HSV-2型糖蛋白G基因免疫优势表位片段的克隆和表达

目的:通过基因工程技术,克隆和表达单纯疱疹病毒2型糖蛋白G(HSV-2 gG)基因的免疫优势表位片段。方法:用PCR技术扩增HSV-2 gG基因的免疫优势表位片段;将PCR产物与质粒表达载体pGEX-4T-1连接;然后鉴定含有目的基因的重组表达载体;并转化大肠杆菌DH5α,诱导表达目的蛋白;以免疫印迹法检测表达的目的蛋白。结果:PCR法扩增出1 242 bp的DNA片段;通过PCR法及测序法证实重组质粒中含有1 242 bp的DNA片段,其中99.5%序列与目的基因序列一致。SDS-PAGE和免疫印迹法证实重组蛋白在大肠杆菌中的表达。结论:HSV-2 gG基因的免疫优势表位片段的成功表达,为制备HSV-2血清诊断试剂奠定了基础。     

信号肽序列修饰的单纯疱疹病毒-2多表位复合DNA疫苗构建

目的:构建经糖蛋白gD信号肽修饰的单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白gD、gB、gC和早期表达蛋白ICP 27的多表位复合DNA疫苗.方法:国内HSV-2野生株经测序与PCR鉴定后利用PCR技术从其基因组中扩增出HSV-2 ICP27 377-459、gD146-179、gD223-306、gB529-606、gC247-282、gD1-77 6个基因片段,PCR鉴定后按先后顺序,采用多基因片段一步酶切连接法获得HV融合基因片段,经pGEMT载体克隆后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1载体中,构建出重组真核表达质粒HV-pcDNA3.1,并对其进行酶切分析及测序鉴定.PCR扩增gD146-179信号肽片段,进一步酶切连接构建重组质粒gDs-HV-his-pcDNA3.1,并对其进行测序鉴定.结果:酶切重组质粒HV-pcDNA3.1,电泳可见两条带,分别为融合基因HV(1.3 kb)和线性质粒pcDNA3.1(5.4 kb).测序结果表明,克隆基因插入方向正确,重组质粒gDs-HV-his-pcDNA3.1与GenBank HSV-2中相关序列同源性达99.9%.结论:成功构建了经糖蛋白gD信号肽修饰的HSV-2多表位复合DNA疫苗.     

单纯疱疹病毒2型感染和淋巴细胞作用的进展

单纯疱疹病毒2型感染主要引起生殖器疱疹。感染后宿主对其产生的免疫应答的机制尚不清楚。近年来单纯疱疹病毒2型与宿主淋巴细胞作用的研究有了一定的进展。综述了单纯疱疹病毒2型感染和B细胞、T细胞及天然杀伤细胞的关系;同时还对单纯疱疹病毒2型感染中淋巴细胞间的相互作用及淋巴细胞与其他细胞间的相互作用进行了综述。     

阴茎硬化性淋巴管炎与单纯疱疹病毒Ⅱ型感染关系的探讨

阴茎硬化性淋巴管炎的发病原因尚未完全清楚,近年来多位作者提出本病致病原因似与病毒感染有关.笔者在临床工作中发现本病患者常有生殖器疱疹病史.为了探讨单纯疱疹病毒(HSV)-Ⅱ型感染与阴茎硬化性淋巴管炎发病的关系,笔者对25例阴茎硬化性淋巴管炎患者进行了HSV-Ⅱ抗体测定,现报告如下.     

生殖器部位皮损的单纯疱疹病毒检测及分型

目的 探讨生殖器疱疹部位皮损的不典型表现及其与单纯疱疹病毒型别的关系。方法 对外生殖器部位及其周围有硬结或疖肿、裂隙、毛囊炎等非水疱性皮肤黏膜损害的患者进行临床资料采集和分析,并对皮损标本进行单纯疱疹病毒的分离培养、PCR检测和病毒分型。结果 105例有外生殖器部位非水疱性皮损的患者入选本研究,在硬结(或疖肿)、裂隙、毛囊炎、类似擦破、单个溃疡、非特异性红斑和红肿渗液性包皮龟头炎皮损中,PCR检测HSV的阳性率分别33.3%(6/18)、20%(3/15)、37.5%(6/16)、28.6%(2/7)、33.3%(4/12)、20%(5/25)和50%(6/12),总的检出阳性率为30.5%(32/105)。分离培养法检测HSV的阳性率分别为22.2%(4/18)、13.3%(2/15)、25%(4/16)、14.3%(1/7)、33.3%(4/12)、8%(2/25)和41.7%(5/12),总的检出阳性率为21%(22/105)。两种方法检测HSV的总检出率差异无统计学意义(κ=0.095,P=0.114)。HSV-PCR分型结果与荧光单克隆抗体分型结果相符。在所有HSV阳性者中,HSV-1感染占9.4%(3/32),HSV-2感染占90.6%(29/32)。结论 生殖器HSV感染的皮肤黏膜损害多样,可为外生殖器部位的硬结(疖肿)、裂隙、毛囊炎、类似擦破、单个溃疡、非特异性红斑和红肿渗液性包皮龟头炎等不典型表现,而且主要由HSV-2感染引起。     

单纯疱疹病毒2型抗原DNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达重组单纯疱疹病毒2型(HSV-2)抗原。方法：用PCR方法从单纯疱疹病毒中扩增HSV-2DNA片段，约500bp，克隆到pMD18T载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRI和BamHI消化pMD18T／HSV-2重组质粒，分离HSV-2片段，并插入质粒表达载体pBV220的相应限制酶位点，酶谱分析鉴定重组表达载体pBV220／HSV-2。转化菌株经42℃诱导，用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白。结果：PCR扩增的DNA片段与HSV-2的目的片段大小一致。重组质粒pMD18T／HSV-2的DNA序列分析显示克隆的DNA序列与文献报道的HSV-2 DNA序列一致。SDS—PAGE表明重组蛋白相对分子量为18000，表达量达菌体总蛋白的20％左右，Western blot分析显示重组蛋白能特异地与抗HSV-2抗体结合。结论：已成功构建了表达具有功能的重组HSV-2抗原的工程菌株。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型PCR检测引物设计及其价值探讨

生殖器疱疹(GH)大多是由单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染所致.主要通过性接触传播.其发病率迅速上升,成为人们关注的公共卫生问题[1].现今生殖器疱疹不典型表现和无症状感染相当多见[2].建立一种快速、简便、特异的检测HSV-2的方法很有必要.糖蛋白D(gD)为HSV-2最主要的激活机体免疫的抗原,本试验针对HSV-2糖蛋白D基因序列设计引物并扩增的片断,均符合进一步克隆重组载体表达的要求,所以为研究HSV-2基因疫苗提供了有利的条件.现将结果总结如下.     

单纯疱疹病毒2型感染血清流行病学研究进展

单纯疱疹病毒 2型的发病率近年来不断上升 ,其与人类免疫缺陷病毒 1型的感染有协同作用。单纯疱疹病毒 2型引起的新生儿疱疹发病率也在上升。就单纯疱疹病毒 2型的感染特点 ,流行病学状况以及单纯疱疹病毒 2型血清型特异性诊断方法作一综述。     

140例疑似生殖器疱疹患者单纯疱疹病毒Ⅱ型抗原和抗体检测结果分析

目的：探讨单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）抗原和抗体检测对生殖器疱疹的诊断意义。方法：对性病门诊140例有新发水疱的现症生殖器疱疹（GH）病人用ELISA方法进行单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）抗原和抗体检测，了解现症GH病人HSV-2抗原和抗体之间的关系。结果：对于有新发水疱的现症GH病人HSV-2抗原检测阳性率为89．3％，而HSV-2IgG阳性率为66．4％，HSV-2IgM阳性率为14．5％。对初发病人：HSV-2抗原阳性率为89．7％（70／78）；HSV-2IgG阳性率为39．7％（31／78）；HSV-2IgM阳性率为25．6％（20／78）。对复发病人：HSV-2抗原阳性率为88．7％（55／62）；HSV-2IgG阳性率为100％（62／62）；HSV-2IgM阳性检出率为0。结论：对于有新发水疱的现症GH病人HSV-2抗原检测阳性检出率较高。而HSV-2IgM抗体作为诊断指标仍有待进一步探讨。     

不同人群单纯疱疹病毒2型IgG抗体的检测情况分析

目的:了解珠海市一般人群、无症状可疑生殖器疱疹患者及有症状可疑生殖器疱疹患者血清单纯疱疹病毒2型(HSV-2)IgG抗体感染水平。方法:应用酶标仪对一般人群、无症状可疑患者、有症状可疑患者三组人群进行HSV-2IgG抗体检测,分析三组人群HSV-2的感染率,并比较无症状与有症状可疑生殖器疱疹患者血清学的状况。结果:在96名一般人员中HSV-2IgG抗体阳性率13.54%,175例无症状可疑患者HSV-2IgG抗体阳性率57.1%,174例有症状可疑患者HSV-2IgG抗体阳性率72.41%。结论:HSV-2IgG抗体对无症状可疑患者和中、后期及复发有症状患者具有协助诊断的意义。     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因腺病毒载体,并在真核细胞表达。方法用PCR法,扩增出HPV11E7基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体形成重组质粒TOPO-E7。TOPO-E7与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DESTTM重组反应,E7基因被重组到腺病毒载体上。该载体经PacI酶切,脂质体法转染人胚肾293A细胞,获得重组腺病毒载体pAD-E7。pAD-E7转染人HaCaT细胞,激光共聚焦显微镜分析E7蛋白表达情况。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒TOPO-E7成功构建。重组子pAD-E7转染293A细胞后,获得滴度为1.4×107pfu/mL的重组腺病毒载体。该载体转染HaCaT细胞,48h后激光共聚焦显微镜下可见细胞内E7蛋白表达。结论重组腺病毒载体能有效介导HPV11E7基因在真核细胞的表达。     

单纯疱疹病毒2型DNA疫苗对豚鼠抗病毒感染的研究

目的 探讨单纯疱疹病毒2型DNA疫苗的抗病毒感染效应.方法 重组DNA疫苗pcgD免疫雌性豚鼠,采用血清中和实验检测抗体,单纯疱疹病毒2型(HSV-2)sav株接种豚鼠,观察DNA疫苗保护动物抵抗HSV-2病毒感染的能力.结果 pc-gD免疫豚鼠产生的中和抗体效价远远高于对照组和生理盐水组,感染病毒后,表现出初发感染推迟,复发感染的严重程度下降.结论 DNA疫苗能有效地保护动物免受HSV-2病毒的攻击,延缓初发感染,减少复发感染.     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E真核表达载体的构建及表达

目的　构建水痘 带状疱疹病毒 (VZV )糖蛋白E的真核表达载体并使其在COS7细胞中表达。方法　用PCR方法扩增VZV糖蛋白E基因 ,并将其克隆到真核表达载体 pcDNA 3 .1。用脂质体转染试剂将重组载体转入COS7细胞 ,通过免疫组化法检测转染细胞瞬时表达的重组蛋白。结果　扩增的目的基因包括了全段糖蛋白E基因 ,长度约1.9kb。重组表达载体在COS7细胞中表达出了糖蛋白E。结论　VZV糖蛋白E真核表达载体的成功构建及在COS7细胞中重组蛋白的表达 ,为研究此蛋白的免疫原性和VZV核酸疫苗打下了基础。     

单纯疱疹病毒2型临床分离株体外对阿昔洛韦和伐昔洛韦的敏感性测定

目的 测定南京地区收集的15株单纯疱疹病毒2型(HSV-2)对阿昔洛韦和伐昔洛韦的敏感性,初步建立空斑法提取阿昔洛韦耐药株.方法 Vero细胞培养法分离扩增出临床毒株,直接免疫荧光法分型,并用MTT法测定15株2型毒株对阿昔洛韦、伐昔洛韦的敏感性.体外阿昔洛韦诱导,空斑纯化HSV耐药株.结果 15株临床株对阿昔洛韦和伐昔洛韦的半数病毒抑制质量浓度(IC₅₀)分别为0.0215～0.2799μg/mL(平均0.0766μg/mL),0.0549～0.4575μg/mL(平均0.1605μg/mL).生殖器疱疹初发组与复发组、用药组与未用药组对2种药物的敏感性采用Wilcoxon秩和检验,P值均>0.05,差异无统计学意义.从15株HSV-2临床株中未提取到耐药空斑;从HSV-1 Sam实验室标准株提取到一个耐药空斑,MTT法测定阿昔洛韦IC₅₀为13.36μg/mL;从HSV-2 333标准株中提取到9个耐药空斑,扩增后MTT法测定其对阿昔洛韦的IC₅₀为1.04～5.08 μg/mL.结论 目前在南京地区收集的HSV-2型毒株对阿昔洛韦和伐昔洛韦敏感性较高,尚未发现耐药株.体外药物诱导、空斑纯化能较快提取到HSV耐药株.     

聚合酶链反应诱导HPV16E7C端基因突变和突变蛋白在真核细胞表达

目的 聚合酶链反应(PCR)诱导人乳头瘤病毒(HPV16)早期基因E7C端锌指结合基序基因突变,评价突变对抗原稳定性的影响。方法 采用PCR技术对HPV16E7第58、91位氨基酸进行突变,构建野生型(pcDNA3.1/16E7)和突变型(pcDNA3.1/16ME7)重组体,对其蛋白表达进行比较。结果 HPV16E7C端第58、91位氨基酸突变后真核细胞表达成功,免疫荧光检测在质粒转染COS-7细胞24h后两种重组体均有阳性细胞出现,但在48h时突变型重组体阳性细胞消失。免疫印迹技术在24h和48h时,突变型重组体均未见阳性条带。结论 HPV16E7C端锌指结构对维持蛋白稳定性起重要作用,突变后蛋白稳定性下降。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在C57BL/6小鼠淋巴细胞中的表达

目的 通过复制缺陷型腺病毒载体的介导,将金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染入C57BL/6小鼠淋巴细胞中,观察基因表达产物对B16细胞的作用。方法 通过MTT法直接测定重组腺病毒颗粒感染的淋巴细胞的增殖情况,采用双抗体夹心ABC-ELISA法,测定淋巴细胞培养上清液中白介素2的水平。MTT法测定活细胞数目,以了解活化的C57BL/6小鼠淋巴细胞对B16细胞的杀伤效应。结果 加入不同滴度的重组腺病毒颗粒后,C57BL/6小鼠淋巴细胞明显增殖;同时淋巴细胞培养上清液中白介素2水平也明显增加。重组腺病毒颗粒转染的C57BL/6小鼠淋巴细胞可明显杀伤B16细胞,效/靶比越高,杀伤效应越明显。结论 SEA基因可以在C57BL/6小鼠淋巴细胞中表达,并且表达产物能够活化C57BL/6小鼠淋巴细胞,进而杀伤B16细胞。     

HIV—2gag蛋白在大肠杆菌中的表达纯化

目的 在原核系统中高效表达及纯化人Ⅱ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－２）ｇａｇ蛋白,以期作为检测试剂的原料。方法 采用基因工程手段将编码Ⅱ型人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－２）核心蛋白的部分ｐ５５ｇａｇ１（Ｇ１）及全部ｐ５５ｇａｇ２（Ｇ２）基因片段分别克隆到原核高效表达载体ｐＥＴ２８ａ的Ｔ７噬菌体启动子下游,构建出重组表达质粒ｐＥＴ２８ａＧ１和ｐＥＴ２８ａＧ２,将其转入不同的受体菌后,ＩＰＴＧ诱导下进行表达。经Ｓ     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因的克隆和表达

目的 从尖锐湿疣皮损标本中扩增出人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因．并进行表达、纯化和鉴定。方法用PCR法，从尖锐湿疣标本中扩增出HPV11E7蛋白基因，与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1／E7；重组质粒转入BL21大肠杆菌，经诱导表达融合蛋白GST-E7；该蛋白经剪刀酶切除GST，Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测鉴定。结果经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-6P-1／E7成功构建．诱导后高表达GST-E7融合蛋白并得到纯化，蛋白质印迹证实表达蛋白为E7蛋白。结论获得高表达、高纯度的HPV11 E7蛋白，为该蛋白的功能及免疫学分析及尖锐湿疣疫苗研究打下了基础。