和脑组织总抗氧化能力(TAC)的影响。方法将18只雄性Sprague Dawley大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和腺苷预处理组,每组6只。造模前3 d腺苷预处理组大鼠腹腔注射腺苷注射液(1.5 mg·kg~(-1)),每日1次;假手术组和缺血再灌注组大鼠在相同时间点腹腔注射2 m L生理盐水。缺血再灌注组和腺苷预处理组大鼠采用改良线栓法制作大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,假手术组大鼠术中只分离血管,不插入线栓。血流阻断2 h后将线栓拔出,形成再灌注。造模后24 h采用化学荧光法检测3组大鼠缺血区脑组织线粒体中ROS水平及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性和TAC。结果缺血再灌注组大鼠缺血区脑组织线粒体中ROS水平显著高于假手术组(t=5.122,P=0.000),腺苷预处理组大鼠缺血区脑组织线粒体中ROS水平显著低于缺血再灌注组(t=4.107,P=0.001)。缺血再灌注组大鼠缺血区脑组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性显著低于假手术组(t=3.632、3.472,P=0.002、0.003),腺苷预处理组大鼠缺血区脑组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性显著高于缺血再灌注组(t=2.623、2.193,P=0.019、0.045)。3组大鼠缺血区脑组织TAC比较差异均无统计学意义(F=1.755,P=0.207)。结论腺苷预处理可通过保护线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性而减少MCAO大鼠脑缺血再灌注后线粒体ROS的生成。     

淫羊藿、枸杞子对老年大鼠线粒体DNA缺失、线粒体呼吸链酶复合体和ATP合成的影响

目的:研究淫羊藿、枸杞子对老年大鼠线粒体DNA缺失、线粒体呼吸链酶复合体及ATP合成的影响.方法:Wistar系雄性大鼠,幼年大鼠(1月龄)、青年大鼠(4月龄)每组均为12只;老年大鼠(22月龄,31只),随机分为对照组(10只)、淫羊藿组(10只)和枸杞子组(11只).用聚合酶链反应(PCR)、酶动力学和生物发光技术进行检测.结果:淫羊藿、枸杞子可减少老年大鼠心、脑、骨骼肌组织线粒体DNA缺失,提高心、脑线粒体三磷酸腺苷(ATP)的合成和心、骨骼肌线粒体呼吸链复合酶Ⅳ活力及脑线粒体呼吸链复合酶Ⅰ活力;淫羊藿还可提高脑线粒体呼吸链复合酶Ⅳ活力和骨骼肌线粒体ATP的合成.结论:淫羊藿、枸杞子对老年大鼠线粒体DNA的氧化损伤有保护作用.     

烧伤焦痂毒性物质提取物D1对大鼠肝线粒体呼吸链的损害

本文报告烧伤焦痂提取物中可溶于有机溶剂组分Ｄ１对大鼠肝线粒体功能及呼吸链的损害作用。结果表明第３态呼吸受Ｄ１抑制，第４态受Ｄ１刺激而增高，耗氧率变化与Ｄ１用量之间存在着显著的量效关系。低剂量时耗氧率的改变缓慢，高剂量时耗氧率的变化急剧。这个转折点在Ｄ１浓度为１ｍｇ／ｍｌ处。氰化羰酰－３－氟苯腙（ＦＣＣＰ）／第４态耗氧率比值随Ｄ１浓度增加而下降，磷酸化位点１底物与位点２底物的实验结果相似，在Ｄ１浓度     

TNFα对烫伤大鼠骨骼肌26S蛋白酶复合体及19S调节复合体的作用

目的 为阐明及防治烧伤后负氨平衡提供理论依据。方法在接近体内环境下于体外分别用免疫沉淀扣除法和间接ELISA法检测TNFα对30％体表皮肤全层烫伤大鼠烧伤后第1、2、3、5、7天内骨骼肌中26S蛋白酶复合体及19S调节复合体的活性和蛋白水平的影响。结果 TNFα可以刺激烧伤后大鼠骨筋肌中26S蛋白酶复合体及19S调节复合体的活性和蛋白表达水平明显升高。结论 TNFα对烧伤后大鼠骨骼肌中26S蛋白酶复合体系统的激活具有重要作用，从而加强蛋白质的分解代谢，这可能与烧伤后负氮平衡的发生密切相关。     

重度肥胖病人的淋巴细胞线粒体呼吸链中复合酶体的变化

目的：研究重度肥胖病人淋巴细胞线粒体呼吸链的功能。方法：测定５９例重度肥胖女性（肥胖组，体重指数为４９．６±１．７，年龄为４１．１±１．１岁）与６０例正常体重女性（对照组，体重指数为２２．５±０．６，年龄为４４．１±１．６岁）的淋巴细胞线粒体呼吸链中第三对复合酶体－辅酶Ｑ细胞色素ｃ氧化还原酶（ＣⅢ）的活性及酶动力学分析。结果：肥胖组ＣⅢ的活性显著高于对照组（Ｐ＜０．０１），以Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｏｎ酶动力学方法分折，肥胖组ＣⅢ的最大反应速率（Ｖｍａｘ）及米氏常数（Ｋｍ）均显著高于对照组（Ｐ＜０．０１）。结论：肥胖病人淋巴细胞线粒体呼吸链中电子流量增加伴复合酶体的效率下降，可能导致线粒体中自由基产生的增加．各种疾病的发病率增加。     

焦痂毒性提取物D1对肝线粒体呼吸链的抑制位点

本文报告焦痂提取物中溶于乙酸乙酯的毒性组含Ｄ１对大鼠肝线粒体呼吸链的抑制位点，用还原型酶Ⅱ在各呼吸态氧化还原变化观察Ｄ１对线粒体体磷酸化位点１通过电子流的影响。Ｄ１不阻滞电子流通过位点１，Ｄ１亦不影响辅酶Ⅱ（ＤＡＤＰ）：四甲基对苯醌还原酶活力。用四甲基氢醌作为电子供体，细胞色素ｃ为电子受体可直接测试位点２的功能状态，Ｄ１能抑ｄｕｒｏｑｕｉｎｏｌ；细胞色素Ｃ还原酶活力，其抑制程度与Ｄ１浓度有关，位点     

BN-PAGE在棕色脂肪线粒体呼吸链超级复合体分析中的应用

目的 建立一种敏感、特异的棕色脂肪线粒体超级复合体(supercomplexes, SCs)分离及活性检测方法,有助于了解棕色脂肪线粒体的功能。方法 分离并纯化小鼠棕色脂肪线粒体。采用蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(blue native polya-crylamide gel electrophoresis, BN-PAGE)分离不同大小的线粒体SCs。经考马斯亮蓝染色和免疫印迹分析各组分的表达情况。将凝胶置于不同的底物液孵育,根据显色反应确定线粒体复合物的酶活性。结果 成功提取棕色脂肪线粒体。考马斯亮蓝染色和免疫印迹结果显示棕色脂肪线粒体SCs清晰可见,分子量在720～1 236 kD之间,与预期相符。棕色脂肪线粒体SCs在复合物Ⅰ或复合物Ⅱ的底物液中呈紫色,在复合物Ⅳ的底物液中呈棕色。结论 本研究建立的棕色脂肪线粒体SCs分析方法简便易行、结果直观,为肥胖及其相关代谢性疾病的研究提供了实验基础。     

鱼藤酮帕金森大鼠呼吸链复合酶I、Ⅳ的改变

目的 研究鱼藤酮帕金森模型大鼠呼吸链复合酶I、IV的变化.方法 雄性Wistar大鼠每日颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液2 mg/(kg·d)连续3～5周制备鱼藤酮帕金森模型大鼠;按行为学评分标准记分.模型动物分成高分组、低分组、模型4周组.分光光度法测定呼吸链复合酶I、IV.结果 模型低分组肌肉呼吸链复合酶I受到明显抑制,停给鱼藤酮4周后肌肉和黑质呼吸链复合酶I显著低于正常.而模型高分组肌肉呼吸链复合酶I升高,模型各组肌肉呼吸链复合酶IV均见升高,但黑质未见升高.结论 鱼藤酮帕金森模型大鼠肌肉和黑质呼吸链复合酶I明显抑制.肌肉见呼吸链复合酶IV代偿性升高而黑质未见.     

高原鼠兔和Wistar大鼠骨骼肌线粒体的比较蛋白质组学初步研究

目的 采用比较蛋白质组学方法研究高原鼠兔和Wistar大鼠线粒体蛋白的差异.方法 分别在海拔4 500 m高原(高原鼠兔)和模拟4 500 m低压舱内麻醉动物后取双侧腓肠肌,分离纯化线粒体蛋白进行二维电泳和凝胶图像分析,对差异蛋白质用MALDI-TOF-MS质谱仪进行肽指纹图谱测定和ESI-Q-TOF串联质谱鉴定.结果 高原鼠兔和Wistar大鼠线粒体蛋白二维凝胶图谱有明显差异;鉴定了泛醌-细胞色素C还原酶核心蛋白Ⅰ、硫氧还原蛋白依赖性过氧化物还原酶线粒体前体蛋白、线粒体胸苷激酶2、肌酸激酶线粒体异构体4、推测蛋白XP_499518、未知功能蛋白、肌酸激酶、F1F0-ATP酶d亚基、镁依赖性蛋白磷酸酶1D、推测蛋白LOC498909等差异线粒体蛋白.结论 高原鼠兔和Wistar大鼠有差异线粒体蛋白,提示高原鼠兔线粒体能量代谢、抗氧化能力、线粒体DNA稳定性等方面有其特点.     

缺氧预适应小鼠脑组织中缺氧诱导因子-1的表达

为探讨缺氧诱导因子-1(HIF-1)在缺氧预适应小鼠脑组织中的表达,用Western印迹法检测慢性缺氧(H)和不缺氧(C)HeLa细胞、急性重复性缺氧0次(H₀)、1次(H₁)、4次(H₄)小鼠脑组织中的HIF-1α.结果:慢性缺氧HeLa细胞中可检测到较多的HIF-1α,H₀组脑组织中检测不到HIF-1α,H₁组检测到微量HIF-1α,H₄组检测到较多HIF-1α.结果显示:脑组织中HIF-1α 的含量随缺氧预适应的产生而逐步增加,提示HIF-1可能参与缺氧预适应的形成.     

缺氧预适应小鼠脑组织中缺氧诱导因子-1的表达

为探讨缺氧诱导因子 1 (HIF 1 )在缺氧预适应小鼠脑组织中的表达 ,用Western印迹法检测慢性缺氧 (H)和不缺氧 (C)HeLa细胞、急性重复性缺氧 0次 (H0 )、1次 (H1)、4次 (H4 )小鼠脑组织中的HIF 1α。结果 :慢性缺氧HeLa细胞中可检测到较多的HIF 1α,H0 组脑组织中检测不到HIF 1α ,H1组检测到微量HIF 1α,H4 组检测到较多HIF 1α。结果显示 :脑组织中HIF 1α的含量随缺氧预适应的产生而逐步增加 ,提示HIF 1可能参与缺氧预适应的形成。     

慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌组织泛素系统基因及蛋白表达的变化

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠骨骼肌组织内蛋白降解的信号分子泛素-蛋白酶体系统基因和蛋白表达的变化及意义。方法采用单纯熏香烟法复制COPD大鼠动物模型。Western印迹法测定大鼠伸趾长肌内蛋白酶体C2亚基蛋白的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测伸趾长肌内泛素和E2-14kmRNA表达变化。结果RT-PCR分析结果显示,伸趾长肌组织中泛素、E2-14k mRNA表达(积分光密度值)较对照组显著增加(P值均<0.05)。Western印迹法分析结果显示,伸趾长肌组织中蛋白酶体C2亚基蛋白的表达较对照组显著增强(P<0.05)。结论COPD大鼠骨骼肌泛素系统基因表达和蛋白表达显著增强,提示骨骼肌内泛素-蛋白酶体途径活性上调,是蛋白降解增强的原因之一。     

雌性大鼠成骨细胞内雌激素受体表达的研究

目的：研究雌性大鼠一生中成骨细胞内雌激素受体(ER)表达水平的变化规律。方法：采用二次酶消化、反复贴壁法分离纯化培养大鼠成骨细胞并进行鉴定,应用半定量Western blot对不同月龄雌性Wistar大鼠成骨细胞内雌激素受体进行检测。结果：ER表达在1、2月龄组呈低度表达,3月组ER开始呈现上升趋势,至8、9、10月组ER达到高峰,10月组以后表达呈现下降趋势。结论：ER表达在不同月龄大鼠呈规律性分布,雌激素受体的表达应与雌激素水平是相一致的。     

FATP4在大鼠非酒精性脂肪肝中的作用

目的　研究脂肪酸转运蛋白 (fattyacidtransportprotein4,FATP4)基因在大鼠非酒精性脂肪肝形成中的作用。方法　建立高脂饮食脂肪肝模型 ,用半定量逆转录聚合酶链反应 (reversetranslationpolymerasechainreaction ,RT PCR)与蛋白质印迹 (Westernblot)方法测定脂肪肝肝组织中FATP4表达变化。结果　高脂饮食脂肪肝大鼠肝脏中FATP4于 2周时其mRNA及蛋白表达增强 ,于 12周时表达最为明显 ,与正常组比较相差显著 (P <0 0 5 )。结论　高脂饮食引起FATP4表达增强 ,最初是一种适应性反应 ,随着FATP4表达进一步增强 ,导致脂肪酸代谢失衡 ,可能引起脂肪肝的发生。     

缺氧促使鼠气道平滑肌细胞丝裂原活化蛋白酶表达

目的 探讨缺氧情况下鼠气道平滑肌细胞丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MApK）的变化.方法 雄性Wistar大鼠采用缺氧方法,用随机数字表法随机分为正常对照组、缺氧4周组,每组6只.按实验要求完成缺氧时间,12 h内留取肺叶组织,行免疫组织化学.结果 免疫组织化学染色显示,对照组大鼠肺小动脉内膜有散在免疫阳性染色,低氧组大鼠肺气道内膜则可见明显的免疫阳性染色.经灰度扫描,低氧组大鼠肺气道壁MAPK免疫染色阳性强度较对照组明显增强（P＜0.01）.结论 MAPK在缺氧性肺病引起的气道平滑肌细胞增生中可能起着重要作用.     

吸烟对大鼠骨骼肌细胞葡萄糖转运子4基因表达及蛋白含量的影响

目的:探讨吸烟对胰岛素抵抗(IR)大鼠骨骼肌细胞葡萄糖转运子4mRNA基因表达及蛋白含量的影响。方法:正常6周龄Wistar大鼠48只,随机分为3组,分别为正常饲养组、高脂饲养组及糖尿病组,每组再随机分为吸烟组与对照组,吸烟组进行12周熏烟实验,应用高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术进行IR的评价。应用RT-PCR及免疫组化技术检测被动吸烟大鼠及各自对照组大鼠骨骼肌细胞葡萄糖转运子4mRNA基因表达及蛋白含量的影响。结果:正常吸烟组、高脂饲养及糖尿病吸烟组葡萄糖输注率(GIR)明显低于各自对照组[(27.21±4.71)比(34.93±4.91)mg/(kg·min);(12.78±2.34)比(21.68±2.27)mg/(kg·min);(13.81±2.34)比(17.22±1.90)mg/(kg·min);P<0.01]。正常饲养吸烟组、高脂饲养吸烟组及糖尿病吸烟组大鼠骨骼肌细胞葡萄糖转运子4mRNA基因的表达量及蛋白含量与各自对照组相比无明显差异[(0.53±0.04)比(0.58±0.06)mg/(kg·min);(0.40±0.09)比(0.42±0.04)mg/(kg·min);(0.35±0.10)比(0.37±0.06)mg/(kg·min);P>0.05及(7.84±0.44)比(8.21±0.42)mg/(kg·min);(6.48±0.47)比(6.81±0.24)mg/(kg·min);(4.96±0.39)比(5.10±0.57)mg/(kg·min);P>0.05]。结论:吸烟能导致大鼠IR,吸烟对大鼠骨骼肌细胞葡萄糖转运子4mRNA基因表达及蛋白含量无明显影响,葡萄糖转运子4mRNA基因表达及蛋白含量可能不参与吸烟致IR的发生机制。     

骨骼肌桥接与神经移植对大鼠周围神经缺损的修复作用

目的：比较用半吻合、半埋入法骨骼肌桥接与神经移植治疗神经缺损的效果,以探讨半吻合、半埋入法骨骼肌桥接的临床应用价值。 方法：选用体重200～300 g成年Wistar大白鼠15只,随机选择每只左侧后肢的坐骨神经造成的神经缺损用半吻合、半埋入法骨骼肌桥接,右侧神经缺损采用神经束膜缝合移植修复。大白鼠分笼饲养3个月。 结果：3个月后,大白鼠双下肢功能均得到恢复,通过肉眼观察、手术显微镜下观察、神经肌电图检查及组织学检查,骨骼肌桥接侧与神经移植侧差异无显著性。半吻合、半埋入法骨骼肌桥接治疗周围神经缺损取得与神经移植相近的结果。 结论：半吻合、半埋入法骨骼肌桥接手术难度低、时间短、吻合牢靠,是一种具有潜在临床应用价值的神经修复方法。