人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化及相关基因时序表达的影响

背景：大量有关动物的体内外研究表明，骨髓间充质干细胞在心肌微环境或模拟心肌微环境的作用下可分化为心肌细胞。然而，类似的人类研究报道较少，同时相关的分化机制也不甚清楚。 目的：探讨人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响及相关基因的时序表达。 方法：体外分离培养人类骨髓间充质干细胞，传至第4代加入自体心肌匀浆上清液诱导骨髓间充质干细胞，持续作用2周。相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态变化，免疫荧光方法鉴定心肌特征性肌动蛋白α和肌钙蛋白的表达，应用半定量RT-PCR技术分析Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC、肌钙蛋白等相关基因在分化过程中的动态时序表达。 结果与结论：经心肌匀浆上清液诱导后，骨髓间充质干细胞体积变大，立体感增强，形态近似棒状。诱导2周时肌动蛋白α及肌钙蛋白阳性细胞比例分别为25.53%和23.48%。Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C基因在诱导后3 d表达开始增强, 其中GATA-4、MEF-2C诱导后5 d达高峰,以后维持在较高水平，Nkx-2.5则随诱导时间逐渐增强；α-MHC、肌钙蛋白基因诱导前无表达，于诱导第3天出现表达，以后维持在高水平。结果提示，心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞具有定向诱导作用，在此过程中，伴随着Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC和肌钙蛋白基因的时序表达变化。     

胎儿真皮间充质干细胞中的全能性相关转录因子的表达***◆

背景：人真皮纤维母细胞或间充质干细胞可形成诱导性多能干细胞,但不同研究者所用的转录因子组合却并不相同。 目的：分离人胎儿真皮间充质干细胞,检测其全能性相关转录因子的表达。 方法：水囊引产5月龄胎儿,按照既往分离培养间充质干细胞的方法,得到胎儿真皮间充质干细胞。 结果与结论：胎儿真皮间充质干细胞高表达Oct4和C-myc、中度表达Sox2,是形成诱导性多能干细胞较好的体细胞。     

羊水来源胎儿间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化

背景：羊水细胞已广泛应用于与基因突变有关疾病的产前诊断，但目前关于羊水来源胎儿间充质干细胞的分离培养、细胞表面特征鉴定、细胞分化及其应用前景的文献并不多见。 目的：体外诱导孕中期羊水来源的胎儿间质干细胞向成骨细胞方向分化。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-08/2006-05在新华医院实验中心完成。 材料：10例羊水标本取自孕18~22周行产前诊断或流产的孕妇，取前均征得孕妇本人同意。 方法：采用机械手段挑取孕中期羊水细胞培养体系中的胎儿间充质干细胞集落，体外培养扩增。取第3代胎儿间充质干细胞，以100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸和50 mg/L维生素C持续诱导14 d。 主要观察指标：免疫组化染色检测碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达，Western Blot蛋白印记法检测Ⅰ型胶原蛋白的表达，Von Kossa染色法检测钙结节形成能力，激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白形成。 结果：分离出的胎儿间充质干细胞为CD44和HLA-ABC阳性，CD34、CD45、HLA-DR阴性，符合间充质干细胞特点。成骨诱导14 d后，细胞碱性磷酸酶染色阳性率达91%，Ⅰ型胶原阳性率达87%；表达Ⅰ型胶原蛋白；随诱导时间的延长钙结节逐渐增多、增大；镜下可见细胞胞质中的微丝呈绿色荧光，细胞周围的微丝形成致密的周围束。 结论：羊水来源的胎儿间充质干细胞可以分化为成骨细胞，且与典型的成骨细胞具有相似的形态学和生物学特征。     

人胎儿肝脏来源C-kit+细胞的特征*◆

背景：在成年动物肝脏中干细胞含量很少,且体外大量扩增并保持未分化状态的问题仍然没有很好的解决,许多科研者预测胚胎肝干细胞可能具有诱人的临床应用价值。近年来C-kit被选择作为研究肝干细胞的共同标志,并发现C-kit抗原参与肝干细胞的生长和发育。 目的：对胎儿肝脏来源的C-kit+细胞进行分离培养,观察其体外生长和分化的特征。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-10/2008-03在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成。 材料：肝脏C-kit+细胞来源于32例流产胎儿,由南京大学医学院附属鼓楼医院提供。Percoll分离液为Pharmacia公司产品,Ficoll分离液为天津灏阳生物制品科技有限责任公司产品,表皮生长因子、肝细胞生长因子为R&D公司产品。 方法：无菌状态下取出胎儿肝脏,以胶原酶消化法和机械分离法获得胎儿肝脏来源单细胞悬液,分别采用1.070 g/mL Percoll分离液和1.077 g/mL Ficoll分离液进行密度梯度离心,吸取界层细胞,添加含体积分数为0.1 FBS、20 μg/L肝细胞生长因子、40 μg/L表皮生长因子的DMEM/F12新鲜培养基诱导9 d。 主要观察指标：胎儿肝脏中C-kit+细胞计数,界层细胞形态、生长特征、表型及C-kit标志的鉴定,界层细胞诱导分化结果。 结果：未经分离的新鲜胎儿肝脏细胞中C-kit+细胞所占比例仅为1.28%,使用Percoll和Ficoll分离液获取的界层细胞分布在三角形区域内的C-kit+细胞所占比例显著增加,分别为74.21%和72.15%,但绝对数量仍然有限。两种分离液获取的界层细胞在形态、生长状况方面基本相似,免疫细胞化学染色鉴定后大体可分为4类：第1类细胞为C-kit+细胞集落,第2类细胞既呈CD29+、CD90+、CD34-、C-kit-（间充质干细胞表型特征）,又较弱地表达细胞角蛋白19（胆管细胞特异性标志）,第3类细胞较强地表达细胞角蛋白19,不表达C-kit抗原,第4类细胞高表达CD45,微弱表达CD34、CD90、C-kit。诱导后,界层细胞角蛋白19呈强阳性表达,不表达C-kit、白蛋白、甲胎蛋白及细胞角蛋白18。 结论：胎儿肝脏中的C-kit+细胞数量很少,Percoll和Ficoll分离液均可提高C-kit+细胞的得率。胎儿肝脏中可能存在的一类间充质-胆管细胞的中间态细胞,这种细胞可能有促进C-kit+细胞生长的作用。间充质干细胞可向胆管细胞分化。     

胎儿骨髓源性胚胎后亚全能干细胞分离培养及向肝细胞的诱导分化★◆

背景：目前研究认为在胚胎发育后的多种组织中存在一类干细胞群体，可分化为不同胚层的组织细胞；但又不同于胚胎干细胞，随着妊娠期间胚胎的发育胚胎干细胞会逐渐失去部分分化潜能，会出现一些特殊表型或分子标记，如CD105，称其为胚胎后亚全能干细胞。 目的：根据胚胎后亚全能干细胞表达CD105的特性分离胎儿骨髓源性胚胎后亚全能干细胞，经体内外诱导使其分化为肝细胞样细胞并检测其功能。 设计、时间及地点：动物随机分组，细胞分子生物学实验，于2003-03/2005-03在天津市第三中心医院卫生部人工细胞工程技术研究中心完成。 材料：取22周龄左右胎儿股骨和胫骨骨髓分离出胚胎后亚全能干细胞。以雌性成年SCID鼠作为干细胞移植的受体。CD105免疫磁珠为德国Miltenyi Biotec产品。鼠抗人白蛋白抗体为美国Sigma产品。碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子为英国PEPROTECH产品。 方法：利用密度梯度离心结合免疫磁珠方法分离胎儿骨髓CD105（+）胚胎后亚全能干细胞，体外培养，用含30 μg/L肝细胞生长因20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的诱导培养基将其向肝细胞样细胞诱导分化。将24只SCID鼠随机分为干细胞治疗组和对照组，每组12只，均按800 mg/kg的剂量向腹腔内注射D-氨基半乳糖制备肝损伤模型。造模次日，干细胞移植组鼠在肝原位输注106左右CD105（+）细胞，对照组分别输注106左右的CD105(-)细胞或同等体积的培养液。 主要观察指标：于干细胞移植后2，7 d，1，3个月对肝脏组织行免疫组化检测人源白蛋白表达。 结果：免疫磁珠筛选后的细胞免疫细胞化学检测CD105呈弱阳性表达；细胞在对数生长期的倍增时间为30 h左右；约传10代后进入衰退期。SCID鼠移植胚胎后亚全能干细胞3个月后在小鼠肝脏中可见有点状或小灶状的人白蛋白表达，对照组未见表达。 结论：来源于胎儿骨髓的胚胎后亚全能干细胞可以在肝脏微环境下转化为肝细胞样细胞。     

引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞的比较*

背景：骨髓间充质干细胞是多能干细胞,同时可参与免疫调节反应,而成人及引产胎儿骨髓均是间充质干细胞的重要来源。 目的：通过引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞的细胞形态、免疫表型、增殖活性及分泌细胞因子的比较,揭示二者生物学特点的差异。 方法：采用密度梯度离心法分离引产儿与正常成人骨髓单个核细胞,通过贴壁法培养骨髓间充质干细胞,收集传3代后的骨髓间充质干细胞,流式细胞术鉴定其免疫表型、MTT比色法检测其增殖活性以及用ELISA法检测细胞培养上清液中白细胞介素6、血小板源性生长因子和表皮生长因子的水平。 结果与结论：引产儿组和正常成人组骨髓间充质干细胞形态相似、表型相同,分泌细胞因子水平无显著差异,但引产儿细胞增殖活性显著高于正常成人。提示引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞除增殖活性有差异外,其余生物学特点相似,引产儿可以为间充质干细胞研究提供新的骨髓来源。     

胎儿胰岛中干细胞的分离与鉴定*☆

目的：已证实胰腺来源的干细胞或祖细胞在体内外均能分化为胰岛素分泌细胞，但成人胰腺来源的干细胞增殖潜能较差。实验旨在分离并鉴定胎儿胰岛样细胞团中的干细胞，为糖尿病细胞移植治疗寻找可用的种子细胞。 方法：实验于2006-10/2007-07在解放军军事医学科学院输血研究所干细胞与再生医学研究室完成。①对象：所用胰腺标本取自流产胎儿，胎龄14~20周，由解放军总医院妇产科提供，胎儿组织的使用得到孕妇本人的知情同意，实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：无菌条件下取出胎儿胰腺，37 ℃下用0.5 g/L的V型胶原酶进行消化，分离得到胎儿胰岛样细胞团，悬浮培养，加入含体积分数为0.1胎牛血清、1 mmol/L丙酮酸钠、1 mmol/L谷氨酰胺、71.5 μmol/L β-巯基乙醇、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基，每日转皿除去贴壁细胞，72 h后挑选出悬浮生长的胰岛样细胞团予以贴壁培养，待长成上皮样单层细胞克隆时传代。③实验评估：将悬浮培养的胰岛样细胞团行双硫腙染色。另将少部分胰岛样细胞团及第4代细胞种植于24，96孔板中，采用免疫荧光染色检测细胞表面分子标志物增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin、角蛋白19、波形蛋白、胰岛素、胰高血糖素、CD29的表达情况。MTT法分析第6代细胞的生长曲线。 结果：①悬浮及贴壁培养的胰岛形态：刚分离出的胰岛呈簇状，边缘不规整，细胞排列较疏松。贴壁后胰岛样细胞团由簇状逐渐展开形成上皮样单层细胞克隆。传代后细胞形态发生改变，呈梭形或分支样，增殖较快。②悬浮培养的胰岛双硫腙染色检测：分离得到的胎儿胰岛样细胞团双硫腙染色呈阳性表达。③细胞表面标志免疫荧光染色检测：贴壁的第1代细胞大部分呈增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin、波形蛋白阳性，极少数细胞呈胰岛素、胰高血糖素阳性，而角蛋白19为阴性。传代后仍呈增殖细胞核抗原、胰十二指肠同源盒基因1、Nestin、波形蛋白阳性，角蛋白19弱阳性，而胰岛素、胰高血糖素为阴性，所有细胞均不表达CD29。④细胞生长曲线：传代第3天细胞进入对数生长期，第6天进入平台期，细胞生长曲线呈“S”形。 结论：由胎儿胰岛成功分离并培养出具有自我更新和良好增殖能力的干细胞，稳定表达多种胰腺干细胞特征性标志，而不表达胰岛细胞标志物，提示该细胞可作为候选的胰岛干细胞用于糖尿病细胞移植治疗。     

多种生长分化因子体外联合诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞的分化☆

背景：肝细胞自身增殖能力有限,近几年关于各类干细胞向肝细胞分化的成功报道很多,包括胚胎干细胞、骨髓细胞、胰腺干细胞、神经干细胞及各种来源的间充质干细胞等。 目的：探讨应用多种生长分化因子体外联合诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-10/2006-04在暨南大学医学院血液病研究所完成。 材料：胎儿脐带血来源于顺产及剖腹产的健康孕妇,由暨南大学第一附属医院产科提供,产妇均签署知情同意书。 方法：体外分离培养人脐血间充质干细胞,胰酶-EDTA消化传代。取传至第3代细胞,按5×104/cm2接种,48 h后去除原培养基,PBS洗涤后,第1阶段用含地塞米松、肝细胞生长因子、表皮生长因子、ITS的F12培养基诱导2周,第2阶段用含地塞米松、肝细胞生长因子、致瘤素M、ITS的F12培养基继续诱导2周。 主要观察指标：流式细胞仪检测脐血间充质干细胞表面标志的表达,RT-PCR检测肝细胞相关基因的表达,免疫荧光染色检测肝细胞相关蛋白的表达,透射电镜观察细胞超微结构。 结果：培养的细胞不表达造血细胞系标志CD34,CD45,CD14;亦不表达CD54,CD49f,HLA-DR;部分表达内皮细胞标志CD106;强表达CD29,CD44及CD13。诱导4周后,甲胎蛋白、白蛋白、ck-18及tat基因均呈阳性表达;免疫荧光染色显示细胞浆中甲胎蛋白、白蛋白、ck-18均呈阳性;细胞胞浆中出现脂滴及糖原的沉积,细胞表面有微绒毛,出现双核细胞,初步具备了肝细胞的超微结构特征。 结论：联合应用地塞米松、肝细胞生长因子、表皮生长因子、致瘤素M及ITS等多种生长分化因子,可在体外成功诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞分化。     

心肌梗死大鼠体外培养心肌组织对间充质干细胞迁移的作用

背景：间充质干细胞具有改善心脏功能的潜力,间充质干细胞移植后向心脏归巢的机制尚不完全清楚。 目的：观察心肌梗死大鼠体外培养的心肌组织对间充质干细胞迁移的作用及可能机制。 方法：建立大鼠心肌梗死模型,培养大鼠心脏组织块,密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,24只SD大鼠随机抽签法分为心肌梗死组、假手术组及正常对照组。假手术组只穿线不结扎,正常对照组不做任何处理。荧光染料DAPI标记间充质干细胞,利用transwell模型进行共培养,共培养48 h。荧光镜下计数迁移细胞数,CD34/CD44免疫细胞化学染色进行迁移细胞定性,免疫荧光检测迁移细胞CXCR4的表达情况,心脏组织切片行免疫组织化学染色检测基质细胞衍生因子1的表达情况并进行平均吸光度分析。 结果与结论：心肌梗死组单位视野迁移细胞数显著高于假手术组(P < 0.05),正常对照组未见迁移细胞。免疫细胞化学染色显示迁移细胞CD44阳性而CD34阴性,符合间充质干细胞特点,其膜受体CXCR4阳性表达。心肌梗死组及假手术组心脏切片基质细胞衍生因子1阳性表达,正常对照组心肌组织不表达基质细胞衍生因子1。心肌梗死组心脏组织基质细胞衍生因子1平均吸光度显著高于其他组别(P < 0.05)。提示心肌梗死后大鼠心脏组织能促进间充质干细胞迁移,这一效应的实现可能与基质细胞衍生因子1-CXCR4轴的作用有关。     

无血清培养肾癌干细胞及其鉴定

背景：肿瘤干细胞理论的产生,对肿瘤的发生、发展及其发病机制有了更新的认识,为肿瘤研究提供了新的方向,通过无血清培养技术已从许多肿瘤中分离并鉴定出特定的肿瘤干细胞。目前,无血清培养已成为培养肿瘤干细胞的经典培养方法。 目的：运用无血清培养的方法从肾癌细胞中获取肾癌干细胞,并进行鉴定。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-02/2009-02在江苏大学完成。 材料：肾癌细胞株OS-RC-2由上海中科院细胞库提供。 方法：取处于对数生长期的肾癌细胞OS-RC-2,悬浮于预先配好的DMEM/F12无血清培养基中(含表皮生长因子20 μg/L,碱性成纤维细胞生长因子20 μg/L),观察生长情况,培养7 d后运用流式细胞仪测定CD133及CD34的表达。以不含细胞因子的高糖DMEM/F12培养液培养细胞作为阴性对照。另外收集无血清培养7 d的肾癌细胞球,重悬于含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM/F12培养基中,进行干细胞分化实验观察。 主要观察指标：①倒置显微镜下观察肾癌干细胞生长情况。②流式细胞仪检测肾癌干细胞及肾癌细胞中CD133及CD34的表达。③收集无血清培养7 d后的肾癌干细胞重新常规培养并观察其分化情况。 结果：①肾癌细胞接种于含细胞因子的无血清培养基2 d后可见有细胞球生成,7 d后细胞球明显增多,体积增大。对照组肾癌细胞则贴壁生长,未见细胞球生成。②流式细胞仪检测显示,肾癌细胞球中CD133+CD34-表达率(8.33±1.26)%,对照组肾癌细胞表达率(1.24±0.36)%(t =-19.71,P < 0.05)。③肾癌细胞球重新悬浮于含体积分数为10%胎牛血清的培养液2 d后可见细胞球分散为单个细胞,恢复原来贴壁生长特点,CD133及CD34表达与阴性对照相同。 结论：利用含细胞因子表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子无血清培养的方法可以从肾癌细胞中获取肾癌干细胞。