Toll样受体与结核病的免疫反应

结核分枝杆菌是结核病的致病菌.目前机制尚未完全明确.Toll样受体(Toll-like recepTIR)能够感知结核杆菌感染,同时对先天免疫和获得性免疫都具有调控作用.与抗结核有关的主要是TLR2、TIR9和TLR4.但是,结核杆菌也能够利用TLR逃避免疫监视,促进慢性感染.对TIR的研究有助于阐明结核分枝杆菌诱导先天免疫反应机制,并为治疗方法提供新的思路.     

甲泼尼龙对慢性咳嗽患者诱导痰巨噬细胞中Toll样受体2表达的影响

目的 探讨Toll样受体2(TLR2)在慢性咳嗽患者诱导痰巨噬细胞中的表达与气道炎症的关系以及甲泼尼龙对TLR2表达的影响.方法 收集2008年9月至2010年3月泸州医学院附属医院呼吸科门诊的慢性咳嗽患者86例,其中咳嗽变异性哮喘(CVA)组31例,上气道咳嗽综合征(UACS)组14例,嗜酸细胞性支气管炎(EB)组16例,胃食管反流性咳嗽(GERC)组25例.对照组为20名健康志愿者.各组均行痰液诱导检查,HE染色,免疫荧光染色测定TLR2表达,酶联免疫吸附法(ELISA)测定诱导痰上清液中细胞因子的浓度.结果 (1)CVA、UACS、EB和GERC各组患者诱导痰中细胞总数[分别为(3.4±1.1)×106/L、(2.6±0.6)×106/L、(2.6±0.6)×106/L、(2.7±0.5)×106/L]均明显高于对照组[(1.4±0.6)×106/L],差异均有统计学意义(均P＜0.01);分类计数显示以上4组痰中巨噬细胞比例(分别为0.35±0.04、0.40±0.06、0.38±0.04、0.43±0.05)均明显低于对照组(0.63±0.08);中性粒细胞比例(分别为0.52±0.06、0.58±0.06、0.52±0.04、0.54±0.06)明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).CVA和EB组患者嗜酸细胞比例(分别为0.115±0.054和0.099±0.034)明显高于其他各组,差异有统计学意义(均P＜0.01),但两组间差异无统计学意义(t=1.18,P＞0.05).(2)CVA、UACS、EB和GERC各组患者诱导痰上清液白细胞介素-8浓度[分别为(7.0±1.2)μg/L、(10.2±3.1)μg/L、(6.3±1.9)μg/L、(7.7±2.5)μg/L]和肿瘤坏死因子-α浓度[分别为(30±11)ng/L、(46±16)ng/L、(2l±5)ng/L、(33±15)ng/L]明显高于对照组[分别为(1.6±0.8)μg/L和(13±6)ng/L],差异均有统计学意义(均P＜0.01).(3)CVA、UACS、EB和GERC各组患者诱导痰上清液中白细胞介素-8与痰中中性粒细胞数呈正相关(r值分别为0.628、0.816、0.769、0.733,均P＜0.05);CVA、UACS、EB和GERC各组患者诱导痰上清液中肿瘤坏死因子-α与痰中中性粒细胞数呈正相关(r值分别为0.579、0.865、0.730、0.755,均P＜0.05).(4)CVA、UACS、EB和GERC各组患者诱导痰巨噬细胞TLR2表达量(56±15、38±7、65±17、27±4)明显低于对照组(135±14),甲泼尼龙可上调以上各组患者诱导痰巨噬细胞中TLR2(75±17、53.29±16、94±30、41±5)的表达.结论 CVA、UACS、EB和GERC等慢性咳嗽患者诱导痰巨噬细胞中TLR2的表达下降,甲泼尼龙可上调巨噬细胞TLR2的表达.

Abstract：

Objective To explore the relationship between airway inflammation and Toll-like receptor 2 ( TLR2 ) expression on macrophages in induced sputum from chronic cough patients, and to observe the effect of methylprednisolone on this receptor. Methods Eighty-six outpatients with chronic cough were enrolled in this study from the respiratory department in the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College from September 2008 to March 2010. These diseases were diagnosed according to the guideline of Chinese Society of Respiratory Diseases in 2005, excluding severe liver, heart and kidney pathology and pregnant women. Among 86 cases, 31 were cough variant asthma ( CVA), 14 upper airway cough syndrome (UACS), 16 eosinophilic bronchitis (EB) and 25 gastroesophageal reflux (GERC). Twenty healthy volunteers were included as controls. Induced sputum was collected and cell counts were analyzed. TLR2 expression on macrophages was determined by immunofluorescence staining. Cytokine levels were measured with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results (1) The total inflammatory cells [(3.4±1.1) ×106/L, (2.6 ±0.6)×106/L, (2.6±0.6)×106/L, (2.7±0.5) × 106/L] and neutrophils (0.52±0.06, 0.58 ±0.06, 0.52±0.04, 0.54 ±0.06) in induced sputum from CVA, UACS, EB and GERC were significantly increased(t value = 5.27, 4.09, 3. 16, 3.92 and 3.62, 3.49, 4.82, 6.17respectively, all P＜0.01 ), with decreased macrophages (0.35±0.04, 0.40±0.06,0.38±0.04,0.43 ±0. 05) in comparison with the control group (t value =4. 76,5.24,4. 57,3. 18, all P ＜0. 01 ). There was a significant increase in eosinophils(0.118±0.054,0.099±0.034) in CVA and EB group (t value =4.46,3.87,5. 19 and 3.51,4. 06,4. 38 respectively, all P＜0.01). (2) The concentration of IL-8[(7.0±1.2)μg/L,(10.2±3.1)μg/L,(6.3±1.9)μg/L,(7.7±2.5)μg/L] and TNF-α[(30 ± 11)ng/L, (46±16)rng/L, (21 ±5)ng/L, (33 ± 15)ng/L] from induced sputum in CVA, UACS, EB and GERC groups were significantly increased, compared with the control group( t value =4. 58,3.67,4. 26,5. 39 and 5.16,3.97,4. 59,3.34 respectively, all P ＜ 0.01 ). (3) The concentration of IL-8 was positively correlated with neutrophils in each group( R value = 0.628,0. 816,0. 769 and 0. 733 respectively, all P＜0. 05 ). The concentration of TNF-o was also positively correlated with neutrophils in each group ( R value = 0. 579,0. 865,0. 730 and 0. 755 respectively,all P ＜ 0. 05 ). (4) The expression of TLR2 ( 56 ± 15,38 ± 7,65 ±17,27 ±4) on macrophages in CVA, UACS,EB and GERC was significantly decreased. The expression of TLR2 (75±17, 53±16,94±30,41±5 ) on macrophages was enhanced by methylprednisolone.Conclusions The expression of TLR2 on macrophages from induced sputum in CVA, UACS, EB and GERC was decreased, but could be enhanced by methylprednisolone, suggesting that TLR2 might play a regulatory role in airway inflammatory response.     

脂多糖对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达及炎性因子分泌的影响

目的 探讨脂多糖刺激大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞Toll样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白-2(MD-2)mRNA表达和炎性因子分泌的影响,以及MD-2小干扰RNA(MD-2 siRNA)对脂多糖刺激下NR8383细胞炎性因子分泌的作用.方法 体外培养NR8383细胞,以不同浓度脂多糖(0.01～10 mg/L)刺激2 h,以1 mg/L脂多糖刺激2～24 h.运用脂质体Lipofectamine 2000将MD-2siRNA转染至细胞.半定量RT-PCR方法检测细胞TLR4和MD-2 mRNA的表达,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-1β的含量.统计学处理采用单因素方差分析、独立样本t检验和Pearson相关分析.结果 对照组NR8383细胞TLR4和MD-2mRNA的相对表达量分别为0.52±0.05和0.44±0.09,0.01 mg/L浓度脂多糖刺激前后表达量无明显改变,0.1 mg/L浓度时表达增加,随脂多糖浓度的升高表达量进一步增加,10 mg/L刺激后相对表达量分别为0.72±0.06和0.65±0.10(F=17.26、6.04,P<0.01);TNF-αIL-6和IL-1β含量具有类似改变趋势,对照组分别为(25.8±3.4)ng/L、(62.4±4.7)ng/L和(31.6±1.7)ng/L;在10 mg/L脂多糖刺激下分别增加至(58.9±5.3)ng/L、(96.5±3.9)ng/L和(55.4±5.4)ng/L(F=29.55、54.47、31.45,P<0.01).在1 mr/L脂多糖刺激下,TLR4和MD-2 mRNA的表达量在2 h后明显增加,6 h达高峰,8 h开始回落,至24 h时仍高于基础值(F=5.28、4.11,P<0.01);TNF-α、IL-6和IL-1β含量具有类似变化(F=10.64、11.23、17.58,P<0.01),其中TNF-α和IL-1β含量在6 h达高峰,持续至8 h,IL-6含量在8 h达高峰,持续至12 h.TLR4和MD-2 mRNA表达呈正相关(r=0.513,P<0.01).MD-2 siRNA对NR8383细胞MD-2基因的干扰效率为67%,在脂多糖刺激下干扰组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平未见明显升高.结论 高浓度脂多糖可较长时间上调大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞TLR4和MD-2基因的表达,并促进TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌.MD-2 siRNA可抑制脂多糖刺激下NR8383细胞分泌TNF-α、IL-1 β和IL-6.     

Toll样受体2基因敲除对高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织凋亡的影响

目的分析Toll样受体(TLR)2敲除对高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织凋亡的影响。方法 C57BL/6J小鼠和TLR2基因敲除小鼠各16只,分为两组,给予普通饮食和高脂饮食喂养:正常对照组(NC)、肥胖组(OB)、TLR2基因敲除组(TK)和TLR2基因敲除肥胖组(TO)。16 w后检测各组空腹血糖(FPG),三酰甘油(TG),总胆固醇(TC),低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平及脂肪组织caspase3活性,bcl2和bax蛋白、mRNA表达量。结果与NC组相比,OB组小鼠脂肪组织caspase3活性升高,bax蛋白和mRNA水平升高,bcl2蛋白和mRNA水平降低;与OB组相比,TO组小鼠脂肪组织caspase3活性降低,bax蛋白和mRNA水平降低,bcl2蛋白和mRNA水平升高。结论 TLR2敲除减轻了高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织的细胞凋亡。     

Toll样受体与结核病保护性免疫反应的研究进展

迄今为止已发现10种Toll样受体,它们有相应的配体。Toll样受体在机体组织细胞如胃肠道和呼吸道中广泛分布,在机体防御病原体感染中发挥重要作用。结核分枝杆菌有许多病原体相关的分子位点如19kD脂蛋白、阿拉伯糖甘露聚糖酯和磷脂酰肌醇甘露聚糖等,它们可被Toll样受体识别并相互结合,发挥生物学效应,如调节树突状细胞的成熟、诱导巨噬细胞凋亡、促进Th1细胞反应、诱生抗菌活性物质的释放等,即产生针对结核菌感染的保护性免疫反应。     

Toll样受体及其在抗结核感染免疫中的作用

Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)是表达在哺乳动物细胞表面的一类重要的模式识别受体,是进化中比较保守的一个受体家族,TLR能特异地识别病原体相关分子模式,不仅在激活天然免疫中发挥着莺要的作用,而且还调节获得性免疫,是连接天然免疫与特异性免疫的主要桥梁.研究表明,TLR是介导宿主对结核杆菌的识别及抗结核免疫反应的关键分子,与抗结核感染免疫有关的主要是TLR2和TLR4.对TLR的研究有助于阐明结核病的发病机制并为其治疗提供崭新的策略.     

Toll样受体在结核分枝杆菌致病机制中的作用研究进展

结核分枝杆菌是肺结核的致病菌,它可寄生在细胞内并长期存活.目前结核杆菌的致病机制及机体对其的免疫反应尚未完全阐明.Toll样受体属于模式识别受体,在结核杆菌宿主防御反应中具有极为重要的作用.Toll样受体作为连接天然免疫与获得性免疫的"桥梁",在机体免疫调节中的作用已愈来愈受关注.关于Toll样受体与结核杆菌的相关研究已成为生命科学领域的热点.     

Toll样受体在结核分枝杆菌致病机制中的作用研究进展

结核分枝杆菌是肺结核的致病菌,它可寄生在细胞内并长期存活.目前结核杆菌的致病机制及机体对其的免疫反应尚未完全阐明.Toll样受体属于模式识别受体,在结核杆菌宿主防御反应中具有极为重要的作用.Toll样受体作为连接天然免疫与获得性免疫的"桥梁",在机体免疫调节中的作用已愈来愈受关注.关于Toll样受体与结核杆菌的相关研究已成为生命科学领域的热点.     

Toll样受体在结核分枝杆菌致病机制中的作用研究进展

结核分枝杆菌是肺结核的致病菌,它可寄生在细胞内并长期存活.目前结核杆菌的致病机制及机体对其的免疫反应尚未完全阐明.Toll样受体属于模式识别受体,在结核杆菌宿主防御反应中具有极为重要的作用.Toll样受体作为连接天然免疫与获得性免疫的"桥梁",在机体免疫调节中的作用已愈来愈受关注.关于Toll样受体与结核杆菌的相关研究已成为生命科学领域的热点.     

Toll 样受体9对巨噬细胞脂周素2表达的影响

目的研究ODN1826对巨噬细胞脂周素2表达的影响,并揭示其调控的相关分子机制。方法应用半定量PCR和免疫印迹法分别测定ODN1826对脂周素2 mRNA和蛋白水平表达影响。应用荧光素酶活性分析方法检测ODN1826对脂周素2启动子活性的影响。结果 ODN1826以剂量和浓度依赖方式上调脂周素2 mRNA和蛋白水平表达,并且通过Ets/AP-1位点促进脂周素2启动子活性。结论在巨噬细胞中,TLR9信号显著诱导了脂周素2 mRNA和蛋白的表达,并且脂周素2启动子区域的Ets/AP-1位点参与了这一诱导过程。     

巨噬细胞内表达的人颗粒溶素对胞内结核分枝杆菌的杀菌活性

目的 构建携带人颗粒溶素(GLS)的真核表达质粒并探讨其表达后对巨噬细胞RAW264.7内结核分枝杆菌的杀菌能力.方法利用套式PCR从同种异型抗原激活的人CTL中扩增出GLS基因,并克隆入pBudCE4.1载体,构建重组质粒.将其转染至感染结核分枝杆菌H37Rv的巨噬细胞株RAW264.7中,套式PCR、免疫荧光检测GLS表达;转染96 h后裂解细胞作抗酸染色及菌落计数,检测GLS细胞内直接杀菌活性.数据行t或t'检验.结果成功构建携带GLS的真核表达质粒pBudCE4.1/GLS;在转染的已感染H37Rv巨噬细胞株RAW264.7中,从转录和翻译水平都检测到目标基因GLS的表达产物;转染96 h,佛波酯+pBudCF4.1/GLS组、佛波酯+pBudCE4.1组与未激活初始巨噬细胞荷菌量分别为(1.44±1.25)、(3.16±0.20)和(3.59±0.21)个,两两比较,差异均有统计学意义(t=2.403,t=2.854,均P＜0.05).结论携带人GLS的真核表达质粒在巨噬细胞表达后具有明显的杀菌活性,为进一步作为结核基因治疗疫苗的应用提供了实验依据.     

表达结核分枝杆菌热休克蛋白16.3的U937细胞蛋白组学分析

目的 研究表达Hsp16.3蛋白与不表达Hsp16.3蛋白的巨噬细胞中蛋白表达的差异,探讨MTB潜伏感染的细胞与正常细胞蛋白质表达的差异.方法 利用双向电泳技术,对表达MTB蛋白Hsp16.3与不表达Hsp16.3蛋白的巨噬细胞U937全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析,利用质谱技术对其中5个表达明显差异的蛋白质斑点进行分析鉴定.结果 获得了明确的肽质量指纹图谱,通过在数据库中进行检索分析,确定6个差异蛋白质(其中1个差异蛋白质斑点分析得到2种蛋白质),分别为热休克蛋白70s、肌动蛋白、延伸因子1、肽基脯氨酸顺反异构酶、泛素结合酶E2和乳酰谷胱甘肽裂解酶.结论 差异蛋白的发现有助于了解MTB特异性蛋白入侵早期导致的巨噬细胞蛋白质组表达的变化,为深入研究巨噬细胞和MTB特异性蛋白相互作用的分子机制奠定基础.     

结核分支杆菌诱导宿主细胞肌动蛋白重排和表达改变

目的：研究结核分支杆菌感染对宿主细胞肌动蛋白的影响。方法：应用共聚焦显微镜及Western blot技术观察被结核分支杆菌H37Ra、H37Rv感染的巨噬细胞在感染后6h、12h和24h纤丝状肌动蛋白（F－肌动蛋白）的形态分布及肌动蛋白表达变化。同时用未感染及H37Rv死菌处理的巨噬细胞作对照。结果：结核分支杆菌H37Ra、H37Rv感染巨噬细胞后诱导宿主细胞F－肌动蛋白聚集并抑制肌动蛋白的表达，有毒株H37Rv较无毒株H37Ra能更早地产生这种效应，而用H37Rv死菌处理的巨噬细胞肌动蛋白不受影响。结论：结核分支杆菌在感染宿主细胞的过程中，可能通过分泌某些蛋白或因子影响细胞的肌动蛋白，达到逃避宿主细胞杀伤的目的。     

miR-20a-5p调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡相关基因表达的研究

目的 明确小非编码RNA(microRNA,miR-20a-5p)对结核分枝杆菌(MTB)诱导人巨噬细胞凋亡相关基因表达的调控作用。方法 构建可表达或抑制miR-20a-5p、转染miR-20a-5p抑制剂(miR-20a-5p-inhibitor,简称“miR-20a-5p-inh”)、作为慢病毒载体的阴性对照(LV1-NC)的慢病毒载体,由oligo-dT引物通过固相亚磷酰胺法合成茎环寡核苷酸,并克隆到含绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体pGLV3-GFP内,将构建的miR-20a-5p、miR-20a-5p-inh、LV1-NC转染THP-1人巨噬细胞3h,培养72h后用流式细胞仪分选出GFP+THP-1细胞,并分别采用减毒MTB菌株(H37Ra)感染8h和过氧化氢(H₂O₂)处理30min 两种方法诱导。通过实时定量PCR技术测定细胞中线粒体相关抗凋亡基因Bcl-2,以及促凋亡基因Bax、Bim和Bad的转录水平。同时,用蛋白免疫印迹法检测细胞裂解物中相关蛋白的表达。结果 慢病毒转染细胞后,在无刺激的THP-1细胞中miR-20a-5p的相对荧光强度值为12.21±1.29、miR-20a-5p-inh为9.68±1.38、LV1-NC为10.64±0.96,三者的表达差异均无统计学意义(q=1.815,P=0.385;q=2.072,P=0.602);但在H37Ra和H₂O₂的刺激后,miR-20a-5p过表达时其相对荧光强度值分别为7.20±0.53、8.55±0.82,明显高于LV1-NC (4.46±0.07、5.49±0.44)(q=50.250,P=0.007;q=1.041,P<0.01),miR-20a-5p受抑制时(1.88±0.08、1.44±0.21)明显低于LV1-NC(q=3.457,P=0.031;q=4.384,P=0.001)。在感染miR-20a-5p慢病毒的THP-1细胞中,H37Ra诱导Bcl-2的表达增加(相对荧光强度值由10.67±0.89增至14.98±0.88)(q=1.064,P=0.008),而感染miR-20a-5p-inh慢病毒时Bcl-2表达减少(由10.67±0.89降至6.49±0.47)(q=3.518,P=0.003);在miR-20a-5p过表达的THP-1细胞中Bim的转录水平减少(由1.22±0.05降至0.98±0.04)(q=1.240,P=0.011),当miR-20a-5p受抑制时Bim的转录水平增加(由1.22±0.05增至1.51±0.08)(q=2.460,P=0.021)。蛋白印迹法检测凋亡相关基因Bcl-2和Bim的蛋白表达水平,结果与基因转录水平相符。 结论 miR-20a-5p的表达水平影响MTB诱导的巨噬细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bim的表达,并且与促凋亡基因Bim的水平呈负相关,提示miR-20a-5p可能通过调控Bim的表达而影响细胞凋亡。     

筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的研究

目的建立SELEX技术筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的方法,并获得CFP-10的高亲和性适体。方法体外构建长度为78个碱基的随机单链DNA（ssDNA）文库,以微孔板为筛选介质,采用SELEX技术筛选获得CFP-10的适体库。将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用酶联寡核苷酸吸附试验（enzyme-linkedoligonucleotide sorbent assay,ELOSA）测定亲和力。结果构建的ssDNA文库经过14轮筛选与CFP-10亲和力从0.273提高到1.265;克隆子测序,大多数长度与预期值相符。二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与CFP-10结合的结构基础。结论成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了CFP-10的高亲和性适体。     

TLRs在结核杆菌感染中的作用的研究进展

结核病是全球范围内最严重的感染性疾病之一,其防治形势日趋严峻。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是一类重要的天然模式识别受体,在机体抵御微生物的固有免疫反应中发挥重要作用。研究表明,TLRs是介导宿主对结核杆菌识别及抗结核免疫反应的关键分子。现对TLRs在结核杆菌感染中的研究进展进行综述,有助于阐明结核病的发病机制并为其治疗提供新的策略。     

重组结核分枝杆菌蛋白筛查结核分枝杆菌感染的试验研究

.0,均P>0.05).38000蛋白皮肤试验阳性反应直径多为5～9 mm,PPD试验阳性反应直径多为5～14 mill.结论 38000蛋白有望用于MTB感染的筛查.     

杭州市1 731株结核分枝杆菌耐药状况分析

目的 了解杭州市区县范围内耐药结核病的流行状况。方法 采用浓度比例法和PNB/TCH生长实验对2018年1月至2019年12月分离自杭州市周边7个县区的1 975份肺结核病人的培养菌株进行药物敏感性实验和菌种鉴定,并用统计学方法分析耐药谱和耐药率。结果 1 731株结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)中, 18.26%(316/1 731)菌株至少对一种受试药物耐药,一线药物、二线药物、单耐药、多耐药、耐多药、广泛耐药、利福平耐药的耐药率分别是14.96%(259/1 731)、4.97%(86/1 731)、11.84%(205/1 731)、3.81%(66/1 731)、2.60%(45/1 731)、0.06%(1/1 731)、3.24%(56/1 731),共28种耐药谱。初治患者耐药率与复治患者耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。比较2011年、2015年、2018-2019年这3个时间段,一线药物的总耐药率、初治患者耐药率、复治患者耐药率以及耐多药的总耐药率和复治耐药率均呈现下降趋势(均P<0.05)。二线药物OFX的总耐药率和初治患者耐药率较2015年升高(P<0.05)。60岁以上的结核病患者占比最大(47.95%)。7个区县的耐药率存在差异。结论 2011-2019年杭州市区县结核病定点医院收治的结核病人的耐药率逐年下降,目前采取的防控措施切实有效。今后要重点关注耐药率较高区县的耐药病人和40~60岁耐药病人的治疗和管控,加强老年人结核病的防控。