嗅鞘细胞条件培养液对骨髓基质干细胞的诱导分化作用研究

[目的]探讨大鼠嗅神经鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞的诱导分化作用。[方法]通过差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞，在接种培养后的9～12d，收集并制备嗅鞘细胞条件培养液，与纯化培养第3代的骨髓基质干细胞共培养，观察其诱导分化后的形态学变化，免疫荧光染色鉴定诱导分化结果。[结果]发现大鼠嗅鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞有明显的诱导分化作用，在72h时荧光显微镜下观察并计算MAP-2和GFAP阳性细胞的比率分别为55％、23％。[结论]大鼠嗅鞘细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠骨髓基质干细胞向神经样细胞分化的作用。     

骨髓间充质干细胞与嗅鞘细胞联合移植治疗脊髓损伤的早期观察

[目的]探讨自体骨髓间充质细胞和异体嗅鞘细胞共培养及其联合移植修复脊髓损伤的可行性,为临床治疗提供一种新方法。[方法]无菌条件下采集自体骨髓间充质细胞和胎龄4～6个月的引产胎儿的嗅鞘细胞,分别培养至传代后再共培养,将共培养的混合细胞通过手术直视下移植至脊髓损伤部位。[结果]8例脊髓损伤患者接受自体骨髓间充质细胞和异体嗅鞘细胞联合移植,并获得1～6个月的随访,所有接受细胞移植的8例患者术后均无不良反应,其中1例术后1个月开始出现双下肢深浅感觉恢复,其余7例比细胞移植前无明显改善。[结论]自体骨髓间充质细胞和异体嗅鞘细胞共培养两者之间无相互抑制现象,近期观察二者联合移植修复脊髓损伤是安全的。     

大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脊髓神经干细胞分化的研究

[目的]观察大鼠嗅神经鞘细胞上清液对脊髓神经干细胞共培养发生的诱导分化作用。[方法]采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞，分时段Mr丌法检测细胞活性，选取最佳状态细胞无血清培养后取上清液，与3代纯化后的神经干细胞共培养，观察分化过程，免疫荧光法鉴定诱导结果。[结果]MTT法分6个时段检测纯化后的嗅鞘细胞，发现9d及12d细胞活性最高。使用无血清嗅鞘细胞上清液与脊髓神经干细胞共培养发现诱导作用明显，向神经元样细胞及胶质细胞分化的比例分别达到53％和42％。[结论]嗅鞘细胞在体外培养的不同时间段活性不同，无血清的嗅鞘细胞上清有明显诱导神经干细胞向成熟神经元分化的作用。     

嗅鞘细胞和骨髓基质干细胞联合培养修复大鼠脊髓损伤

目的 探讨嗅鞘细胞(OECs)和骨髓基质干细胞(BMSCs)联合移植修复脊髓损伤的疗效.方法 采用改良Allen法,制备大鼠脊髓损伤模型,随机分成5组:手术对照组、正常对照组、单细胞移植组(OECs或BMSCs)和联合移植组.将联合培养的OECs和BMSCs移植到脊髓完全损伤的大鼠体内.评定功能恢复状况,采用荧光技术对标记后的脊髓进行示踪.结果 OECs和BMSCs移植后均可在体内存活.移植4周后与手术对照组(0.88±0.23)比较,OECs组(2.67±0.24)和BMSCs组(2.66±0.14)的大鼠脊髓功能均有改善,联合移植组(3.12±0.52)功能改善最佳(P＜0.01).结论 OECs与BMSCs在体外可联合培养,OECs的培养液对BMSCs具有向神经元分化的趋化作用,并且两者在移植后均可存活,联合移植较单细胞移植的修复作用更佳.     

人胚嗅球嗅鞘细胞及人胚鼻粘膜嗅鞘细胞的分离培养与纯化

[目的]采用差速贴壁法及免疫组化对人胚嗅粘膜OECs及人胚嗅球OECs进行体外纯化培养,探讨建立嗅粘膜OECs及嗅球OECs体外培养的方法.[方法]对差速贴壁后的人胚嗅粘膜OECs及嗅球OECs分别交替应用含13％胎牛血清DMEM - F12培养基进行原代培养.观察嗅鞘细胞的形态学变化,采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.[结果]人胚嗅粘膜及人胚嗅球均可培养出嗅鞘细胞,嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养时人胚嗅球嗅鞘细胞纯度比人胚嗅粘膜嗅鞘细胞高.[结论]差速贴壁法可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞及人胚嗅球嗅鞘细胞.     

经嗅鞘细胞条件培养液诱导的骨髓基质干细胞移植对脊髓损伤修复的影响

[目的]研究经嗅鞘细胞条件培养液诱导的骨髓基质干细胞(BMSCs)移植对脊髓损伤的治疗作用。[方法]采用脊髓挤压损伤方法,制造SD大鼠脊髓损伤动物模型(共24只),随机分成A、B、C三组(每组8只),立即分别将DMEM、BMSCs和经诱导的BMSCs移植入脊髓损伤部位,分别于移植4、8周后处死动物,均采用HE染色观察脊髓损伤处空洞面积改变情况;并采用抗神经丝(NF)抗体、生长相关蛋白-43(GAP-43)抗体和神经元特异性核蛋白(Neu N)抗体免疫组织化学荧光染色,观察移植的BMSCs存活和分化情况及损伤部位神经纤维再生情况。[结果]移植4、8周后,脊髓损伤区空洞为移植细胞充填,空洞面积明显减少,差异有统计学意义(P0.01),BBB评分结果 C组和A、B组之间存在统计学差异(P0.05)。B、C组均可见再生神经纤维形成,同时部分移植细胞呈Neu N染色阳性,在C组上述改变更加显著。[结论]经嗅鞘细胞条件培养液诱导的BMSCs可以在脊髓损伤区存活,能够显著减小脊髓损伤处空洞面积,并可以促进脊髓损伤区神经纤维的修复再生,促进大鼠双下肢运动功能的恢复。     

人嗅鞘细胞的免疫学特性研究

目的 探讨人嗅鞘细胞的免疫学特征。方法 应用流式细胞仪分析人嗅鞘细胞的相应标记抗原的阳性表达率，用单向混合淋巴细胞反应测定人嗅鞘细胞的组织相容性和免疫耐受性。并与骨髓间充质干细胞对比。结果 人嗅鞘细胞与骨髓间充质干细胞表面与移植免疫排斥发生密切相关的标志：HLA-DR、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、CD40和CD40L均为阴性。单向混合淋巴细胞反应显示人嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞均对混合淋巴细胞反应无明显的刺激作用。结论 人嗅鞘细胞可能是一种免疫缺陷细胞，在体外有诱导细胞移植免疫耐受性的作用。     

非接触性共培养BMSCs和髓核细胞时间差异性的实验研究

目的探讨在非接触性共培养环境下,BMSCs定向分化为类髓核细胞在共培养时间上的差异性,寻找适合体内移植的最佳时间。方法取6只8周龄健康新西兰大白兔(体重1.5～2.0 kg)骨髓及椎间盘髓核,分离、培养BMSCs和髓核细胞并进行免疫细胞化学鉴定。取原代髓核细胞和第2代生长良好的BMSCs体外建立非接触性共培养模型。观察共培养后第1、3、5代BMSCs的形态学变化并绘制生长曲线;RT-PCR检测共培养5、10、15 d BMSCsⅡ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达;Western blot检测共培养5、10、15、20、25、30 d BMSCsⅡ型胶原和蛋白聚糖蛋白的表达。结果 BMSCs相对特异性标记物CD44、CD90表达阳性,造血细胞表面标记物CD34、CD45表达阴性。髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达阳性。共培养后2周BMSCs形态发生明显变化,呈多角形、不规则形;共培养后3代内,BMSCs生长速度无明显差异,随着传代次数增加,细胞增殖明显减慢。RT-PCR检测示共培养后10、15 d BMSCs蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于5 d时(P<0.05),而10 d与15 d时差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot检测示共培养后随时间延长细胞表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖蛋白逐渐增加,5、10、15 d间差异有统计学意义(P<0.05),15 d后各时间点间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论在非接触性共培养环境下,BMSCs在髓核细胞诱导下可向类髓核细胞分化,表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖,在共培养15 d时达到相对稳定,此时较适合进行体内移植。     

骨髓基质干细胞诱导成雪旺细胞的可行性及促轴突生长的体外功能实验

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)向雪旺细胞(SCs)分化的可行性,以及分化成类SCs的表型、分子及功能特征.方法 原代培养F344乳鼠BMSCs,流式细胞仪检测细胞表面特异标记CD29、CD44、CD45的表达;诱导干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化,评价干细胞的生物学特性;采用碱性成纤维细胞生长因子和forskolin等诱导BMSCs向SCs分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定SCs特异性标记物S100和p75的表达;RT-PCR分析诱导前、后SCs相关基因的表达;培养大鼠背根神经节神经元,分别与诱导前后的BMSCs共培养,评价其促轴突生长的功能特性.结果 分离培养的鼠BMSCs CD29、CD44表达呈阳性,CD45表达呈阴性:干细胞诱导的成骨细胞茜素红染色阳性,脂肪细胞油红O染色阳性;BMSCs经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与SCs相似;免疫荧光染色S100和p75阳性;RT-PCR结果S100、CD104均表达增强;与背根神经节神经元共培养,诱导后的BMSCs促进轴突生长的距离为(285.3±36.7)μm,与未诱导组BMSCs的[(113.5±11.5)μm]相比,差异有统计学意义(t=8.966,P=0.001).结论 BMSCs可诱导分化成SCs,其表型、分子及功能特征与SCs相似,诱导分化的BMSCs是一种理想的神经组织工程的种子细胞.     

骨髓间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架体外相容性研究

[目的]研究骨髓间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架体外相容性,进一步探讨联合二者移植修复脊髓损伤可能性.[方法]采用改良化学方法制备去细胞肌肉生物支架并复合冷灭菌方法灭菌,密度梯度离心法体外分离、贴壁法培养BMSCs,注射法接种第3代细胞于支架.[结果]H-E常规染色观察支架内部呈平行走行,Masson染色示支架内平行结构主要为胶原纤维,几乎没有肌纤维.接种BMSCs于支架并孵育14 d后,Hoechest 33342荧光标记计数显示大量存活细胞,扫描电镜可见细胞贴附于支架内表面生长.[结论]去细胞肌肉生物支架具有规则的内部结构是细胞移植理想载体.BMSCs能与去细胞肌肉生物支架体外相容并存活至少2周,为进一步体内联合移植修复脊髓损伤提供实验支持.     

肿瘤干细胞与肝癌干细胞

肿瘤起源于干细胞的假说正在各种人类肿瘤中得到证实,肿瘤不单是一种基因病,而且是一种干细胞病,基因突变作用于干细胞,干细胞突变成为肿瘤干细胞,这是肿瘤发生、再生、转移和复发的关键。肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中是否存在“肝癌干细胞”的问题一直倍受人们关注。该文介绍肿瘤干细胞与肝癌干细胞的研究情况。     

DNT细胞对肿瘤细胞作用的研究进展

DNT细胞(CD4-CD8-double-negative T cells)是新发现的一种免疫细胞,其特点是细胞表而既不表达CD4分子同时也不表达CD8分子.近年来,通过免疫疗法可以使肿瘤患者的愈后及生存质量得到很大的改善和提高.免疫细胞可以通过免疫调节或直接杀伤的途径作用于肿瘤细胞,因此研究DNT细胞对肿瘤细胞的作用将有重要意义.     

干细胞诱导分化为雄激素分泌细胞的研究进展

睾丸间质细胞是男性体内产生雄激素的主要细胞。干细胞可被诱导分化为具有雄激素分泌功能的睾丸间质样细胞,从而使其功能受到下丘脑与垂体调控,精确分泌维持生理功能需要的激素。故建立一套可靠高效的将干细胞诱导为雄激素分泌细胞的方法,对于治疗由于睾丸间质细胞异常引起的性腺功能低下意义重大。本文对近年来关于干细胞诱导分化为雄激素分泌细胞的研究进展予以综述。     

T cells and B cells in lupus nephritis

T and B lymphocytes play diverse roles at multiple stages in the development and progression of lupus nephritis. Disruption of T- and B-cell regulatory functions by environmental and genetic influences permits pathogenic effectors to emerge in disease. New insights into the biology of these multifunctional cells offer novel targets for intervention in lupus nephritis and systemic autoimmunity.     

骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的诱导条件，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分离小鼠骨髓间充质干细胞，在特定肝细胞培养液中用肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)定向诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态。应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经HGF和EGF诱导7d后变为肝细胞样圆形；2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。结论骨髓间充质干细胞在特定条件诱导下可以向肝细胞方向分化。有可能作为肝组织工程的种子细胞来源。     

Stem cells and progenitor cells in renal disease

Stem cells and progenitor cells are necessary for repair and regeneration of injured renal tissue. Infiltrating or resident stem cells can contribute to the replacement of lost or damaged tissue. However, the regulation of circulating progenitor cells is not well understood. We have analyzed the effects of erythropoietin on circulating progenitor cells and found that low levels of erythropoietin induce mobilization and differentiation of endothelial progenitor cells. In an animal model of 5/6 nephrectomy we could demonstrate that erythropoietin ameliorates tissue injury. Full regeneration of renal tissue demands the existence of stem cells and an adequate local "milieu," a so-called stem cell niche. We have previously described a stem cell niche in the kidneys of the dogfish, Squalus acanthus. Further analysis revealed that in the regenerating zone of the shark kidney, stem cells exist that can be induced by loss of renal tissue to form new glomeruli. Such animal models improve our understanding of stem cell behavior in the kidney and may eventually contribute to novel therapies.