慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染血管内皮祖细胞的实验研究

目的探讨HIV-1来源的慢病毒载体介导绿色荧光蛋白（GFP）基因转染血管内皮祖细胞（EPCs）的可行性和方法。方法用梯度密度离心法分离人脐带血内皮祖细胞,在EGM-2培养基中培养。用细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测其表达情况。以HIV-1来源的慢病毒为载体、以GFP基因为目的基因转染EPCs,MTT法检测不同病毒滴度（MOI）时细胞增殖情况并观察转染率。结果单个核细胞经EGM-2培养基培养1周后即分化成EPCs。GFP转染后48 h细胞即发出绿色荧光。MOI 1∶10转染组细胞转染率低于MOI 1∶50组（P〈0.05）。MOI 1∶50转染后的细胞与未转染GFP组比较,生长曲线无明显差异（P〉0.05）。MOI 1∶100组转染后细胞的增殖处于停滞状态。结论采用HIV-1来源的慢病毒载体介导GFP基因转染标记EPCs是可行的。以MOI 1∶50进行转染对细胞生长影响小,转染效率高。     

慢病毒介导PXR体内转染对CCl_4诱导的大鼠肝损伤的保护作用研究

目的探讨PXR对CCl4诱导的大鼠肝损伤的保护作用。方法雄性SD大鼠48只,随机分为4组,空白组不做任何处理;模型组通过CCl4灌胃诱导肝损伤;空载体组在建立肝损伤模型前3天静脉注射慢病毒空载体;PXR慢病毒组在建立肝损伤模型前3天静脉注射PXR重组慢病毒。通过血清AST和ALT检测和肝脏HE染色评估肝损伤程度;Western blot及RT-PCR检测大鼠肝组织中PXR、NF-κB、IL-1、IL-2和TNF-α的表达。结果慢病毒介导PXR体内转染后肝损伤大鼠血清AST和ALT明显降低,肝损伤及纤维化程度明显减轻,PXR表达水平明显升高,相反,NF-κB、IL-1、IL-2和TNF-α的表达水平明显降低。结论 PXR可能通过抑制NF-κB的表达,下调炎症相关因子IL-1、IL-2和TNF-α的表达,从而对CCl4诱导的大鼠肝损伤具有一定的保护作用,可为肝损伤的治疗提供一种新的途径和思路。     

ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体的构建

目的设计并构建针对ECEL1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA(shRNA)干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DNA oligo。利用Age I和EcoR I双酶线性化GV115载体。把载体和DNA oligo相连接,其连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR扩增并测序鉴定。再通过质粒抽提,转染,浓缩与纯化后获得重组的ECEL1基因RNAi慢病毒,用"HIV-1p24抗原ELISA法"测定样品滴度。选取检测合格的慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,荧光观察感染率。并使用Real-time PCR法及Western blot检测人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因敲减后mRNA和蛋白质的表达量。2组间比较采用两独立样本t检验。结果 (1)根据ECEL1基因模板设计后,选定psc48784片段作为RNA干扰靶点,制备双链DNA oligo,PCR鉴定阳性重组子并测序,验证psc48784为正确的克隆。经过质粒抽提,转染以及浓缩纯化后,成功构建ECEL1基因RNAi慢病毒。物理检测与无菌检测合格。(2)通过HIV-1 p24抗原ELISA法测定ECEL1基因RNAi慢病毒样品病毒滴,测定样品病毒滴度为3×108TU/ml;表明已成功构建高滴度且合格的ECEL1基因RNA干扰慢病毒。(3)用ECEL1基因RNAi慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),荧光观察结果显示细胞感染效率达到80%,细胞状态稳定;使用Real-time PCR的方法及Western blot检测实验组人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因在mRNA和蛋白质水平的表达量受到抑制(P值均0. 05),敲减效率达到70. 5%。结论成功构建ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体并获得稳定高滴度的病毒样品,并获得稳定的ECEL1基因敲减的人肝癌细胞(BEL-7404)。     

B7基因转染治疗原发性肝癌的实验研究

Ｂ７基因转染治疗原发性肝癌的实验研究袁爱力张智翔肖丽萍侯淑琴肿瘤细胞缺乏主要组织相容性复合体（ＭＨＣ）－Ⅰ类抗原表达是肿瘤患者免疫监视功能低下的重要原因。实验研究已证实将ＭＨＣ－Ⅰ类基因Ｈ－２Ｋ导入到鼠白血病细胞中后不仅可以表达，而且杀伤活性亦增强［...     

DR-nm23基因慢病毒表达载体的构建及其在人结直肠癌SW620细胞中的表达

目的:构建DR-nm23基因慢病毒表达载体及建立DR-nm23基因稳定表达的人结直肠癌SW620细胞系,为DR-nm23基因功能研究奠定基础,方法:应用逆转录聚合酶链反应方法筛选无内源性DR-nm23基因表达的人结直肠癌细胞系.通过AgeⅠ酶切获得DR-nm23 eDNA片段,并将其交换连接到慢病毒表达载体pGC-FU...     

重组腺相关病毒(rAAV)介导的基因转染的遗传影响研究

目的：重组腺相关病毒载体（rAAV）是治疗遗传性疾病和慢性病最有前途的基因载体，本文研究重组腺相关病毒介导的基因转染的遗传效应。方法：将成年的2月龄雄性昆明小鼠分为三组，分别自尾静脉注入rAAV-D（＋）-HK、rAAV-D（＋）-GFP病毒颗粒和生理盐水，两周后将其以1：1的比例与成年的雌性昆明小鼠合笼。观察各组小鼠在一周内的受孕率、各组产仔情况、第一代及其子代的主要脏器组织形态学特性、HK基因在第一代及其子代的表达情况，以及HK基因的整合情况等。结果：重组腺相关病毒对基因转染小鼠的受孕率、产仔情况无影响；重组腺相关病毒携带的目的基因可以在第一代和第二代小鼠中实现稳定表达，并可整合到第一代和第二代小鼠的基因组中，基因转染的第一代和第二代小鼠的主要脏器病理学检查均未见明显异常；重组腺相关病毒并未影响第二代小鼠的生长发育。结论：重组腺相关病毒载体可通过昆明小鼠的血-睾屏障，在第二代小鼠中实现稳定表达。且在第一代和第二代昆明小鼠中均未观测到明显的毒性反应。     

半随病毒载体介导帕金森病基因治疗的实验研究

一、材料和方法　　 1.腺伴随病毒 (ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ,ＡＡＶ)载体的制备 :酪氨酸羟化酶 (ｔｙｒｏｓｉｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ,ＴＨ)质粒〔芳香族氨基酸脱羧酶 (ａｒｏｍａｔｉｃａｍｉｎｏ ａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｌａｓｅ ,ＡＡＤＣ)或三磷酸鸟苷环水解酶Ｉ(ＧＴＰｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅＩ,ＧＣＨ)质粒〕是ＡＡＶ基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第 1内含子、人源性ＴＨ(ＡＡＤＣ或ＧＣＨ)基因、ＳＶ40多聚腺苷信号的载体质粒。以磷酸钙沉积法共转染载…     

慢病毒载体介导人缝隙连接蛋白43基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建带有缝隙连接蛋白43基因的慢病毒载体,并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应获得人缝隙连接蛋白43基因,利用infusion技术重组构建慢病毒载体质粒FUGW-缝隙连接蛋白43,在脂质体介导下与包装质粒和包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后,在荧光显微镜下观察缝隙连接蛋白43蛋白表达情况。结果所获缝隙连接蛋白43基因经测序后与GeneBank报道序列完全一致;重组慢病毒载体质粒FUGW-缝隙连接蛋白43经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为1×1011TU/L;感染大鼠骨髓间充质干细胞后荧光显微镜观察到胞膜位置点线状荧光分布。结论成功构建带有缝隙连接蛋白43基因的慢病毒载体并实现在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达,为间充质干细胞移植治疗心肌梗死的应用奠定了基础。     

慢病毒载体介导的结缔组织生长因子基因沉默对下游基因的影响

目的利用RNA干扰技术,以慢病毒为载体,介导结缔组织生长因子(CTGF)基因沉默,并观察其对下游基因表达的影响。方法用构建的CTGF小干扰RNA(siRNA)慢病毒转移质粒与包装质粒、包膜蛋白质粒共转染293T细胞,包装成介导CTGF基因沉默的慢病毒载体;感染肝星状细胞系HSC-T6,应用Real-time PCR和Western免疫印迹法筛选基因沉默效率最高的慢病毒载体;再根据绿色荧光蛋白(GFP)表达水平检测感染效率;应用Real-time PCR法检测CTGF基因沉默后HSC-T6中金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2和I型胶原mRNA表达水平。结果包装的慢病毒载体感染HSC-T6细胞的效率高于50%;感染HSC-T6细胞后,CTGF的表达在mRNA和蛋白水平均受到明显抑制,其中TS1具有最佳的抑制效率;HSC-T6细胞CTGF基因沉默后,其TIMP-1、TIMP-2和I型胶原mRNA水平也显著降低。结论包装的慢病毒载体在HSC-T6中具有较好的感染效率和CTGF基因沉默效果,基因沉默后可进一步抑制HSC-T6细胞TIMP-1、TIMP-2和I型胶原的基因表达,这在抗纤维化的研究中具有积极的意义。     

CDK2 shRNA慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的构建CDK2 shRNA慢病毒载体,并在黑色素瘤细胞B16-F1中鉴定其基因沉默效应。方法体外构建3个慢病毒重组目的质粒p UL-CDK2-shRNAs和1个阴性对照慢病毒重组质粒p UL-NC-shRNA,转化感受态细胞,PCR鉴定后进一步测序验证;293T细胞中测定病毒滴度;用重组慢病毒感染B16-F1细胞测定其感染效率,RT-PCR和Western印迹检测其对B16-F1细胞中CDK2的基因沉默效应。结果 PCR鉴定后进一步测序表明,成功构建了重组慢病毒质粒;病毒滴度为4.5×107~5.5×107TU/ml;用重组慢病毒感染B16-F1细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率可达90%;RT-PCR和Western印迹结果表明,与未感染组和NC-shRNA感染组细胞相比,CDK2-shRNA1、CDK2-shRNA2、CDK2-shRNA3感染的细胞中CDK2 mRNA和蛋白表达均受到不同程度抑制(P0.05),以CDK2-shRNA3感染组的抑制率最高,RT-PCR和Western Blot检测其抑制率分别为78.5%±4.23%和70.5%±3.54%。结论利用RNAi技术成功构建了3种CDK2-shRNA重组慢病毒载体,均可有效感染B16-F1细胞并具有一定的基因沉默效应,其中以针对靶位点1012-1020的p UL-CDK2-shRNA3基因沉默效应最强,为进一步研究CDK2基因沉默对黑色素瘤化疗敏感性的影响奠定了基础。     

慢病毒载体在大鼠颈动脉球囊损伤模型中的应用及观察

目的:研究携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒转染球囊损伤大鼠颈动脉的效率和可行性,为利用慢病毒载体介导的基因治疗预防血管再狭窄奠定基础。方法:将携带GFP的慢病毒载体(pGC-LV-GFP载体)和慢病毒包装质粒供转染293T细胞,完成慢病毒颗粒包装及滴度测定。包装产生的慢病毒Lenti-GFP转染至球囊损伤的大鼠颈动脉。术后28d,损伤及病毒转染血管段标本分别行荧光显微镜、光镜检查,评估慢病毒的转染效率及内膜增生情况,并与假手术组(Sham组)、PBS对照组进行比较。结果:经包装产生的Lenti-GFP滴度为2×109TU/mL;术后28d,Sham组与PBS组血管中膜弹力层仅见微弱的自发性绿色荧光,而Lenti-GFP组动脉壁全层可见较强的绿色荧光分布;PBS组与Lenti-GFP转染组大鼠损伤的颈动脉均可见明显内膜增生,内膜和中膜面积之比差异无统计学意义。结论:Lenti-GFP成功转染至球囊损伤的大鼠颈动脉,并能维持目的基因稳定长期的表达,是血管再狭窄基因治疗的理想载体。     

大鼠HO-1基因重组慢病毒载体的构建及在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建大鼠血红素加氧酶1 (HO-1)基因重组慢病毒载体lenti EGFP-HO-1,并检测其在骨髓间充质干细胞(BMSC)中的表达效率.方法 利用聚合酶链反应技术(PCR)扩增rat-HO-1基因,并克隆到pGV287 EGFP载体中,行PCR及测序鉴定所构建的重组质粒pGV287-EGFP-HO-1;将重组质粒pGV287-EGFP-HO-1及辅助包装质粒pHelper 1.0、pHelper 1.0共转染293细胞进行重组慢病毒lenti-EGFP HO-1的包装,并采用荧光标记法检测病毒滴度,再进一步感染BMSC,荧光显微镜下观察感染效果、Western blot检测BMSC内HO-1表达情况.结果 大鼠HO-1基因扩增产物大小为911 bp,与目的基因相关片段中HO1 cDNA大小一致.阳性克隆行PCR后形成498 bp,其大小与目的片段大鼠HO-1 cDNA相当,进一步测序鉴定提示与GenBank信息库中rat-HO-1基因mRNA一致.重组慢病毒lenti-GV287-EGFP-HO1滴度为2×108 TU/ml,感染BMSC后可观察到报告基因EGFP表达,慢病毒lenti-GV287-EGFP-HO-1感染组中可检测到HO-1蛋白表达.结论 本研究成功构建了重组慢病毒载体lenti-GV287-EGFP-HO-1,并能够在BMSC中高效表达,为进一步探索HO-1基因修饰间充质干细胞在肺损伤中的作用奠定了基础.     

Multiply attenuated, self-inactivating lentiviral vectors efficiently transduce human coronary artery cells in vitro and rat arteries in vivo

Endothelial cells (ECs) in normal vessels are poorly transducible by retroviral vectors, which require cell division for gene transduction. Among retroviruses, lentiviruses have the unique ability to integrate their genome into the chromatin of nondividing cells. Here we show that multiply attenuated, self-inactivating, lentiviral vectors transduce both proliferating and growth-arrested human umbilical vein ECs (HUVECs), human coronary artery ECs (HCAECs), and human coronary artery smooth muscle cells (HCASMCs), with high efficacy. Lentiviral vectors containing the enhanced green fluorescence protein (EGFP) transgene driven by either the cytomegalovirus or the elongation factor-1alpha promoter, but not the phosphoglycerate kinase promoter, directed high-level EGFP expression in endothelial and smooth muscle cells. The endothelium-specific Tie2 promoter also directed transgene expression in ECs. Re-insertion of cis-acting sequences from pol of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) into the vectors improved transgene expression. A lentiviral vector containing the vascular endothelial growth factor transgene promoted EC proliferation and sprouting in vitro. In vivo gene transfer was studied by lumenal infusion of vector containing solutions into rat carotid arteries. Lentivirus-mediated EGFP gene transfer was observed in approximately 5% of ECs. Lentiviral vectors containing the LacZ transgene achieved detectable beta-galactosidase activity in rat arteries, albeit at a lower level compared with adenoviral vectors. This difference was mainly due to the lower concentration of lentiviral vector preparations. Lentivirus-mediated gene transfer was associated with minimal neointimal hyperplasia and scant inflammatory cell infiltrates in the media and adventitia. These observations indicate that lentiviral vectors may be useful for genetic modifications of vascular cells in vitro and in vivo.     

黑色素瘤相关抗原-A3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定及其在肺癌细胞株中的表达

目的 构建重组慢病毒载体PLV-MAGE--A3-GFP,并检测其在人肺癌细胞系A549的表达情况.方法 利用DNA重组技术将MAGE-A3基因克隆到带GFP的慢病毒表达载体质粒PLV中,经限制性酶切和测序鉴定重组载体.将重组慢病毒载体PLV- MAGE- A3 -GFP与包装质粒pCMV-dR 8.91及pCMV-VSV-G共转染人胚肾上皮细胞株293TAB,包装重组慢病毒PL V-MAGE-A3-GFP,并感染人肺癌细胞株A549,用Western blot法检测MAGE-A3蛋白的表达情况.结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实,构建了重组慢病毒载体PLV-MAGE-A3-GFP,免疫荧光显微镜下观察显示慢病毒感染A549细胞后,MAGE-A3基因能够在细胞内正确地转录、翻译并稳定表达MAGE-A3基因.结论 成功构建了慢病毒载体PLV-MAGE-A3-GFP,包装的病毒能够成功感染人肺癌细胞系A549,并使MAGE-A3基因得以稳定表达,为进一步对非小细胞肺癌进行免疫治疗提供了适合的稳定转染的载体.     

靶向人 BRG1基因的慢病毒载体构建及效率验证

目的：构建靶向人 BRG1基因的短发夹 RNA（shRNA）慢病毒载体并验证其沉默效率。方法：设计3个针对人 BRG1基因的特异性 shRNA 序列（shBRG1）,构建于 pLKO．1慢病毒载体中,并与 psPAX2和 pMD2．G 质粒共同转染293T 细胞以包装成慢病毒颗粒。将包装好的慢病毒感染人主动脉平滑肌细胞（HASMC）,应用实时荧光定量 PCR 和 western blot 检测 BRG1 mRNA 和蛋白表达水平,判断其沉默效率。结果：3种 shBRG1干扰序列均成功插入慢病毒载体中且测序正确,3种慢病毒均可有效降低 BRG1 mRNA 表达水平（P 均＜0．01）。其中 shBRG1-3的沉默效率最高,其感染HASMC 后 BRG1蛋白表达水平较对照组显著下降（P ＜0．01）。结论：靶向人 BRG1基因的 shRNA 慢病毒表达载体构建成功,shBRG1-3慢病毒能够有效降低 BRG1 mRNA和蛋白表达水平。     

慢病毒重组ACE2基因表达载体的构建及其感染人脐静脉内皮细胞的研究

目的构建携带血管紧张素转换酶2（ACE2）基因的慢病毒表达载体,观察其感染人脐静脉内皮细胞后ACE2基因的转录及表达水平。方法采用PCR技术从含有ACE2基因的质粒克隆模板pc—DNA3．1-hygro（＋）一mACE2上钓取ACE2基因,并将ACE2基因重组到慢病毒载体表达质粒pGC—FU中,构建重组慢病毒载体表达质粒pGC—FU—ACE2,通过酶切、测序验证ACE2基因后,将pGC—FU—ACE2质粒和包装质粒pHelper1．0、pHelper2．0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带ACE2基因的重组慢病毒Lentiviral—ACE2;然后感染人脐静脉内皮细胞,通过RT—PCR、Western—blot检测ACE2基因的转录和蛋白表达水平。结果成功构建携带ACE2基因的慢病毒表达载体Lentiviral—ACE2,并获得大量高纯度的慢病毒浓缩液。目的基因ACE2能被重组慢病毒高效地导入人脐静脉血管内皮细胞,并能高水平表达。结论慢病毒表达载体Lentiviral—ACE2成功构建并能高效率感染人脐静脉内皮细胞,为研究ACE2对血管内皮细胞的影响和更深入地探索ACE2基因的功能奠定了基础。