上调miR-203表达对肝星状细胞增殖及胶原合成的影响

目的:观察上调mi R-203表达对肝星状细胞增殖活性及胶原合成的影响.方法:利用Lipofectamine?2000将miR-203模拟物(mimics)转染大鼠肝星状细胞(HSC-T6),培养48 h后,收集细胞提取总蛋白和总RNA,分别行Western blot和RT-qP CR,检测α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达;MTT(噻唑蓝)法检测细胞增殖活性.结果:与阴性对照组相比,mi R-203 mimics组α-SMA蛋白和mRNA表达分别下降75%和80%(均P0.01);Ⅰ型胶原蛋白表达下降56%(P0.01),mRNA表达下降48%(P0.05);Ⅲ型胶原蛋白与mRNA表达分别下降45%和60%(P0.05);HSC-T6细胞增殖活性下降20%±5%(P0.01).结论:上调mi R-203表达能显著抑制肝星状细胞增殖及胶原合成.     

长链非编码RNA GAS5通过调控miR-196 b-5 p抑制非小细胞肺癌细胞增殖侵袭迁移的机制

目的 研究长链非编码RNA(LncRNA)GAS5对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,探讨其作用机制.方法 运用qRT-PCR检测非小细胞肺癌细胞A549和肺支气管正常细胞16HBE中LncRNA GAS5、miR-196b-5p的表达;将miR-196b-5p组(转染miR-196b-5p mimics)、mi...     

miR-125a对肺癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的研究

目的探讨miR-125a在肺癌细胞增殖凋亡侵袭中的作用。方法以肺癌细胞A549、NCL-H661、NCL-H460、SPC-A-1和支气管上皮细胞HBE为研究对象,提取细胞RNA,反转录合成miR-125a的cDNA,RT-PCR检测细胞中miR-125a的表达水平。转染miR-125a inhibitor、inhibitor control、miR-125a mimics、mimics control到细胞A549中,MTT法检测细胞增殖情况,原位末端标记法检测细胞凋亡情况,Transwell小室检测细胞侵袭力。结果 miR-125a表达水平按照由大到小的顺序依次为:HBE、SPC-A-1、NCL-H460、NCL-H661、A549细胞,肺癌细胞中miR-125a表达水平均低于支气管上皮细胞HBE。miR-125a inhibitor组比inhibitor control组抑制率低(P0.01);miR-125a mimics组比mimics control组抑制率高(P0.01)。miR-125a inhibitor组比inhibitor control组凋亡率低(P0.05),miR-125a mimics组比mimics control组凋亡率高(P0.01)。miR-125a inhibitor组侵袭力比inhibitor control侵袭力强(P0.01);miR-125a mimics组侵袭力比mimics control侵袭力低(P0.01)。结论 miR-125a在肺癌细胞A549、NCL-H661、NCL-H460、SPC-A-1中低表达,miR-125a可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,降低细胞侵袭力。     

miR-34a逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性及其机制

目的探讨过表达miR-34a对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂(DDP)耐药性的影响及可能机制。方法成功构建过表达miR-34a的真核载体p CDNA3.1+miR-34a后,将A549/DDP细胞分为对照组(无转染)、空转染组(转染空质粒)和过表达组(转染p CDNA3.1+miR-34a),采用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测转染24、48、72及96 h后各组miR-34a水平;给予不同浓度DDP(2、4、8、16、32和64μg/ml)处理48 h后采用CCK-8法比较各组对DDP的敏感性,流式细胞仪PI/Annexin V双染法检测各组转染48、96 h后的凋亡率,分别采用Western印迹检测各组转染48、96 h后常见耐药基因的表达情况。结果 A549/DDP细胞的miR-34a水平均低于其亲本细胞A549和正常支气管上皮细胞系HBE(P0.05);与其余两组相比,过表达组转染后的miR-34a水平升高,且对A549/DDP细胞的增殖抑制率升高(P0.05);过表达组的半数抑制浓度均低于其余两组,过表达组转染48、96 h后的凋亡率高于其余两组,而转染48 h后的P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白1及肺耐药相关蛋白的水平低于其余两组(P0.05);对照组和空转染组以上指标的差异均无统计学意义(P0.05)。结论 A549/DDP细胞中miR-34a水平较低,通过真核载体将其过表达后可抑制增殖率并提高其对DDP的敏感性,可能与其诱导凋亡及降低耐药基因的表达有关。     

miR-944在食管鳞癌中的表达及其对Eca109细胞增殖、侵袭的影响

目的探讨miR-944在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中的表达与临床意义及其对食管癌细胞Eca109增殖和迁移能力的影响.方法收集36例经病理确诊的ESCC患者手术切除癌及癌旁组织,采用实时荧光定量PCR(realtime quantitative PCR,q RT-PCR)检测癌组织和癌旁组织中mi R-944表达,并分析mi R-944在不同临床病理资料之间的差异.脂质体法转染mi R-944 mimics、inhibitors、无关对照序列(negative control,NC)到Eca109细胞,q RT-PCR检测各组mi R-944表达水平,MTT法检测转染后24、48、72、96 h增殖能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果m i R-944在E S C C组织表达水平显著高于癌旁组织(P0.01).同时,mi R-944在癌症组织中的表达水平随患者TNM分期的升高而升高(P0.01),而淋巴结转移阳性组mi R-944表达水平显著高于阴性组(P0.01).与NC组相比,mi R-944 mimics和inhibitors转染组m i R-944表达水平显著升高和细胞增殖能力明显均增强,而inhibitors组均受到抑制(P0.01).结论mi R-944在ESCC组织表达上调,并与ESCC TNM分期和淋巴结转移相关,其可能通过促进癌细胞的增殖和侵袭能力参与ESCC的发生与发展.     

MiR-155对血管紧张素Ⅱ诱导小鼠主动脉血管平滑肌细胞表型转换的影响及机制研究

目的:观察mi R-155对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)表型转换的影响并研究其可能的机制。方法:原代培养小鼠VSMC,用不同浓度、时间AngⅡ作用于VSMC,然后用实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)检测不同处理组mi R-155表达的变化情况。用q RT-PCR检测过表达及抑制表达mi R-155后空白对照组、mi R-155 mimics组、mimics阴性对照组、mi R-155 inhibitors组、inhibitors阴性对照组的mi R-155水平变化情况,检测转染效率。用免疫蛋白印迹(Western blot)法检测过表达及抑制表达mi R-155后空白对照组、AngⅡ组、mi R-155mimics组、AngⅡ+mi R-155 mimics组、mi R-155 inhibitors组、AngⅡ+mi R-155 inhibitors组对AngⅡ激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)通路的影响。Western blot检测转染mi R-155、使用雷帕霉素、细胞外信号调节激酶1/2抑制剂(U0126)后空白对照、AngⅡ组、mi R-155 mimics组、AngⅡ+mi R-155mimics组、AngⅡ+U0126组、AngⅡ+雷帕霉组AngⅡ促进VSMC表型转换的影响,检测两个收缩表型蛋白标志物即平滑肌22α(SM22α)与α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin),及一个合成表型蛋白标志物骨桥蛋白(OPN)。结果:与作用0 h或0 mol/L AngⅡ相比,AngⅡ作用于VSMC后AngⅡ以浓度、时间依赖方式降低mi R-155的表达。转染mi R-155后可显著减少基础及AngⅡ促进m TOR与ERK1/2通路激活作用,而转染mi R-155抑制剂可进一步增加基础及AngⅡ促进m TOR与ERK1/2通路激活作用。雷帕霉素、U0126及转染mi R-155均可抑制AngⅡ减少收缩表型蛋白标志物SM22α与α-SM-actin的表达,同时抑制AngⅡ促进合成表型蛋白标志物OPN的表达。结论:AngⅡ通过抑制mi R-155表达促进m TOR与ERK1/2激活促进VSMC表型转换。     

microRNA195在心力衰竭的表达及其对心肌细胞增殖的影响

目的探讨micro RNA-195(mi R-195)在心力衰竭(心衰)患者的表达及其对心肌细胞H9C2增殖的影响。方法选取2015年3月~2015年7月于上海市第一人民医院56例心衰患者和40例正常人群血清标本为研究对象,利用Taqman探针实时定量PCR方法检测mi R-195的表达,用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将mi R-195类似物(mimic)转染到H9C2心肌细胞中,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和Ed U实验检测细胞增殖情况,Western blot检测其下游CDCA4蛋白的表达情况。比较心衰患者和正常人群血清及转染心肌细胞中mi R-195表达、分析mi R-195对心肌细胞增殖及CDCA4蛋白表达的影响。结果与正常人群相比,心衰患者血清中mi R-195表达量明显升高(P0.05),MTT结果显示在转染48、72、96 h后,转染mi R-195 mimic组细胞吸光值明显低于阴性对照组(P0.05)。Ed U结果显示mi R-195转染组细胞增殖受到明显抑制(P0.05)。Western blot结果显示mi R-195抑制心肌细胞中CDCA4蛋白表达。结论 mi R-195在心衰患者血清中表达水平升高,并且可能通过影响CDCA4的表达抑制H9C2细胞的增殖。     

慢病毒介导siRNA干扰尿路上皮癌相关基因1表达对人肺腺癌细胞系A549恶性行为的影响

目的探究干扰尿路上皮癌相关基因(UCA)1的表达对人肺腺癌细胞系A549恶性行为的影响。方法实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测人肺腺癌细胞系A549、H358、H1299、H460及人支气管上皮细胞系HBE中UCA1的表达情况;慢病毒转染表达针对UCA1的小干扰RNA(siRNA)的载体,同时转染空白载体于A549细胞中,分别作为干扰组及对照组细胞,RT-PCR检测两组细胞UCA1的表达情况,MTS实验检测两组细胞0、12、24、48及72 h的增殖能力,Transwell侵袭及迁移实验检测两组细胞转移能力,免疫印迹实验检测上皮间充质转化(EMT)相关分子E-钙黏蛋白(cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表达。结果 A549、H358、H1299、H460细胞系中UCA1的表达均显著高于HBE细胞系,差异有统计学意义(P0.05),且A549细胞系表达高于其他肺腺癌细胞系。干扰组细胞UCA1的表达显著低于对照组(P0.05),干扰效率73.2%。干扰组细胞48及72 h增殖能力显著低于对照组细胞(P0.05)。干扰组侵袭及迁移细胞数均显著低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。干扰组细胞E-cadherin表达相比对照组显著上调,而Vimentin表达相比对照组显著下调,差异有统计学意义(P0.05)。结论体外干扰UCA1的表达可通过下调A549细胞EMT进程抑制增殖及转移能力,UCA1可能是潜在的肺腺癌靶向治疗位点。     

miR-200通过靶向PD-L1抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的研究

目的探讨miR-200对非小细胞肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及其与程序性死亡受体配体-1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)的靶向关系。方法选取非小细胞肺癌细胞株A549,正常肺成纤维细胞HLF-1为研究对象,根据A549细胞转染物质的不同,分为NC组(未进行任何处理的A549细胞)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-200组(转染miR-200-mimic)、si-NC组(转染si-NC)、si-PD-L1组(转染si-PD-L1)、miR-200+pEGFP组(转染miR-200-mimic+pEGFP)及miR-200+pEGFP-PD-L1组(转染miR-200-mimic+pEGFP-PD-L1)。采用实时荧光定量PCR法检测细胞中miR-200表达水平;MTT检测细胞增殖能力;Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力;Western blot检测细胞PD-L1表达水平;荧光素酶实验验证miR-200与PD-L1的靶向关系。结果与HLF-1相比,A549细胞胞miR-200表达水平降低,PD-L1基因、蛋白表达升高(P0.05)。48和72 h时,miR-200组细胞活力、迁移和侵袭数量明显低于NC组、miR-NC组(P0.05)。48和72 h时,si-PD-L1组细胞活力、迁移和侵袭数量明显低于NC组、si-NC组(P0.05)。miR-200+pcDNA-PD-L1组细胞48、72 h时细胞活力、细胞迁移和侵袭数量高于miR-200+pcDNA组、miR-200组(P0.05)。与对照组相比,A549细胞PD-L1野生型质粒组荧光素酶活性明显降低(P0.05),PD-L1突变型质粒组荧光素酶活性无明显变化(P0.05)。结论 miR-200可负性调控PD-L1抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭。     

HIF-1α通过调控miR-544对A549肺癌细胞免疫逃逸及 NCR1/NKP46通路的影响

目的探究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在A549肺癌细胞免疫逃逸中的作用,并初步探究可能作用机制。方法体外培养A549肺癌细胞,转染si-HIF-1α质粒分为Control组、si-NC组、si-HIF-1α组;转染miR-544 mimics质粒分为Control组、NC组、miR-544 mimics组。免疫印迹法检测转染后细胞中HIF-1α蛋白表达;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法miR-544表达;将转染后三组细胞与NK-92MI细胞以靶效比1:5共培养,Elisa法检测培养液中干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)水平;CCK8法检测NK-92MI细胞免疫杀伤率;荧光素酶活性检测HIF-1α、miR-544(miR-544、NCR1)调控关系;流式细胞术检测细胞NKP46水平。结果与Control、si-NC组相比,si-HIF-1α组A549细胞中HIF-1α表达降低,共培养组细胞IFN-γ、IL-2、TNF-ɑ水平升高,NK-92MI细胞对A549细胞免疫杀伤率升高,miR-544表达升高(P0.05)。在HIF-1α3’UTR-Wt细胞中,与si-NC组相比,miR-544 mimics组荧光素酶活性降低(P0.05)。与Control、NC组相比,miR-544 mimics组IFN-γ、IL-2、TNF-ɑ水平降低,NK-92MI细胞对A549肺癌细胞免疫杀伤率降低,NCR1表达、NKP46比例降低(P0.05)。在NCR1 3’UTR-Wt细胞中,与NC组相比,miR-544 mimics组荧光素酶活性降低(P0.05)。结论体外抑制A549肺癌细胞中HIF-1α表达后能够促进NK细胞释放免疫因子,增强NK细胞免疫杀伤性,进而抑制A549细胞免疫逃逸,其作用可能与调控miR-544靶向抑制NCR1/NKP46通路实现的。     

同型半胱氨酸通过诱导miR-33激活NF-κB途径上调RAW264.7源性泡沫细胞TNF-α、IL-6的表达

目的研究同型半胱氨酸(Hcy)是否通过诱导mi R-33激活核因子κB(NF-κB)途径上调肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)的表达,促进炎症反应,加剧动脉粥样硬化(As)。方法 RAW 264.7源性巨噬细胞,经氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导为泡沫细胞后,分别将mi R-33 mimics和mi R-33 inhibitor转染入细胞内后每组给予5.0 mmol/L的Hcy干预;油红"O"染色确定泡沫细胞模型是否诱导成功; Western blot和实时定量PCR测定NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白和m RNA表达;高效液相色谱检测细胞内胆固醇含量。结果油红"O"染色后含脂滴的泡沫细胞被染成红色;与其它组相比,mi R-33 mimics组的NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白和m RNA表达均增高且细胞内的胆固醇含量增加(P0.05); mi R-33 inhibitor组的NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白和m RNA表达均降低且细胞内的胆固醇含量降低(P0.05);空白对照组、mi R-33 mimics对照组和mi R-33 inhibitor对照组间相比,所有检测指标均无统计学差异(P0.05)。结论 Hcy通过诱导mi RNA-33激活NF-κB途径上调TNF-α和IL-6的表达,增加炎症反应,促进动脉粥样硬化。     

Six1基因在肺癌组织表达水平及RNA干扰抑制其表达后对肺癌细胞生物学特性的影响

目的探讨Six1基因在肺癌组织表达及抑制其表达后对肺癌细胞增殖凋亡的影响。方法提取肺癌及癌旁组织蛋白,Western印迹检测Six1的表达; Six1-siRNA转染人肺癌A549细胞,分为空白组和阴性对照组(NC组)、Six1-siRNA组,转染48 h后通过Western印迹检测各组细胞Six1的表达; CCK8检测Six1-siRNA转染A549细胞24～72 h的细胞增殖;流式细胞术检测转染48 h的细胞凋亡率; Western印迹检测增殖相关蛋白细胞增殖核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)家族Bcl-2相关X蛋白(Bax)及Notch1信号通路Notch1和Hes1的蛋白表达。结果 Six1在肺癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0. 05); Six1-siRNA转染能明显降低A549细胞Six1的表达;与空白组比较,Six1-siRNA组细胞24～72 h的细胞增殖均显著降低,在48 h的细胞凋亡率显著升高,PCNA、Notch1和Hes1蛋白表达均显著降低,Bax蛋白表达显著升高(P<0. 05)。结论 Six1在肺癌组织中高表达,通过RNA干扰抑制其表达可通过下调Notch1信号通路降低肺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡,对细胞增殖凋亡的影响方式是下调PCNA和上调Bax蛋白表达。     

外源性干预VEGF-C表达对肺癌细胞生物学行为的影响及机制

目的 探讨外源性血管内皮生长因子-C(VEGF-C)对肺癌细胞生物学行为的影响及机制。方法 将A549细胞分为BK组、VC组及SC组,BK组不转染,VC组及SC组均于EP管中加入200μL转染液和4μL脂质体,VC组及SC组分别加入5μg NC mimics、5μg miR-21 mimics。转染72 h后,采用免疫印迹法检测A549细胞中TCAB1蛋白表达;MTT法检测A549细胞生存率;Transwell小室检测A549细胞侵袭情况;流式细胞仪检测A549细胞凋亡率。结果 SC组A549细胞中VEGF-C mRNA表达低于BK组、VC组（P均<0.05）,转染成功。BK组、VC组中VEGF-C mRNA表达相似（P>0.05）。干预12、24、48、72 h时,BK组与VC组A549细胞生存率比较差异无统计学意义（P均>0.05）;SC组A549细胞生存率低于BK组、VC组,组间比较差异有统计学意义（P均<0.05）。BK组与VC组A549细胞侵袭细胞数目比较差异无统计学意义（P>0.05）,SC组A549细胞侵袭细胞数目低于BK组、VC组,三组比较...     

miR-214对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及其机制

目的 探讨多发性骨髓瘤(MM)细胞中微小RNA-214(miR-214)的表达对瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及其机制。方法 采用RT-qPCR法检测MM细胞株IM-9、U266、Lp-1、H929及人正常浆细胞中miR-214的表达。取U266细胞，随机分为miR-214 mimics组和mimics-NC组，分别转染miR-214 mimics和mimics-NC至两组U266细胞，RT-qPCR法检测转染后两组细胞miR-214的表达差异采用平板克隆形成实验、CCK-8实验、流式细胞术分别检测转染后两组细胞集落形成数目，24、48、72、96 h时OD值以及凋亡率和细胞周期占比的差异，Western blotting法检测转染后两组细胞中FOXM1蛋白表达差异。结果 miR-214在IM-9、U266、Lp-1、H929细胞中的表达低于正常浆细胞(P均<0.05)。转染后，与mimics-NC组相比，miR-214 mimics组U266中miR-214表达升高(P<0.05)，集落形成数目下降(P<0.05),24、48、72、96 h时OD值降低(P均&l...     

miR-200c改善转化生长因子－β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化的机制

目的探讨miR-200c是否通过调节自噬缓解转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞纤维化。方法不同浓度(0、5、10、15、20、30 ng/ml)TGF-β1刺激HK2细胞48 h后倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8检测细胞增殖情况。选择致HK2细胞增殖最快的TGF-β1浓度(c)进行转染实验:细胞转染40 nmol/L无意义序列RNA(NC组);细胞转染40 nmol/L无意义序列RNA后c浓度TGF-β1处理细胞48 h(NC+T组);细胞转染40 nmol/L miR-200c mimics(M组);细胞转染40 nmol/L miR-200c mimics后c浓度TGF-β1处理细胞48 h(M+T组)。qRT-PCR检测miR-200c转染效率。Western blotting检测4组细胞Smad通路蛋白Smad2和Smad3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙黏蛋白(E-cad)表达量,以及自噬相关蛋白LC3(包括LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值)和P62。结果 10 ng/ml的TGF-β1刺激HK2细胞48 h后增殖最快,镜下细胞形态由正常的卵圆形铺路石状变为长梭形,纤维化形态最明显。qRT-PCR显示M组miR-200c表达量是NC组(212.42±12.25)倍(t=24.41,P=0.000),说明转染有效。Western blotting结果显示,与NC组比较,NC+T组加入10 ng/ml TGF-β1的HK2细胞Smad2、Smad3和α-SMA表达量增加,E-cad蛋白表达量降低(P0.05)。与NC+T组比较,M+T组Smad2、Smad3和α-SMA表达量减少,E-cad表达量增加(P0.05),提示miR-200c表达增加抑制了纤维化。进一步发现,M组较NC组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平增加,P62表达水平降低,提示自噬活性增加;M+T组较NC+T组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平增加,P62表达水平降低,提示miR-200c表达升高缓解了纤维化程度。结论 miR-200c可能通过激活细胞自噬缓解TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。     

三叶青黄酮通过调控miR-497表达对肺癌细胞增殖、凋亡的影响

目的 探讨三叶青黄酮(RTHF)对肺癌细胞增殖、凋亡的影响及其对miR-497的调控作用。方法 体外培养人肺癌细胞A549,加入不同剂量的RTHF处理细胞;miR-NC、miR-497 mimics转染至A549细胞,anti-miR-NC、anti-miR-497转染至A549细胞后加入RTHF处理细胞;采用噻唑蓝(MTT)实验与流式细胞术分别检测细胞增殖及细胞凋亡率;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肺癌组织、癌旁组织及各组A549细胞中miR-497的表达量;Western印迹法检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达量。结果 RTHF可明显提高细胞增殖抑制率、凋亡率及p21、Bax蛋白水平明显降低细胞周期蛋(Cyclin)D1、Bcl-2蛋白水平(均P<0.05);与癌旁组织比较,肺癌组织中miR-497的表达水平明显降低(P<0.05);RTHF可明显提高A549细胞中miR-497的表达水平(P<0.05);转染miR-497 mimics可明显提高细胞增殖抑制率与凋亡率及p21、Bax蛋白水平,明显降低Cyc...     

ROCK抑制剂Y-27632对TGF-β1介导的A549细胞上皮—间质转化的抑制作用

目的 探讨Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y-27632对转化生长因子-β1（TGF-β1）介导的A549细胞上皮一间质转化（EMT）的抑制作用.方法 将常规培养并传代的非小细胞肺癌A549细胞分为3组,分别为对照组、TGF-β1组（用TGF-β1诱导A549细胞发生EMT）、Y-27632组（对发生EMT的A549细胞行Y-27632干预）.采用MTr法检测各组细胞增殖情况;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;免疫细胞化学染色法检测波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（ot-SMA）表达;Western blot法检测E-钙黏蛋白、波形蛋白、α-SMA、ROCK、血清应答因子（SRF）、心肌相关转录因子（MATF-A）表达.结果 与对照组比较,TGF-β1组能诱导A549细胞发生EMT,伴有迁移能力提高、E-钙黏蛋白表达下调,以及波形蛋白、α-SMA、ROCK、SRF、MATF-A表达上调（P均＜0.05）;Y-27632组能显著抑制上述变化（P均＜0.05）.结论 Y-27632能通过阻断ROCK蛋白表达,抑制TGF-β1介导的A549细胞发生EMT,并抑制其迁移能力.     

miR-202调控GLI-2干预肺癌A549细胞的增殖和凋亡

目的探讨miR-202对肺癌A549细胞增殖和凋亡的调控作用及其相关机制。方法培养肺腺癌A549细胞和肺正常上皮BEAS-2B细胞,利用Real time-PCR检测miR-202在上述细胞中的表达水平;合成并将miR-202 minic和miR-NC转染进入A549细胞后,应用MTT检测12、24、48 h时细胞的抑制率,使用流式细胞术检测转染后48 h细胞的凋亡情况,利用western blot检测GLI-2蛋白的表达情况;构建野生型和突变型GLI-2 3'UTR插入p MIR-REPORTTMluciferase vector载体,并将其与pRL-TK质粒共转染进入A549细胞,之后分别将等量的pre-miR-202和miR-NC再转染进入A549细胞,利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测萤火虫和海肾荧光素酶活性。结果 miR-202在A549细胞中的相对表达量显著低于在BEAS-2B细胞中的表达量(P0.01);miR-202 minic组在12、24、48和72 h的细胞抑制率显著高于对照组和miR-NC组(P0.01);miR-NC组在72 h时细胞抑制率显著高于对照组(P0.01)。此外,miR-202 minic组细胞凋亡率显著高于miR-NC和对照组(P0.01),并且miR-NC组的细胞凋亡率显著高于对照组(P0.01)。荧光素酶报告基因结果说明GLI-2是miR-202的靶基因。miR-202minc转染A549细胞后可显著降低GLI-2蛋白的表达,而miR-NC组与对照组相比较,GLI-2蛋白表达无显著差异。结论 miR-202通过下游靶基因GLI-2调控肺癌A549细胞的增殖和凋亡,其可作为治疗肺癌的潜在靶点。     

微小RNA34a下调沉默信息调节因子1抑制内皮祖细胞功能的机制研究

目的分析氧化应激过程中微小RNA34a(mi R-34a)下调沉默信息调节因子1(SIRT1在内皮祖细胞功能障碍中的机制。方法本实验采用不同浓度的过氧化氢(H_2O_2)处理内皮祖细胞,通过CCK-8检测细胞的存活率;运用化学合成的方法合成mi R-34a模拟物、mi R-34a抑制物及其各自对照组转染至内皮祖细胞后,并用500μM H_2O_2刺激,用RT-PCR验证mi R-34a表达水平,利用流式细胞仪检测H_2O_2刺激mi R-34a诱导细胞凋亡情况,通过q RT-PCR方法和Western blot技术检测SIRT1中m RNA和蛋白的表达水平。结果 CCK-8检测发现,细胞存活率随着H_2O_2浓度的增加而逐渐降低,呈现浓度依赖性;与不加H_2O_2相比,加入100、200、500和800μM的H_2O_2细胞存活率分别为94%±2%、85%±2%、78%±2%和32%±1%,差异具有统计学意义(F=16. 3,P<0. 001)。H_2O_2刺激内皮祖细胞后,转染mi R-34a模拟物的表达水平高于其对照组(t=16. 0,P=0. 003),转染mi R-34a抑制物的表达水平低于其对照组(t=53. 0,P=0. 000)。通过细胞凋亡检测mi R-34a模拟物组细胞凋亡率明显升高(t=30. 4,P<0. 001),mi R-34a抑制物组细胞凋亡率明显降低(t=8. 7,P<0. 001)。q RT-PCR结果显示,mi R-34a模拟物组中的靶基因SIRT1相对表达量低于其对照组(t=87. 7,P<0. 001),mi R-34a抑制物组中的靶基因SIRT1相对表达量高于其对照组(t=125. 0,P<0. 001)。Western blot结果显示mi R-34a的模拟物与其对照组相比,SIRT1蛋白表达量明显下降(t=4. 1,P=0. 014),而mi R-34a的抑制物与其对照组相比,SIRT1蛋白表达明显增高(t=7. 1,P=0. 002)。结论在氧化应激状态下,使用mi R-34a的模拟物及抑制物可以调节mi R-34a的表达,改变SIRT1中蛋白的表达。内皮祖细胞功能障碍可能与mi R-34a水平升高及其靶蛋白SIRT1的表达下降相关。     

沉默miR-135a-5p对宫颈癌细胞增殖、侵袭的影响及作用机制

目的 探究沉默微小RNA-135a-5p(miR-135a-5p)对人宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响，重点分析miR-135a-5p在宫颈癌HeLa细胞中的作用机制。方法 将宫颈癌HeLa细胞经培育后分为对照组、过表达组、沉默组，对照组不做处理，过表达组转染miR-135a-5p mimics上调载体，沉默组转染miR-135a-5p inhibitor下调载体。使用实时荧光定量法检测每组宫颈癌HeLa细胞中miR-135a-5p表达量；四甲基偶氮唑盐法检测每组宫颈癌HeLa细胞增殖水平；Transwell小室法检测每组宫颈癌HeLa细胞侵袭水平。结果 与对照组比较，过表达组(24 h、48 h、72 h)宫颈癌HeLa细胞增殖能力、miR-135a-5p、宫颈癌HeLa细胞迁移数、侵袭数明显升高，宫颈癌HeLa细胞凋亡能力明显降低(P<0.05);与对照组比较，沉默组(24 h、48 h、72 h)宫颈癌HeLa细胞增殖能力、迁移数、侵袭数、miR-135a-5p明显降低，凋亡能力明显升高(P<0.05);与过表达组比较，沉默组(24 h、48 h、72 ...