miRNA对垂体瘤细胞株中增生细胞核抗原、垂体瘤转化基因、血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的探讨微小RNA(miRNA)对垂体瘤细胞株中增生细胞核抗原(ki-67)、垂体瘤转化基因(PTTG)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达影响。方法将培养好的人垂体瘤细胞放入A、B两培养瓶中培养,其中A培养瓶培养基中加入标记的miRNA基因2μl,而B培养瓶只是加入等量的培养基,采用RT-PCR及Western印迹法检测培养24 h后人垂体瘤细胞中ki-67、PTTG、VEGF基因及蛋白表达水平。结果 1A培养瓶加标记的miRNA基因后培养24 h,人垂体瘤细胞ki-67、PTTG和VEGF mRNA表达水平明显低于B培养瓶(P0.05);2A培养瓶加入miRNA基因后培养24 h,人垂体瘤细胞ki-67、PTTG和VEGF蛋白表达水平明显低于B培养瓶(P0.05)。结论垂体瘤细胞中ki-67、PTTG、VEGF处于高水平表达,而miRNA能够明显降低ki-67、PTTG、VEGF的表达,抑制细胞的生长,对临床具有指导意义。     

沙眼衣原体T3SS效应蛋白CT622的表达与多克隆抗体制备以及对HeLa细胞增殖的影响北大核心CSCD

目的原核表达沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)CT622蛋白,制备CT622多克隆抗体,初步探讨CT622蛋白对HeLa细胞增殖的影响,为进一步阐明CT622蛋白在沙眼衣原体致病中的作用提供实验依据。方法以Ct D型基因组为模板构建原核表达重组载体pGEX-6p-1/CT622;重组载体经IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B beads纯化GST-CT622融合蛋白,PreScission Protease酶切除GST标签后获取纯化的CT622蛋白;将纯化的CT622蛋白去内毒素处理后,经皮下免疫新西兰兔获取抗CT622抗体,采用抗原亲和纯化层析柱进行抗体纯化,BCA测定抗体浓度,SDS-PAGE鉴定多克隆抗体纯度,ELISA检测抗体效价;用不同浓度的CT622蛋白处理HeLa细胞24 h,CCK-8细胞活性检测试剂盒检测细胞存活率(%)。结果成功表达并纯化了CT622蛋白,该蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度0.8 mol/L,30℃、180 r/min条件下诱导4 h。制备兔源性抗CT622多克隆抗体,纯化后抗CT622抗体浓度为0.75 mg/ml,纯度>70%,ELISA检测免疫兔血清抗体效价为1∶512000左右;经1~15μg/ml浓度梯度的CT622蛋白处理HeLa细胞后,其细胞存活率高于对照组。结论成功表达、纯化了沙眼衣原体CT622蛋白,制备了高效价兔源性抗CT622抗体。在一定浓度范围内,CT622蛋白能促进HeLa细胞的增殖。     

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白调控MDM2-p53通路抑制细胞凋亡的研究

目的探讨沙眼衣原体pORF5质粒蛋白对细胞凋亡的影响,以及与MDM2-p53通路的关系,为阐明沙眼衣原体致病机制提供实验依据。方法用不同浓度的pORF5质粒蛋白以不同时间的刺激TNF-α预处理的HeLa细胞,采用Hoechst 33342染色及流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用Western blot检测p53的表达水平以及鼠双微体2(MDM2)的磷酸化水平;采用间接免疫荧光法分析MDM2在细胞内的定位;分别经MDM2抑制剂Nutlin3a预处理Hela细胞1 h,pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞24 h,采用流式细胞仪测定细胞凋亡率,分析凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平及MDM2磷酸化水平。结果 pORF5质粒蛋白能使TNF-α诱导的细胞凋亡率降低29%;p53蛋白的表达与pORF5浓度呈现出一定的时间和浓度依赖性,当pORF5浓度达10μg/mL时,p53的表达水平随pORF5浓度的升高而显著降低(P0.05);pORF5刺激Hela细胞8 h后p53表达开始下调,并且随时间的延长,p53的蛋白表达显著减少(P0.05);pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞15 min后,MDM2开始发生磷酸化反应,30 min达到峰值;间接免疫荧光试验检测显示pORF5质粒蛋白可促进MDM2发生核转位;MDM2抑制剂Nutlin3a能上调Bax蛋白的表达,下调Bcl-2的表达,并能促进细胞凋亡,Nutlin3a处理组细胞凋亡率较对照组增加约11%(P0.05)。结论 pORF5质粒蛋白通过激活MDM2-p53通路促进Bcl-2蛋白的表达和降低Bax蛋白的表达抑制细胞凋亡。     

ART1基因的表达对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及可能作用机制

目的探讨ART1基因的表达对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及可能作用机制。方法将ART1-sh RNA转入到小鼠结肠癌CT26细胞,置于荧光显微镜下观察该病毒的转染效率;采用RT-PCR和Western印迹法鉴定ART1基因沉默的效果;采用侵袭实验及黏附实验观察CT26细胞受ART1基因沉默的影响,并采用明胶酶谱法测定对该细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白活性的影响。结果病毒感染4 d后ART1 m RNA的表达量在ART1-sh RNA组中明显低于阴性对照组和空白对照组(P0.01)。ART1-sh RNA组CT26细胞的ART1蛋白的表达量明显低于阴性对照组和空白对照组(P0.01)。ART1-sh RNA组CT26细胞数明显少于阴性对照组和空白对照组(P0.05);ART1-sh RNA组的侵袭抑制率与阴性对照组和空白对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。与阴性对照组和空白对照组相比,RT1-sh RNA组CT26细胞与纤维连接蛋白的黏附能力均明显降低(P0.01)。RT1-sh RNA组CT26细胞中Rho A/Rho相关螺旋卷曲形成蛋白激酶(ROCK1)、Rho A、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显低于阴性对照组和空白对照组(P0.01)。结论 ART1基因沉默能够导致小鼠结肠癌CT26细胞的侵袭和黏附力降低,可能与ART1基因沉默后ROCK1、Rho A、MMP-2、MMP-9的表达水平下调有关。说明ART1基因在结肠癌的侵袭和转移中具有重要作用。     

衣原体感染

抗生素联用丙种球蛋白治疗泌尿生殖道沙眼衣原体感染178例疗效观察——韩武红等（湖北孝感市中心医院432100）；《中国男科学杂志》，2006，20（5）：40—41[目的：探索泌尿生殖道沙眼衣原体（CT）感染满意的治疗途径。方法：对178例泌尿生殖道沙眼衣原体患者进行随机分组治疗，A组91例只用抗生素治疗，B组87例用抗生素加丙种球蛋白治疗。结果：A组有效率84．6％，B组有效率94．3％，两组有效率有显著差别（P〈0．05）。结论：抗生素加丙种球蛋白治疗泌尿生殖道沙眼衣原体感染有一定的辅助治疗作用。]     

乙型肝炎B病毒X相关蛋白对宫颈癌细胞增殖及迁移的影响

目的研究乙型肝炎B病毒X相关蛋白(HBXAP)基因对Hela和C-33A宫颈癌细胞增殖及迁移的影响及机制。方法利用基因转染及RNA干扰分别构建过表达HBXAP的Hela细胞株和低表达HBXAP的C-33A细胞株。细胞计数试剂(CCK)8和Transwell实验研究过表达及低表达HBXAP基因对Hela和C-33A细胞增殖及迁移的影响,Western印迹检测ERK蛋白表达情况。结果过表达HBXAP促进Hela细胞的增殖、迁移及上调ERK蛋白的表达,沉默HBXAP基因抑制C-33A的增殖、迁移及下调细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白的表达。结论 HBXAP可经丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK途径参与宫颈癌的发生及演进过程。     

F型沙眼衣原体主外膜蛋白基因omp1原核表达及其序列分析

目的对F型沙眼衣原体主外膜蛋白(MOMP)基因进行原核表达,获得omp1基因重组蛋白,并对克隆到的基因进行序列分析,为F型沙眼衣原体的诊断及疫苗研究奠定基础。方法利用PCR技术从沙眼衣原体阳性病人尿道拭子标本中扩增omp1基因,分析序列,并定向克隆入原核表达载体pGEX-5X3中,与GST进行融合表达。结果对克隆到的沙眼衣原体omp1基因进行序列分析,基因序列与F型沙眼衣原体F/IC-CAL3相似性达99%,构建Omp1-pGEX-5X3重组质粒,omp1与GST融合表达。结论成功构建F型沙眼衣原体omp1基因原核表达系统,得到重组蛋白,为沙眼衣原体疫苗的研究和临床检测试剂盒的研制打下基础。     

慢病毒介导TFF3基因转染A549细胞对NF-κB表达的影响

目的探讨核因子(NF)-κB在慢病毒转染过表达及沉默三叶因子(TFF)3基因的人非小细胞肺癌A549细胞中的表达意义。方法慢病毒包装TFF3基因全长片断及TFF3短发卡RNA质粒,病毒液转染A549细胞,获得稳定过表达及沉默TFF3表达的A549细胞株,实时荧光定量PCR(qPCR)和Western印迹法检测TFF3、NF-κB、B细胞淋巴瘤基因(Bcl)-2、细胞周期蛋白(Cyclin)D1基因及蛋白的表达水平。结果过表达TFF3的A549细胞(TFF3)中TFF3基因较对照组增高(655±135)倍,蛋白水平较Vec组显著增高;沉默TFF3基因的A549细胞(shTFF3)沉默TFF3效率约为75%,蛋白水平也较shCK组明显降低(均P0.01)。TFF3组NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA及蛋白表达水平明显高于Vec组(P0.05),shTFF3组NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA及蛋白水平较shCK组明显降低(P0.01)。结论 TFF3的表达与NF-κB密切相关,过表达TFF3能够激活NF-κB,促进CyclinD1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制了细胞凋亡,促进肺癌细胞恶性发展。     

没食子酸诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的机制

目的体外观察没食子酸对人宫颈癌Hela生长及凋亡的影响,探讨其抗肿瘤作用。方法体外培养Hela细胞,用不同浓度的没食子酸作用为实验组,同时设对照组,以CCK8法测细胞增殖抑制作用、流式细胞仪检测p53和Bcl-2蛋白表达情况,扫描电镜下观察细胞形态的改变。结果不同浓度没食子酸作用Hela细胞24 h增殖抑制显著(P0.05),其抑制效应具有剂量依赖性,同时诱导Hela细胞凋亡、上调p53基因表达、下调Bcl-2基因表达(P0.05)。结论没食子酸可抑制Hela细胞的生长且随药物剂量的增加而升高,并可诱导肿瘤细胞凋亡,其抗肿瘤效应可能与细胞的基因调控有关。     

皂荚提取物对宫颈癌Hela细胞凋亡及端粒酶的影响

目的探讨皂荚提取物对人宫颈癌Hela细胞凋亡及端粒酶的影响。方法体外培养人宫颈癌Hela细胞,给予不同浓度皂荚提取物(0. 1、0. 5、1. 0 mg/ml)对人宫颈癌Hela细胞进行作用,采用MTT法、荧光染色法、流式细胞术和免疫组化法分析其对Hela细胞增殖、凋亡、生长周期、相关基因(Bax、Bcl-2、p53)表达和端粒酶活性的影响。结果与对照组相比,3个不同浓度皂荚提取物对人宫颈癌Hela细胞增殖具有明显的抑制作用(P0. 05),可调控Hela细胞癌基因与抑癌基因,促进凋亡,抑制端粒酶活性(P0. 05)。结论皂荚提取物能够抑制人宫颈癌Hela细胞增殖,作用机制可能与诱导Hela细胞凋亡有关。     

含弓形虫复合抗原基因的真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的 研究弓形虫复合抗原真核表达质粒pcDNA3．1-P30-P22-CTXA2/B在哺乳动物细胞中的表达情况。方法利用脂质体介导的转染技术，将真核表达质粒pcDNA3．1-P30-P22-CTXA2／B和空载体pcDNA3．1分别转染Hela细胞，400μg／ml G418加压筛选和200gg／ml G418维持筛选，获得稳定转染的Hela细胞。采用SDS-PAGE和Western-blot方法对复合基因P30P22-CTXA2／B的表达产物进行鉴定。结果SDS-PAGE结果显示，重组质粒转染Hela细胞后的表达产物分子质量单位为64ku，Western blot显示此蛋白条带能被抗P30抗体识别。结论构建的真核表达质粒pcDNA3，1-P30-P22-CTXA2／B能在哺乳动物细胞中成功表达插入基因所编码的融合蛋白，为进一步动物实验提供了实验依据。     

黄连解毒汤含药血清对Aβ诱导的海马神经元凋亡及GRP78/PERK/CHOP通路的影响

目的 探究黄连解毒汤含药血清对β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导的海马神经元凋亡及葡萄糖调节蛋白(GRP)78/蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/CCAAT-增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)通路的影响。方法 将海马神经元细胞随机分为对照组、Aβ组和黄连解毒汤低、中、高剂量组(2.7、5.4、8.1 g/kg),对照组加入空白血清培养，Aβ组加入Aβ_25～35(40μmol/L)和空白血清培养，给药组先加入Aβ_25～35再加入含药血清进行培养。噻唑蓝(MTT)法检测海马神经元细胞活性，TUNEL法检测海马神经元细胞凋亡，Western印迹检测抗凋亡基因B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、促凋亡基因Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3及GRP78、PERK和CHOP表达水平。结果 与对照组相比，Aβ组细胞活性明显降低，细胞凋亡指数明显升高，Bcl-2/Bax水平显著降低，cleaved-/pro-Caspase-3水平显著升高，GRP78、PERK和CHOP蛋白表达显著升高(均P<0.05);与Aβ组比较...     

华支睾吸虫CsSCCRO基因的表达和鉴定

目的将目的基因CsSCCRO转染Hela细胞,检测转染效率和表达水平,为进一步在细胞学水平研究编码蛋白的功能提供依据。方法将目的基因CsSCCRO克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,通过脂质体方法转入Hela细胞,RT-PCR和荧光观察来鉴定转录和表达水平。结果真核重组质粒pEGFP-N1-CsSCCRO转入Hela细胞后稳定表达荧光蛋白;RT-PCR鉴定转染的Hela细胞,扩增产物约为780bp,与预期值相符。结论CsSCCRO基因能够转染到Hela细胞中,并且能与GFP高效转录和翻译成融合蛋白。     

PTD4-凋亡素融合蛋白对Hela细胞bak基因表达的影响

目的研究PTD4-凋亡素(apoptin)融合蛋白对Hela细胞bak基因表达的影响。方法原核表达系统表达PTD4-apoptin融合蛋白,使用CCK8试剂盒检测融合蛋白对Hela细胞的抑制作用;PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela细胞24 h后,提取细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western印迹检测bak基因在RNA水平和蛋白水平的表达。结果 PTD4-apoptin融合蛋白诱导Hela细胞bak mRNA和蛋白水平表达量较对照组均显著提高。结论 PTD4-apoptin蛋白可诱导Hela细胞凋亡,与bak基因参与凋亡调控相关。     

含弓形虫复合抗原基因的真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的研究弓形虫复合抗原真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B在哺乳动物细胞中的表达情况。方法利用脂质体介导的转染技术,将真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B和空载体pcDNA3.1分别转染He-la细胞,400μg/mlG418加压筛选和200μg/mlG418维持筛选,获得稳定转染的Hela细胞。采用SDS-PAGE和West-ern-blot方法对复合基因P30-P22-CTXA2/B的表达产物进行鉴定。结果SDS-PAGE结果显示,重组质粒转染Hela细胞后的表达产物分子质量单位为64ku,Western-blot显示此蛋白条带能被抗P30抗体识别。结论构建的真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B能在哺乳动物细胞中成功表达插入基因所编码的融合蛋白,为进一步动物实验提供了实验依据。     

宫颈LEEP术对阴道病原体感染的疗效观察

目的探讨LEEP术对宫颈上皮内瘤变(CIN)患者阴道病原微生物的疗效及术后高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染与解脲支原体(UU)及沙眼衣原体(CT)相关性。方法选取CINⅡ～Ⅲ级患者178例,术前取宫颈分泌物检测HPV、UU、CT,术后每半年随访一次检测HPV、UU、CT,并行宫颈细胞学检查。结果 LEEP术后高危型HPV检出率与术前比较,P<0.01;UU、CT检出率有所下降,但无统计学差异(P>0.05);LEEP术后高危型HPV持续感染患者的UU和CT阳性率与转阴组比较,P均<0.05,沙眼衣原体检出率与转阴组比较,P均<0.05。结论宫颈LEEP术可以有效去除HPV感染,对支原体、衣原体感染效果不明显,需要辅助抗生素治疗;UU、CT感染可能增加高危型HPV持续感染的机会。     

蛋白酶体抑制剂Bortezomib对宫颈癌Hela细胞的体外作用

目的探讨蛋白酶体抑制剂Bortezomib对宫颈癌Hela细胞存活率的影响。方法 MTT检测Bortezomib对宫颈癌Hela细胞体外生长及增殖的影响;并用Western印迹、RT-PCR检测NF-κB(P65)蛋白和mRNA表达水平的变化。结果 (1)MTT检测结果显示:与对照组相比,Borte-zomib 1.25μmol/L组〔(84.9±0.08)%〕、Bortezomib 2.50μmol/L组〔(67.1±0.12)%〕、Bortezomib 5.00μmol/L组〔(51.6±0.11)%〕、Bortezomib10.00μmol/L组〔(41.3±0.13)%〕及Bortezomib 20.00μmol/L组〔(20.8±0.12)%〕Hela细胞增殖率明显降低(P<0.05)。(2)Western印迹检测结果表明:随着Bortezomib浓度的增高,NF-κB(P65)蛋白表达量有剂量依赖性的降低趋势(P<0.05)。(3)RT-PCR结果显示,与对照组相比,随着Bortezomib浓度的增加,NF-κB(P65)mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)。结论蛋白酶体抑制剂Bortezomib能够体外抑制宫颈癌Hela细胞的短期增殖,其机制与下调NF-κB(P65)的表达密切相关。     

pEFNB2-shRNA载体对人宫颈癌Hela细胞EFNB2表达、增殖及凋亡的影响

目的 pEFNB2-shRNA载体对人宫颈癌Hela细胞EFNB2表达、增殖及凋亡的影响。方法将人宫颈癌Hela细胞随机分为实验组、对照组、空白组,采用RT-PCR法及Western blot法检测转染48 h后EFNB2基因及mR-NA表达,MTT法检测244、8、72、96 h细胞增殖率,流式细胞仪检测24、48 h细胞凋亡率。结果实验组EFNB2mRNA、EFNB2蛋白水平及各时点细胞生存率明显低于对照组及空白组,各时点凋亡率明显高于对照组及空白组,P均〈0.05。结论 pEFNB2-shRNA载体能有效抑制Hela细胞的增殖活性,促进其凋亡,其机制可能为抑制EFNB2 mRNA及蛋白的表达。     

下调miR-20a靶向负调控ZNF259抑制肺癌H322细胞侵袭迁移并诱导凋亡

目的探讨miR-20a对肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响和机制。方法 Realtime PCR方法分别检测miR-20a在正常肺上皮细胞BEAS-2B和肺癌细胞A549、Spc-A1、H322中的表达变化。在肺癌H322细胞中转染miR-20a inhibitor,四甲基偶氮唑蓝(MTT)测定增殖,流式细胞仪检测凋亡,Transwell小室检测侵袭和迁移,Western印迹检测ZNF259、C-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、基质金属蛋白酶(MMP)-2、C-Caspase-9、MMP-9蛋白表达变化。靶基因预测软件预测ZNF259可能为miR-20a的靶基因,利用双荧光素酶活性系统鉴定靶向关系。在肺癌细胞中共转染miR-20a inhibitor、ZNF259 siRNA,同样使用上述方法测定细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力变化,评估ZNF259 siRNA对下调miR-20a调控肺癌细胞的影响。结果肺癌细胞A549、Spc-A1、H322中miR-20a的表达水平明显高于正常肺上皮细胞BEAS-2B,且H322细胞中miR-20a的表达水平最高。miR-20a inhibitor能够下调肺癌细胞中miR-20a的表达水平,降低细胞增殖、迁移和侵袭能力,诱导细胞凋亡,促进细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达,减少细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达。荧光素酶活性鉴定结果显示,ZNF259为miR-20a的靶基因,且下调miR-20a提高肺癌细胞中ZNF259蛋白表达水平。ZNF259 siRNA可以逆转下调miR-20a后的肺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡变化。结论下调miR-20a靶向负调控ZNF259抑制肺癌细胞增殖、迁移、侵袭并诱导细胞凋亡。     

姜黄素对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响及其机制

目的观察姜黄素对人膀胱癌T24细胞增殖、凋亡及细胞内核因子κB(NF-κB)蛋白表达的影响。方法将对数生长期T24细胞分为两组,实验组加入10、20、50、100μmol/L姜黄素,对照组加入完全培养液。培养24、48、72 h时采用MTT比色法检测两组细胞增殖抑制率;培养24 h采用流式细胞术检测细胞凋亡率、Western blot法检测细胞内NF-κB蛋白表达情况。结果实验组细胞增殖抑制率明显高于对照组,且呈时间—剂量依赖性,P均<0.05;实验组24 h细胞凋亡率明显高于、NF-κB蛋白表达水平明显低于对照组,且呈剂量依赖性,P均<0.05。结论姜黄素能有效抑制人膀胱癌T24细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与下调NF-κB表达有关。