A549细胞三维立体培养模型的建立及耐药机制

目的探讨肺腺癌A549细胞三维立体(3D)培养模型对顺铂(DDP)的耐药性及其黏附耐药机制。方法胶原培养条件下建立A549三维立体培养模型,MTT法检测平面(2D)培养和3D培养A549细胞敏感性。采用整合素β1激动剂(TSF)和抑制剂(MAB)干预,对其相关机制进行研究。结果 A549细胞3D培养模型中可见细胞生长良好,细胞之间黏附形成典型的多细胞球。2D培养模型中A549细胞对DDP的IC50值为12.84μg/ml;3D培养A549细胞对DDP的IC50是31.74μg/ml,为2D培养的2.47倍。与空白对照组比较,DDP干预组及MAB+DDP组的抑制率明显升高(P0.01),TSF+DDP组有较显著差别(P0.05);与DDP干预组相比较,TSF+DDP组细胞抑制率明显降低(P0.05),MAB+DDP组明显升高(P0.05)。结论胶原法成功建立A549细胞的3D培养模型。与2D培养相比,该细胞模型具有耐药的特性,其机制可能与促进整合素β1对细胞的黏附作用有关。     

补中益气汤与siRNA对肺腺癌A549/DDP细胞耐药逆转作用的比较

目的比较补中益气汤含药血清与siRNA技术(RNA)对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP的耐药效果及对多药耐药蛋白P-gp表达的影响。方法制备补中益气汤含药血清,设计并合成针对P-gp基因对应序列的siRNA,转染A549/DDP细胞;实验分组为空白对照组、补中益气汤含药血清处理组、siRNA处理组,利用RT-PCR检测P-gp mRNA,Western印迹及免疫细胞化学法检测P-gp蛋白质的表达;MTT法检测A549/DDP细胞耐药逆转效果。结果补中益气汤含药血清和siRNA均能降低P-gp mRNA和蛋白质表达,恢复顺铂敏感性,耐药倍数分别降至2.01、2.73,具有统计学意义(P<0.05)。结论补中益气汤含药血清和siRNA均能有效逆转人肺腺癌耐药细胞A549/DDP的多药耐药。     

重楼皂苷Ⅶ对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP细胞增殖的抑制作用

目的探讨重楼皂苷Ⅶ对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP细胞增殖的抑制作用。方法 MTT法测定重楼皂苷Ⅶ对A549/DDP细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测重楼皂苷Ⅶ对A549/DDP细胞的细胞凋亡率及细胞周期时相分布的影响。结果重楼皂苷Ⅶ对A549/DDP细胞的增殖有明显抑制作用,抑制率随药物浓度增加而增高,具有明显的量-效关系(P<0.05)。同时发现,重楼皂苷Ⅶ对A549/DDP细胞作用48 h及72 h组与24 h组比较细胞增殖抑制率均明显提高(P<0.05),但72 h组与48 h组比较,无统计学意义(P>0.05)。流式细胞仪分析显示,浓度为50μmol/L及100μmol/L的重楼皂苷Ⅶ作用A549/DDP细胞24 h后,与阴性对照组比较早期凋亡细胞比例明显增高;且对细胞周期时相分布影响明显,细胞阻滞G2期。结论重楼皂苷Ⅶ对人肺腺癌A549/DDP细胞的增殖具有明显抑制作用,并呈明显的浓度依赖性,与时间有一定相关性。重楼皂苷Ⅶ可引起早期凋亡细胞比例明显增加,并明显影响A549/DDP细胞周期时相分布。     

YAP调控肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的机制分析

目的探讨Yse相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)对A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响及其机制。 方法采用MTS检测顺铂对肺腺癌A549细胞以及肺腺癌耐顺铂A549/DDP细胞的50%抑制浓度(IC₅₀)。使用qPCR以及Western blot检测A549和A549/DDP细胞中YAP mRNA以及蛋白的表达。Western blot检测维替泊芬(Verteporfin, VP)处理A549/DDP后YAP蛋白表达变化。将A549/DDP细胞设置为DMSO对照组、顺铂组(DDP组)、维替泊芬组(VP组)、顺铂联合维替泊芬组(DDP+VP组),采用MTS检测0、24和48 h各处理组细胞活力的变化。采用qPCR检测VP处理A549/DDP后干细胞标志物ALDHA1、CD133、OCT4、NANOG、SOX2的mRNA表达变化。 结果顺铂对A549和A549/DDP细胞的IC50分别为(4.07±0.03)μg/ml、(23.44±0.98)μg/ml,耐药指数为5.76。A549/DDP细胞中YAP显著高于A549细胞(P<0.05)。VP处理A549/DDP细胞后YAP蛋白表达水平较DMSO组明显降低。DDP+VP组较单独DDP组,其细胞活力在24 h和48 h均明显降低(P<0.05)。qPCR检测发现A549/DDP细胞经VP处理后,干细胞标志物ALDHA1、CD133、OCT4、NANOG、SOX2的mRNA均较DMSO组明显降低(P<0.05)。 结论YAP可能参与了肺癌细胞的顺铂耐药。抑制YAP可通过抑制肿瘤干细胞特性,进而发挥逆转耐药的作用。     

姜黄素抗人肺腺癌A549/DDP细胞增殖及诱导凋亡的作用

目的 研究姜黄素对人肺腺癌A549/DDP细胞增殖的抑制作用及其对细胞凋亡的影响.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)测定细胞对顺铂的敏感性和姜黄素对细胞增殖的抑制作用;倒置相差显微镜和荧光显微镜下观察细胞形态学的变化;应用原位末端标记(TUNEL)染色及流式细胞仪检测细胞凋亡情况;以Western blot分析凋亡相关蛋白表达变化.结果 实验中所用的A549/DDP细胞对顺铂耐药,耐药指数为10.82.姜黄素对A549及A549/DDP细胞增殖均有抑制作用,并且呈时间、浓度依赖性(P＜0.05),对两细胞株的半数抑制浓度分别为16.28/μmol/L和18.06μmol/L,差异无统计学意义(P＞0.05).姜黄素处理A549/DDP细胞后,细胞变形、缩小、脱落.Hoechst染色显示A549/DDP细胞核缩小、变形,致密浓染,荧光成团块分布.TUNEL法以及流式细胞仪分析结果示细胞凋亡率呈明显剂量依赖关系(P＜0.05).Western blot结果显示,随姜黄素浓度的增加,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8(cysteinyl aspartate-specific protease-8,caspase-8)p10蛋白水平增加.结论 A549/DDP细胞对姜黄素无抗药性,姜黄素对人肺腺癌A549/DDP细胞增殖具有抑制作用,并能诱导细胞凋亡.caspase-8的活化是其中的机制之一.     

miR-34a逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性及其机制

目的探讨过表达miR-34a对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂(DDP)耐药性的影响及可能机制。方法成功构建过表达miR-34a的真核载体p CDNA3.1+miR-34a后,将A549/DDP细胞分为对照组(无转染)、空转染组(转染空质粒)和过表达组(转染p CDNA3.1+miR-34a),采用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测转染24、48、72及96 h后各组miR-34a水平;给予不同浓度DDP(2、4、8、16、32和64μg/ml)处理48 h后采用CCK-8法比较各组对DDP的敏感性,流式细胞仪PI/Annexin V双染法检测各组转染48、96 h后的凋亡率,分别采用Western印迹检测各组转染48、96 h后常见耐药基因的表达情况。结果 A549/DDP细胞的miR-34a水平均低于其亲本细胞A549和正常支气管上皮细胞系HBE(P0.05);与其余两组相比,过表达组转染后的miR-34a水平升高,且对A549/DDP细胞的增殖抑制率升高(P0.05);过表达组的半数抑制浓度均低于其余两组,过表达组转染48、96 h后的凋亡率高于其余两组,而转染48 h后的P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白1及肺耐药相关蛋白的水平低于其余两组(P0.05);对照组和空转染组以上指标的差异均无统计学意义(P0.05)。结论 A549/DDP细胞中miR-34a水平较低,通过真核载体将其过表达后可抑制增殖率并提高其对DDP的敏感性,可能与其诱导凋亡及降低耐药基因的表达有关。     

内质网应激激活剂通过上调GRP78增加肺癌A549细胞对顺铂的敏感性

目的探讨内质网应激激活剂(TM)增加肺癌A549细胞对顺铂(DDP)敏感性的机制。方法 DDP和TM处理肺癌A549细胞,MTT法检测肺癌A549细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western印迹检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-7表达。结果不同浓度的DDP(0,10,20,50μmol/L)作用于肺癌A549细胞24 h,细胞存活率以剂量依赖的方式下降;TM诱导内质网应激后,提高了DDP(20μmol/L)诱导的细胞凋亡率(55.23%±2.31%,P0.05);同时检测到凋亡相关蛋白Caspase-7表达增加。结论 DDP能够诱导肺癌A549细胞凋亡,但是TM通过上调GRP78增加了肺癌A549细胞对DDP敏感性,联合应用TM和DDP有望成为治疗肺癌的新策略。     

人参皂苷增加顺铂抗肺癌A549细胞活性的机理研究

目的观察人参皂苷与顺铂联合作用肺癌A549细胞的细胞毒作用,探索相关作用机制。方法 MTT实验检测人参皂苷、顺铂对人肺癌A549细胞的细胞毒作用;提取药物处理细胞总蛋白,Western blot检测细胞survivin蛋白的表达变化;Annexin V/PI双染、流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。结果人参皂苷和顺铂对肺癌A549细胞的半数抑制浓度(IC50)值分别为(43.26±3.27)和(2.34±0.15)μmol/L;20、40μmol/L人参皂苷与顺铂联合作用A549细胞,顺铂对A549细胞的IC50值减少为(1.42±0.33)、(0.61±0.04)μmol/L,P<0.01。Western blot检测显示人参皂苷剂量依赖性的降低肺癌A549细胞survivin蛋白的表达。流式细胞仪凋亡检测显示人参皂苷使顺铂诱导的细胞凋亡增加(P<0.01)。结论人参皂苷可以显著增加顺铂对肺癌A549细胞的致凋亡作用,下调survivin蛋白表达可能是其增敏的主要机制。     

补中益气汤对肺腺癌顺铂耐药细胞株与顺铂敏感细胞株荷瘤BALB/c小鼠移植瘤P-gp蛋白表达的影响

目的探讨补中益气汤对肺腺癌顺铂(DDP)耐药与敏感细胞株荷瘤BALB/c小鼠移植瘤P-gp蛋白表达的影响。方法体外培养肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP及敏感细胞株A549,接种于BALB/c小鼠腋窝皮下,荷瘤成功后给予顺铂或顺铂联合低、中、高剂量补中益气汤治疗。实验共分为10组:A549/DDP或A549荷瘤对照组、A549/DDP或A549荷瘤+顺铂组、A549/DDP或A549荷瘤+顺铂+低剂量补中益气汤组、A549/DDP或A549荷瘤+顺铂+中剂量补中益气汤组、A549/DDP或A549荷瘤+顺铂+高剂量补中益气汤组。给药结束后,测量移植瘤体积并计算药物抑瘤率及抑瘤作用提高率,蛋白质印迹法检测移植瘤组织P-gp蛋白的表达。结果顺铂对A549/DDP移植瘤体积无显著影响(P0.05),而使A549移植瘤体积显著缩小(P0.05);联合低、中、高剂量补中益气汤的A549/DDP及A549移植瘤体积均缩小(P0.05),抑瘤率均增加(P0.05),随着中药剂量的增加,移植瘤体积随之缩小,抑瘤率随之增加,抑瘤作用提高率也随之增加;单独顺铂可上调A549/DDP移植瘤组织中P-gp蛋白表达(P0.05),下调A549移植瘤组织中P-gp蛋白表达(P0.05);联合低剂量补中益气汤并未显著下调A549/DDP及A549移植瘤组织中P-gp蛋白表达(P0.05);联合中、高剂量补中益气汤的A549/DDP及A549移植瘤组织中P-gp蛋白表达均显著下调(P0.05),两剂量间无差异(P0.05)。结论在顺铂耐药与顺铂敏感的肺腺癌移植瘤组织中,补中益气汤均有缩小移植瘤体积、提高顺铂抑瘤率、下调P-gp蛋白表达的作用,尤以中、高剂量作用最显著。     

浙贝母碱对肺癌A549/DDP细胞多药耐药的逆转作用观察及机制探讨

目的观察浙贝母碱对肺癌A549/DDP细胞多药耐药的逆转作用,并探讨其可能的机制。方法将对数生长期的细胞随机分成2组,对照组分别加入不同浓度的DDP,实验组在对照组基础上再加入400μg/mL的浙贝母碱;采用MTT法测算细胞增殖抑制率,计算两组细胞DDP的半数抑制浓度(IC50)及浙贝母碱的逆转倍数。将对数生长期的细胞分为3组,空白对照组不加任何药物,对照组加入DDP,实验组在对照组基础上再加入400μg/mL的浙贝母碱;药物作用48 h后,采用流式细胞术测算细胞凋亡率,用细胞免疫荧光法检测细胞中的人肺耐药蛋白(LRP)。结果实验组DDP的IC50为4.15μg/mL,对照组为15.46μg/mL,浙贝母碱的逆转耐药倍数为3.73。培养48 h后,空白对照组细胞凋亡率为2.56%±0.44%、LRP蛋白阳性细胞为(9.8±1.92)个/HP,对照组分别为为13.5%±1.42%、(9.2±1.9)个/HP,实验组为38.16%±2.25%、(5.8±1.3)个/HP;实验组与对照组、空白对照组比较,P均<0.05。结论浙贝母碱可逆转肺癌A549/DDP细胞株的多药耐药,其作用机制可能与其促进耐药细胞凋亡、下调LRP蛋白表达有关。     

Comparative proteomic analysis of paclitaxel sensitive A549 lung adenocarcinoma cell line and its resistant counterpart A549-Taxol

Purpose  

Paclitaxel is used as the first-line chemotherapy for Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC), but acquired resistance becomes a critical problem. Several mechanisms have been proposed in paclitaxel resistance, but they are not sufficient to exhaustively explain this resistance emergence. To better investigate molecular resistance mechanisms, a comparative proteomic approach was carried out to identify differentially expressed proteins between human lung adenocarcinoma A549 cell line (paclitaxel sensitive) and A549-Taxol cell line (acquired resistant).     

诺帝对人肺腺癌细胞A549及其耐药株A549DDP体外生长的影响及机制

目的探讨诺帝对肺腺癌细胞系A549及耐顺铂株A549DDP的作用及机制,为诺帝的临床应用提供理论依据。方法 MTT法检测诺帝对A549及A549DDP细胞增殖的抑制作用,流式细胞术（FCM）分析细胞周期,免疫细胞化学SP法及原位杂交法分别检测细胞质内P糖蛋白及血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达。结果诺帝干预后A549及A549DDP细胞增殖明显受抑,细胞周期阻滞于G0/G1期,S期细胞减少;A549及A549DDP细胞质内P糖蛋白及VEGF mRNA表达均明显降低。结论诺帝对A549及A549DDP细胞生长均有抑制作用,其机制可能是抑制肿瘤血管生成及降低P糖蛋白表达。     

姜黄素对肺癌A549细胞迁移和侵袭的影响

目的探讨姜黄素对肺癌A549细胞侵袭迁移力的影响及其机制。 方法利用不同浓度姜黄素处理正常肺上皮细胞,台盼蓝法检测药物细胞毒性;不同浓度的姜黄素作用于A549细胞,MTT法测定A549细胞增殖水平;细胞划痕实验和Transwell实验分别测定药物处理后A549细胞的迁移和侵袭能力变化情况;Werstern blot测定A549细胞中于侵袭迁移有关的表皮生长因子受本(EGFR)、E-型钙黏蛋白(E-cadherin)、N-型钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白的表达。 结果姜黄素浓度在0～40 μg/ml时正常肺上皮病死率低,差异无明显统计学差异(P>0.05),表明姜黄素对正常肺上皮细胞的不良反应小;MTT实验结果显示姜黄素以浓度依赖的方式抑制A549细胞的增殖,各组与对照组相比均具有统计学意义(P<0.01);细胞划痕实验显示姜黄素以浓度依赖的方式抑制A549细胞的迁移能力,各组与对照组相比均具有统计学意义(P<0.01);Transwell实验显示姜黄素以浓度依赖的方式抑制A549细胞的侵袭能力,各组与对照组相比均具有统计学意义(P<0.01);Western blot显示姜黄素处理A549细胞后EGFR蛋白(P<0.01)和N-cadherin蛋白表达降低(P<0.01),E-cadherin蛋白表达升高(P<0.01)。 结论一定浓度内姜黄素细胞毒性低,姜黄素能够抑制A549的增殖、迁移和侵袭,可能是通过调节EGFR、N-cadherin、E-cadherin蛋白从而逆转上皮间质转化过程。     

利用生物纳米技术检测外周血肺癌细胞的实验研究

目的建立磁性纳米颗粒从肿瘤患者外周血中富集与纯化肿瘤细胞的方法,应用荧光纳米晶生物探针检测方法,实现对肺癌早期微转移的诊断。方法体外培养人肝癌细胞和肺癌细胞,采集健康人外周血单个核细胞（PBMC）,将PBMC与肝癌细胞和肺癌细胞按比例混合,通过磁粒抗体复合物富集癌细胞,用荧光纳米晶探针进行肺癌特异性鉴定。结果光镜下可见较多的人肝癌细胞和人肺癌细胞与磁性纳米颗粒紧密结合,而PBMC与磁性纳米颗粒不结合。荧光显微镜下可见荧光纳米晶表面蛋白A探针特异性地与肺癌细胞结合产生荧光信号,但与肝癌细胞不结合,无荧光信号出现。结论本方法可成功地从外周血中富集到肺癌细胞,经荧光纳米晶探针成功地鉴定为肺癌细胞,达到诊断肺癌早期微转移的目的。     

金莲花黄酮对A549细胞生长及凋亡的影响

目的观察金莲花黄酮对人非小细胞肺癌A549生长及凋亡的影响及其体外抗肿瘤效应。方法体外培养A549细胞,以不同浓度的金莲花黄酮作用为实验组,并设对照组,应用CCK8法测细胞增殖抑制效应、DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡、流式细胞术检测A549细胞中p53和bcl-2蛋白表达情况。结果不同浓度金莲花黄酮作用A549细胞24 h增殖抑制明显(P<0.05),其抑制效应具有剂量依赖的特点并可诱导A549细胞凋亡,同时上调p53基因表达、下调bcl-2基因表达(P<0.05)。结论金莲花黄酮可剂量依赖性抑制A549细胞的生长并可诱导肿瘤细胞凋亡,其抗肿瘤效应可能与细胞凋亡相关基因表达的调控有关。     

人肺腺癌细胞A549的耐药性与放射敏感性的相关性研究

目的 研究肺腺癌细胞株A549及耐药株A549/DDP放射敏感性差异,探讨肺腺癌的耐药性与放射敏感性的关系.方法 对指数生长期的A549、A549/DDP细胞用6 mV直线加速器分成0、1、2、4、6、8、10、12 Gy 8个剂量点进行放射.倒置显微镜观察细胞的形态变化,并根据细胞克隆计数,计算SF2,绘制细胞存活曲线.结果 放疗后两种细胞株的细胞形态发生改变,部分细胞死亡、破碎.A549和A549/DDP细胞株的SF2分别为0.417和0.685.结论 肺腺癌肿瘤细胞产生耐药性后可以使其放射敏感性降低.     

Photothermal Killing of A549 Cells and Autophagy Induction by Bismuth Selenide Particles

With a highly efficient optical absorption capability, bismuth selenide (Bi₂Se₃) can be used as an outstanding photothermal agent for anti-tumor treatment and shows promise in the field of nanotechnology-based biomedicine. However, little research has been completed on the relevant mechanism underlying the photothermal killing effect of Bi₂Se₃. Herein, the photothermal effects of Bi₂Se₃ particles on A549 cells were explored with emphasis put on autophagy. First, we characterized the structure and physicochemical property of the synthesized Bi₂Se₃ and confirmed their excellent photothermal conversion efficiency (35.72%), photostability, biocompatibility and ability of photothermal killing on A549 cells. Enhanced autophagy was detected in Bi₂Se₃-exposed cells under an 808 nm laser. Consistently, an elevated expression ratio of microtubule-associated protein 1 light chain 3-II (LC3-II) to LC3-I, a marker of autophagy occurrence, was induced in Bi₂Se₃-exposed cells upon near infrared (NIR) irradiation. Meanwhile, the expression of cleaved-PARP was increased in the irradiated cells dependently on the exposure concentrations of Bi₂Se₃ particles. Pharmacological inhibition of autophagy by 3-methyladenine (3-MA) further strengthened the photothermal killing effect of Bi₂Se₃. Meanwhile, stress-related signaling pathways, including p38 and stress activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase (SAPK/JNK), were activated, coupled with the attenuated PI3K/Akt signaling. Our study finds that autophagy and the activation of stress-related signaling pathways are involved in the photothermal killing of cancerous cells by Bi₂Se₃, which provides a more understanding of photothermal materials.     

Total saponins of Tupistra chinensis induces apoptosis in A549 cells

Tupistra chinensis Baker has been used as a?folk remedy in China, and it has been shown to exhibit anti-inflammation, expectorant and anti-bacterial effects. In this study, we report the cytotoxic activity of the total saponins of Tupistra chinensis Baker (TST) against several carcinoma cell lines, including A549, MCF-7 and HeLa cells with the IC50 values of 4.11 μg/ml, 6.47 μg/ml and 7.78 μg/ml respectively. Treatment of A549 cells with TST resulted in growth inhibition and induction of apoptosis in a?time-dependent manners determined by cell viability, chromatin condensation, DNA fragmentation and flow cytometry analysis. The activities of caspase-3, 9 were significantly increased following TST treatment. Real-time PCR analysis showed that the mRNA expression levels of pro-apoptosis related genes including Bax, P21, P27 and P53 were markedly increased in the cells treated with TST but anti-apoptosis related gene Bcl-2 was slightly decreased. TST also leads to a?loss of mitochondrial membrane potential in a?time-dependent manner the release of cytochrome C?from mitochondria into the cytosol. Thus, these results suggest that TST may play an important role in tumor growth suppression by inducing apoptosis in human A549 cells via mitochondria-dependent apoptotic pathways and the TST would be promising to treat human lung adenocarcinoma. Keywords: Tupistra chinensis baker, total saponins, cytotoxicity, apoptosis, anticancer.     

红霉素对A549细胞中RV14介导的IL-6和IL-1β分泌的影响

目的 探讨红霉素(EM)对鼻病毒(RV14)介导的细胞因子产生和气道黏液高分泌的抑制作用.方法 EM预处理肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)3 h后,用RV14刺激细胞,然后采用ELISA检测细胞培养上清中细胞因子IL-6和IL-1β的浓度,并用western.印迹检测磷酸化p44/42MAPK信号分子变化情况.结果 EM明显抑制RV14介导的IL-6和IL-1β的产生和分泌(P＜0.01),并且对RVi4介导的p44/42MAPK的激活也有抑制作用(P＜0.01).结论 EM可有效抑制RV14介导的细胞因子的产生和分泌,并且这种抑制作用可能是通过阻断p44/42MAPK信号分子的激活来实现的.