靶向性重组腺病毒对裸鼠肝癌种植瘤的治疗作用

目的观察靶向性重组腺病毒Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3对原发性肝癌HepG2细胞及裸鼠皮下种植瘤的治疗作用。方法采用先前构建的靶向性重组腺病毒Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3感染肝癌HepG2细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞以及正常肝L-02细胞,观察细胞形态学改变,并通过流式细胞术检测细胞凋亡指数;采用裸鼠皮下种植瘤模型、重组腺病毒瘤内给药治疗,观察肿瘤生长情况及病理学改变。结果 流式细胞学可见HepG2细胞凋亡和明显的凋亡峰,MDA-MB-231和L-02细胞凋亡指数分别为0和7.3%,明显低于HepG2细胞(48.2%),P<0.01。种植肿瘤细胞2周后HepG2细胞组、MDA-MB-231细胞组和对照组肿瘤体积大小分别为(0.26±0.31)cm3、(0.25±0.15)cm3和(0.26±0.28)cm3,各组间差异无统计学意义(P>0.05);种植肿瘤细胞4周后HepG2细胞组、MDA-MB-231细胞组和对照组肿瘤体积大小分别为(0.53±0.12)cm3、(0.49±0.22)cm3和(0.54±0.13)cm3,各组间差异无统计学意义(P>0.05);HepG2细胞组肿瘤经重组腺病毒Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3治疗后8周时肿瘤体积为(0.65±0.13)cm3,明显小于MDA-MB-231细胞组〔(1.27±0.32)cm3〕和对照组〔(1.43±1.09)cm3〕,P<0.01,而后两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后HepG2细胞组肿瘤细胞出现坏死区,伴淋巴浸润细胞和凋亡细胞;对照组肿瘤细胞区域内未见明显坏死区;而MDA-MB-231细胞组肿瘤细胞呈实性排列,呈小腺腔样结构,异型性明显,瘤巨细胞及多核瘤细胞可见,治疗前、后未见明显变化。结论 靶向性重组腺病毒Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3具有有效靶向性凋亡诱导作用,体内、外治疗原发性肝癌有效,可能为原发性肝癌的靶向性基因治疗提供新途径。     

TRAIL真核表达质粒的构建及抑制肝癌生长的实验研究

目的构建TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因的真核表达质粒，观察其对BALB／c裸鼠肝癌细胞皮下移植瘤模型的抑瘤作用。方法提取U937细胞总RNA．用RT-PCR方法扩增出胞外区(114—281aa)，连入溶菌酶信号肽序列，构建分泌型TRAIL重组质粒；建立裸鼠7402肝癌细胞皮下移植瘤模型，纯化后的质粒DNA与脂质体聚乙烯胺混合后经肌肉注射进行基因转染，体内验证重组蛋白的抑瘤活性，采用TUNEL法进行肿瘤组织细胞凋亡检测。结果肿瘤体积测定结果显示．TRAIL对肝癌细胞生长有抑制作用；凋亡检测光镜下可见有棕褐色凋亡细胞，细胞凋亡指数增高。结论重组TRAIL质粒能引起肿瘤细胞的凋亡，抑制7402肝癌细胞的生长。     

重组型半胱天冬酶-3真核表达质粒的构建及其在胰腺癌细胞中的表达

目的：构建重组型半胱天冬酶 -3（Caspase-3）基因，观察其对胰腺癌细胞的促凋亡活性，寻求胰腺癌基因治疗新靶点。方法：聚合酶链反应（PCR）克隆野生型Caspase-3大、小亚基（LS、SS）；体外重组构建大、小亚基排序颠倒的重组型Caspase-3基因，将其克隆致质粒载体pcDNA3.1( )中，经脂质体瞬时转染入胰腺癌细胞株，逆转录（PT）-PCR检测其表达；倒置显微镜，DNA电泳，流式细胞仪（FCM）检测其凋亡诱导活性。结果：序列分析PCR证实重组型Caspase-3小亚基位于大亚基之前；转染之胰腺癌细胞PT-PCR（反转录可扩增出894bp大小片段。转染32h时见细胞减少，碎片增多，结构破坏和无序；DNA电泳见典型的云梯状条带；流式细胞学出现明显凋亡峰。结论：重组型Caspase-3可诱导胰腺细胞凋亡，可作为胰腺癌基因治疗的目的基因。     

AdKDR-CDglyTK融合基因系统治疗胰腺癌的实验研究

目的 观察腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因系统(以下简称为AdKDR-CDglyTK)对胰腺癌的治疗作用.方法 采用培养细胞移植法,将人胰腺癌细胞系Capan-2接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠人胰腺癌移植瘤模型.将20只裸鼠随机分为4组,每组5只.分组方法:Ⅰ组:注射重组腺病毒AdKDR-CDglyTK与前药5-FC与GCV;Ⅱ组:仅注射前药5-FC与GCV;Ⅲ组:仅注射重组腺病毒AdKDR-CDglyTKⅣ组:空白对照,不施加任何处理.重组腺病毒AdKDR-CDglyTK采用瘤体内多点注射,5-FC与GCV给药方法采用腹腔内注射的方法,观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理等指标;应用透射电镜观察细胞超微结构,用TUNEL法检测细胞凋亡率,比较观察各治疗组的治疗效果;并对各组的肿瘤组织行RTPCR的检测,以了解有无双自杀基因CDglyTK的表达.结果 第Ⅰ组裸鼠移植瘤的生长显著受到抑制,第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤生长情况无明显差别.第Ⅰ组肿瘤细胞凋亡指数为(34.20±4.60)%,较对照组显著增加(P=0.00).结论 AdKDR-CDglyTK联合前药5-FC及GCV对人胰腺癌Capan-2细胞具明显的抑制作用,并且诱导裸鼠体内人胰腺癌Capan-2细胞的凋亡.其可能的机制是通过下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达.     

重组型Caspase-3基因的构建及其在胰腺癌细胞中凋亡活性的观察

目的：通过对半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）大、小亚基的重组，构建pcDNA3.1( )/r-Caspase-3真核表达质粒，并探讨r-Caspase-3基因诱导细胞凋亡的可能性，以寻求肿瘤基因治疗的新途径。方法：采用分子生物学方法克隆Caspase-3的大、小亚基，并在体外进行重新排列组合，使大、小亚基原来的排序颠倒，构建出pcDNA3.1( )/r-Caspase-3真核表达质粒；脂质体瞬时转染人胰腺癌细胞PC-Ⅱ，RT-PCR检测r-Caspase-3 mRNA的表达；流式细胞技术（FCM）检测转染胰腺癌细胞凋亡状况。结果：Caspase-3的大、小亚基被完整克隆，pcDNA3.1( )/r-Caspase-3真核表达质粒测序结果证实小亚基位于大亚基之前；RT－PCR扩增出894bp大小片段，流式细胞检测可见明显的凋亡峰出现。结论：构建的r-Caspase-3其mRNA可在胰腺癌细胞中表达并自催化诱导细胞凋亡，可作为胰腺癌基因治疗的目的基因。     

氟尿嘧啶与生长抑素受体基因联合治疗鼠 胰腺癌移植瘤的研究

目的 ： 观察生长抑素二型受体(SSTR2)基因体内转染后裸鼠胰腺癌移植瘤对5-氟尿嘧啶（5-FU）的反应，并探讨其可能机制。方法 ：将人胰腺癌细胞株panc-1种植于裸鼠背部皮下形成胰腺癌移植瘤模型。成模后动物随机分成4组（每组6只）;I组为对照组;II组为腹腔注射5-FU治疗组;III组为瘤内注射pCMV-6C-SSTR2-脂质体转染SSTR2基因治疗组;IV组为基因治疗+5-FU治疗组。观察肿瘤生长速度，测量瘤体大小及重量。用免疫组织化学方法和免疫印迹技术(Westernblot)检测转染效率;用凋亡原位检测方法(Tunel)检测胰腺癌细胞的凋亡率。结果 ：体内转染后SSTR2可重新表达。5-FU和SSTR2基因联合治疗(IV)组肿瘤生长速度显著慢于单独基因治疗(III)组及单独5-FU治疗(II)组和空白对照(I)组（ P <0.01）;最终肿瘤大小，重量也显著小于其他3组（均 P <0.01），而癌细胞凋亡率显著高于其他3组（均 P <0.01）。结论 ：SSTR2重新表达后可增强胰腺癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性，联合5-FU 和SSTR2基因治疗可望成为治疗胰腺癌新的途径。     

NF-κB P65亚基siRNA增强吉西他宾诱导胰腺癌细胞凋亡作用的实验研究

目的 探讨NF-κB P65亚基siRNA(NF-κB P65 siRNA)在体内外增强吉西他宾诱导胰腺癌细胞凋亡的作用及机制.方法 培养人胰腺癌细胞株BxPC-3和PANC-1,分为空白对照组、阴性干扰序列对照组、吉西他宾组、NF-κB P65 siRNA组和联合治疗组.MTT方法检测细胞增殖情况;Western blot方法检测NF-κB P65及凋亡相关蛋白的表达水平;Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测胰腺癌细胞凋亡情况;电泳凝胶迁移实验检测NF-κB的DNA结合活性.BxPC-3接种裸鼠皮下建立胰腺癌移植瘤模型.治疗后监测肿瘤体积;TUNEL染色检测移植瘤组织细胞凋亡指数.结果 转染后72 h,与其他组相比,联合治疗组显著降低了细胞活力指数(P<0.05),下调了Bel-2和proeaspase-3的表达水平,同时上调了Bax的表达水平;流式细胞仪检测结果显示,联合治疗组细胞凋亡率高于其他组(P<0.05);EMSA实验结果证实,NF-κB P65 siRNA组和联合治疗组NF-κB的DNA结合活性低于对照组(P<0.05).联合治疗能够通过诱导凋亡而抑制裸鼠移植瘤生长(P<0.01).结论 NF-κB P65 siRNA可以通过抑制NF-κB的DNA结合活性,调控凋亡相关蛋白的表达水平,激活线粒体凋亡途径,从而增强吉西他宾对胰腺癌细胞的促凋亡作用.     

GA反义基因对裸鼠胃癌移植瘤细胞凋亡的影响

目的研究反义核酸技术封闭谷氨酰胺酶（GA）基因对裸鼠体内胃癌细胞凋亡作用的影响。方法将携带GA反义基因的质粒转染胃癌细胞SGC-7901，并将成功转染的胃癌细胞接种于裸鼠皮下，获得裸鼠胃癌移植瘤模型，通过TUNEL技术检测胃癌细胞凋亡的凋亡指数；RT-PCR技术检测移植瘤细胞内GAmRNA的含量。结果GA反义基因质粒载体成功转染胃癌细胞后，肿瘤生长速度减慢，癌细胞凋亡增加，肿瘤细胞内GAmRNA的含量减少。结论GA反义基因可抑制GA基因的表达，明显促进胃癌细胞凋亡。     

腺病毒介导反义c-myc基因抑制人肝癌细胞生长的研究

目的观察重组腺病毒介导反义c-myc基因(Ad-ASmyc)对体外培养人肝癌细胞的生长抑制作用和裸鼠体内移植肝肿瘤的治疗效果.方法Ad-ASmyc感染人肝癌细胞系后,观察细胞生长形态变化,通过细胞生长曲线、流式细胞仪分析、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹法(Western blot)分析Ad-ASmyc对人肝癌细胞系SMMC-7721和HCC-9204细胞生长、c-myc和bcl-2基因表达的影响;裸鼠皮下移植瘤内注射3种不同剂量Ad-ASmyc(1×109pfu-A组,1×108pfu-B组,1×107pfu-C组)抑制裸鼠肿瘤生长的差异.结果Ad-ASmyc可高效转导人肝癌细胞系SMMC-7721和HCC-9204,抑制细胞生长(抑制率分别为48.72%和56.88%),诱导肝癌细胞G1期阻滞和凋亡,c-myc、bcl-2 RNA及c-myc蛋白水平下降;瘤内注射3种不同剂量Ad-ASmyc均可明显抑制裸鼠皮下移植肿瘤生长,抑制率分别为47.1%、77.3%和82.6%(与对照组比较,P＜0.01).结论重组腺病毒介导的反义c-myc基因能够引起人肝癌细胞c-myc、bcl-2 RNA及c-myc蛋白表达下调和细胞生长抑制,瘤内注射Ad-ASmyc治疗裸鼠皮下移植肝癌有效.     

重组腺病毒载体介导人OSM 基因对胰腺癌细胞增殖的抑制作用及对裸鼠致瘤性的影响

目的　构建了含人抑瘤素M (humanoncostatinM ,hosm)基因的复制缺陷型重组腺病毒载体 ,观察其对胰腺癌细胞株BxPC3 在体外生长抑制情况及在裸鼠致瘤性改变的作用 ,为胰腺癌的基因治疗提供参考。方法　用含hosm基因的缺陷型腺病毒载体转染人胰腺癌细胞株 ,用RT PCR法检测外源hosm基因在其中的表达 ;苔盘蓝染色、细胞计数法检测ad hosm对BxPC3 的体外增殖抑制情况 ;裸鼠皮下接种转染ad hosm的BxPC3 ,观察其对肿瘤形成率的影响。结果　hosm基因在转染细胞能有效的表达。体外试验示ad hosm能明显抑制BxPC3 的生长 ,ad hosm能抑制BxPC3 在裸鼠中的成瘤作用。结论　重组腺病毒介导hosm基因表达能有效抑制BxPC3 在体外、体内的增殖 ,提示重组腺病毒介导的hosm基因治疗可能成为胰腺癌治疗的侯选方案。     

脆性组氨酸三联体基因FHIT对乳腺癌细胞株MCF-7的作用

目的 克隆人类脆性组氨酸三联体基因(FHIT)并构建其真核表达载体pcDNA3.1(+)/FHIT,将人FHIT基因转染人乳腺细胞MCF-7中稳定表达,检测转染后细胞生物学特性的变化.方法 构建FHIT基因表达载体pcDNA3.1(+)/FHIT,用脂质体法将FHIT基因的真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)/FHIT导入人乳腺癌细胞MCF-7中,细胞计数、流式细胞术分析转染后细胞的生物学特性变化.结果 将逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增后的产物克隆到表达载体peDNA 3.1(+)上,经PCR扩增筛选鉴定和测序鉴定证实为所需序列,转染乳腺癌MCF-7细胞后,FHIT基因的表达明显增强,细胞周期分析发现MCF-7/FHIT与MCF-7比较S期及G2/M期的细胞减少,G0/G1期的细胞增加,MCF-7/FHIT细胞的凋亡率为(29.75±5.90)%,MCF-7细胞的凋亡率为(11.21±6.10)%,和MCF-7比较,转染后的MCF-7/FHIT细胞的凋亡明显增加,MCF-7细胞的增殖明显抑制.结论 FHIT基因表达载体可有效抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖.     

转染TSLC1基因肝癌细胞株BEL-7402生物学特性的研究

目的 将人TSLCl基因转染人肝癌细胞BEL-7402中稳定表达,检测转染后细胞生物学特性的变化.方法 用脂质体法将TSLCl基因的真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)/TSLCl导人人肝癌细胞株BEL-7402中,G418筛选克隆,再以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、Western blot的方法检测TSLCI的表达,细胞计数、流式细胞术及裸鼠负荷瘤实验分析转染后细胞的生物学特性变化.结果 TSLCl在BEL-7402细胞中的表达可抑制BEL-7402细胞的生长,BEL-7402-TSLCI与BEL-7402比较s期及G2/M期的细胞减少,G0/G1期的细胞增加.转染后的BEL-7402-TSLCl细胞的凋亡明显增加,转染后荷瘤裸小鼠肿瘤的生长受到抑制.结论 TSLCl基因的转染可以抑制BEL-7402细胞的增殖、诱导肝癌细胞的凋亡,为肝癌的基因治疗提供理论依据.     

转染人高迁移率族蛋白1反义基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨反义高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法　应用分子克隆技术构建反义HMGB1基因真核表达载体pcDNA3 1/anti HMGB1,用脂质体法将其导入人胰腺癌细胞PANC 1中,经G4 18筛选获得可稳定表达反义HMGB1的人胰腺癌细胞克隆,通过逆转录聚合酶链反应、免疫印迹法和噻唑蓝比色法检测转染4 8h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期情况。结果　获得了pcDNA3 1/anti HMGB1真核表达质粒,pcDNA3 1/anti HMGB1转染可使PANC 1细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低(P <0 .0 1)、肿瘤细胞增殖能力明显受到抑制(P <0. 0 1) ,并出现细胞周期G1期阻滞、凋亡细胞百分数增加。结论　反义HMGB1基因的表达能有效抑制胰腺癌细胞的体外增殖并促进细胞凋亡。     

pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因靶向性治疗人原发性肝癌的实验研究

目的研究pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因对人肝癌细胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤模型的靶向性治疗作用。方法建立人原发性肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分成肿瘤对照组、空质粒组、丙氧鸟苷（GCV）组、pcDNA3/TK/Angio组及pcDNA3/AFP/TK/Angio组5组。于瘤体内分别直接注射不同的质粒,同时于裸鼠腹腔内注射GCV,观察不同时段皮下肿瘤的生长情况并做病理学检查,免疫组化法检测肿瘤微血管密度（MVD）以及血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达量,原位末端标记（TUNEL）法检测细胞原位凋亡。放免法检测裸鼠血清甲胎蛋白（AFP）的变化,透射电镜观察肿瘤细胞超微结构的变化。结果裸鼠皮下成瘤率100%;pcDNA3/TK/Angio组及pcDNA3/AFP/TK/Angio组的肿瘤体积、血清AFP含量、肿瘤MVD和VEGF表达强度均明显低于对照组、空质粒组和GCV组（P〈0.05）,细胞凋亡指数都明显高于后3组（P〈0.05）,可见较多的凋亡细胞。而pcDNA3/AFP/TK/Angio组的肿瘤体积、AFP、MVD及VEGF表达强度又明显低于pcDNA3/TK/An-gio组（P〈0.05）,凋亡指数高于后者（P〈0.05）。结论pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因系统可显著抑制肿瘤的生长,有望成为治疗原发性肝癌的新型生物制剂之一。     

Dapper1在胃癌组织中的表达及其对survivin介导的细胞凋亡的调控

目的 研究Dapper1(Dpr1)在胃癌组织中的表达及其对survivin介导的细胞凋亡的调控.方法 用RT-PCR方法检测30例患者胃癌及癌旁正常组织中Dpr1 mRNA的表达情况;用RT-PCR检测SGC7901细胞转染pcDNA3.1-Dpr1质粒前后Dpr1和survivin mRNA表达的变化;用Western blot检测转染前后Dvl-2、β-catenin及survivin蛋白表达的变化;用流式细胞术检测转染后SGC7901细胞凋亡率的变化. 结果本组30例胃癌组织中17例Dapperl mRNA表达下调,发生率为57%,且与胃癌的浸润深度和分化程度相关(P＜0.05);转染pcDNA3.1-Dpr1后SGC7901细胞中Dpr1 mRNA表达水平上调,survivin mRNA表达水平下调;Dvl-2、β-catenin以及Survivin蛋白表达量降低;转染pcDNA3.1-Dpr1质粒后SGC7901细胞的凋亡率升高. 结论 Dpr1能够通过经典WNT通路抑制凋亡相关蛋白survivin的表达,在胃癌细胞的凋亡中发挥重要作用.     

反义K-ras基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨反义K-ras癌基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡及Fas/FasL、Bcl-2、Bax表达的影响.方法 将重组逆转录病毒载体pLXSN转染包装细胞PT-67,获得重组逆转录病毒.在细胞和动物水平将该重组逆转录病毒分别感染PC-3和BxPC-3胰腺癌细胞,经G418筛选获得稳定细胞系,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增殖、凋亡及其相关基因表达情况.结果 成功制备含反义K-ras基因的重组逆转录病毒.感染含反义K-ras基因重组病毒后,胰腺癌PC-3细胞和移植瘤(有K-ras基因第12密码子点突变GGT→GTT)增殖受到抑制,G<,0/1>期细胞增加而S期细胞明显减少,细胞凋亡增加.免疫组化显示含反义K-ras癌基因逆转录病毒感染后PC-3细胞Bax/Bcl-2比值升高,Fas表达上调.结论 反义K-ras基因可使胰腺癌细胞及移植瘤增殖受到抑制,并可通过上调Bax/Bcl一2比值和(或)促进Fas表达诱导细胞凋亡.     

金属硫蛋白1E对胰腺癌SW1990细胞生长的影响

目的 观察外源性人金属硫蛋白1E(MT1E)基因对胰腺癌SW1990细胞生长的影响.方法 构建MT1E基因真核表达载体,转染SW1990细胞并获得阳性单克隆细胞.用Westernblot技术检测转染前后MT1E蛋白表达,噻唑蓝(MTT)实验检测其增殖能力的变化,流式细胞仪分析细胞周期时相分布.同时检测Cyclin D1与p53的表达.结果 MT1E融合蛋白在SW1990MT1E细胞中表达.MTT结果表明,与SW1990和SW1990MT1E空细胞比较,SW1990MT1E细胞增殖速度明显增快.SW1990MT1E细胞与SW1990和SW1990空细胞比较,G0/G1期细胞明显减少,S期明显增多,差异有统计学意义.SW1990MT1E较SW1990空的细胞Cyclin D1与p53表达明显升高.结论 MT1E能够促进SW1990增殖,可能和上调Cyclin D1促使细胞进入S期增多,通过失活p53蛋白使细胞恶性变.     

鼠源性血管抑素对裸鼠种植性肿瘤的抑制作用

目的　探讨鼠源性血管抑素转染入人肝癌细胞SMMC 772 1后对裸鼠种植性肿瘤的影响。　方法　建立鼠源性血管抑素基因的人肝癌SMMC 772 1细胞株 ,实验动物分 3组 :空白对照组种植SMMC 772 1细胞 ,空载体组种植SMMC 772 1/pcDNA3 1(+)细胞 ,血管抑素组种植SMMC 772 1/pcDNA3 1 mAST细胞。比较各组裸鼠肿瘤体积、重量和肿瘤微血管密度 (MVD)。　结果　在肿瘤细胞种植 35d时裸鼠肿瘤体积 :空白对照组 (35 38 1± 6 43 3)mm3 ,空载体组 (312 8 5± 5 46 6 )mm3 ,血管抑素组 (75 5 8± 198 2 )mm3 ;肿瘤重量 :空白对照组 (6 0± 0 7)g,空载体组 (5 9± 0 5 )g ,血管抑素组(2 1± 0 5 )g;肿瘤MVD :空白对照组 5 2 2± 6 6 ,空载体组 49 4± 7 0 ,血管抑素组 2 5 5± 4 1。血管抑素组裸鼠肿瘤体积、重量和MVD显著小于空白对照组和空载体组 (P均 <0 0 1) ,肿瘤的抑制率达78 6 %。　结论　转染血管抑素基因的人肝癌细胞SMMC 772 1在裸鼠体内的致瘤力明显降低 ,肿瘤的体积、重量和微血管密度显著低于对照组 ,表明血管抑素可通过抑制肿瘤血管生成而显著抑制肿瘤生长     

重组质粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP的构建及在HepG2细胞的表达

目的 构建热休克蛋白70(HSP70)启动子调控内皮抑素(Endo)基因的重组质粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP,观察其在HepG2细胞中的表达规律.方法 用聚合酶链反应(PCR)法体外扩增HSP70启动子(350 bp);用EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切法切取质粒pSP-Endo/EGFP中Endo/EGFP,克隆到pcDNA 3.1(+)中获得重组质粒pcDNA 3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP.脂质体介导转染HepG2细胞,转染24 h后予以37、39、41、43、45℃加热诱导30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测EGFP的表达,逆转录(RT)-PCR法检测细胞内Endo mRNA的表达;ELISA法检测转染细胞上清中Endo蛋白浓度.结果 合成HSP70启动子序列测序结果与Gene Bank中AL671762所提供序列完全一致.低温加热可增强HepG2细胞中Endo/EGFP表达,43℃组EGFP表达强度达37℃组的3.3倍.43℃组Endo mRNA表达水平高于不加热组.43℃组上清Endo蛋白浓度为(177±28)μg/L,高于不加热组(43±11)μg/L.结论 成功构建HSP70启动子调控Endo基因的重组质粒,低温加热可增强HepG2细胞中Endo基因的表达.     

MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株SMMC7721的作用

目的 观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从肝癌组织中制备出含NheI和KpnI酶切位点的MAGE-A3目的 基因,克隆到pcDNA3.1(-)真核表达载体,并通过酶切鉴定、测序验证.经脂质体法正义瞬时转染肝癌细胞株SMMC7721,通过RT-PCR、Western blot分别检测MAGE-A3 mRNA和蛋白表达产量.以噻唑蓝(MTT)比色法、Boy-den小室实验观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞增殖及侵袭的影响.结果成功扩增出目的 基因;得到重组质粒pcDNA3.1-MAGE-A3,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western blot检测显示,MAGE-A3基因mRNA及蛋白产物的表达水平明显高于未转染组和空载体组(3组MAGE-A3 mRNA量分别为7838、2847、1557,蛋白量分别为30938、24 088、29 654);转染组细胞数量增多,穿透Matrigel膜的细胞数显著增加,与未转染组和空载体组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-MAGE-A3真核表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721后可促进细胞增殖和侵袭能力,提示MAGE-A3基因在肝癌复发和转移中起到重要作用.