脂肪干细胞复合脱细胞真皮基质用于声带注射的实验研究

Objective To explore the feasibility of adipose-derived stem cells (ASC) combined with micronized acellular dermal matrix (MADM) for vocal cord injection. Methods The adipose-deprived stem cells were harvested from rabbit adipose tissue in vitro. The 3rd generation of ASC was labeled with DiI ( 1, 1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) and cultured with MADM to form a complex. The adhesion of ASC to MADM was observed by fluorescence microscope and electron microscope.The proliferation of ASC on MADM was evaluated by 3-(4, 5-dimethylthizazol-2-yl)-5-( 3-carboxy methoxyphenyl)-2-(4-sulfonyl )-2H- tetrazolium, inner salt (MTS). Three days after the culture, the complex was mixed with appropriate amount of collagen, and then injected into the unilateral vocal cord of the rabbit. The animals were sacrificed 2, 4, 8 weeks after injection, the survival time and distribution of ASC in vocal fold were tested, and the responses of vocal cord to ASC-MADM and the degradation of MADM were observed. Results The ASC adhered to MADM and grew well (P ＜0. 05 or ＜0. 01 ), showing good compatibility with MADM in vocal cord tissue. The complex of ASC-MADM could be injected into the rabbit vocal cords, while no adverse reactions was observed in the vocal cord by endoscope, frozen section and HE staining. ASC could survive for 8 weeks in vocal cords, and no inflammatory cell infiltration was observed.Conclusions MADM is an ideal scaffold material and shows perfect compatibility with ASC which can adhere and proliferate well on it. The complex of ASC-MADM can be injected into the vocal cord and can survive. There is no adverse reaction in vocal cords.     

自体脂肪间充质干细胞移植促进声带修复再生的实验研究

目的 探讨自体脂肪间充质干细胞移植入损伤声带后的生长分布及对声带固有层及其主要细胞外基质变化的影响特点.方法 对34只实验用兔(68侧声带)的53侧声带进行全麻支撑喉镜下声带锐性损伤.分离培养、鉴定及定向诱导20只实验用兔脂肪间充质干细胞.将自体脂肪间充质干细胞植入20侧损伤声带后,示踪观察脂肪间充质干细胞在声带固有层内的生长分布;同时以单纯支架(胶原或透明质酸凝胶)植入18侧受损声带(胶原10侧,透明质酸8侧)及单纯损伤15侧声带作为对照组.术后15 d～12个月时采用HE染色、Masson染色、Alcian Blue染色及免疫组化染色观察声带形态学变化及声带固有层胶原、透明质酸、纤维连接蛋白的含量及分布变化.结果 脂肪间充质干细胞呈梭形贴壁生长,具有多向分化潜能,植入损伤兔声带后持续分布于声带固有层.损伤声带在脂肪间充质于细胞植入6个月时形态接近正常,12个月时部分组织学结构类似正常;声带细胞外基质中的胶原于植入3个月内含量有增高趋势,无序分布于固有层,后逐渐减少至正常水平附近,12个月时部分分布略显不规则;透明质酸于植入40 d含量亦有增高趋势,分布于固有层各层,6个月含量减至正常水平附近,局限于固有层浅中层;纤维连接蛋白于植入后始终在固有层内散在分布,含量在40 d内有增高趋势,后逐渐减少,12个月时含量接近正常.单纯声带损伤3个月后局部开始出现瘢痕挛缩,以胶原纤维为主的大量纤维组织增生,12个月时仍紊乱分布于声带固有层各层.单纯支架植入组变化介于二者之间.结论 脂肪间充质干细胞植入兔损伤声带后具有促进声带细胞外基质分泌、合理分布及部分有序化排列的功能,具有促进声带修复再生的作用.     

人胶原和自体脂肪声带注射的实验研究

目的 探讨国产人胶原狗声带注射的组织学转归及其在矫治声门闭合不全中的应用价值和前景。     

人胶原和自体脂肪声带注射的实验研究

目的探讨国产人胶原狗声带注射的组织学转归及其在矫治声门闭合不全中的应用价值和前景。方法实验动物分为４组，Ａ组２只分别注射人胶原和自体脂肪矫正左侧声带麻痹引起的声门闭合不全，并对治疗效果进行主、客观观察，术后５个月取材，透射电镜观察。Ｂ、Ｃ、Ｄ组９只狗（每组３只）于右侧声带注入人胶原、左侧声带注入自体脂肪各０．３ｍｌ，分别于术后１、３、５个月取材并观察其组织学变化和体积变化。结果自体脂肪能在声带组织中存活，但吸收率很高，１、３、５个月体积平均减少速度为３８．５１％，疗效不能持久。人胶原易于注射，组织相容性好，并能被宿主成纤维细胞和血管移生，同时伴有宿主胶原的再生，显示出最终被宿主组织完全取代的趋势，１～５个月体积平均减少速度为０．６５％。矫治效果长期稳定。结论自体脂肪应用有局限性，只能作为短期的声带植入材料；人胶原可用于各种原因所致声门闭合不全的长期矫治材料，具有良好的应用前景。     

自体脂肪、筋膜移植用于声带填充术的实验研究

目的 应用自体脂肪、筋膜行声带填充治疗单侧声带麻痹,探讨这两种填充材料的疗效及应用前景。方法 实验动物为狗,分为2组,A组2只分别以自体脂肪、筋膜行声带填充矫治左侧事麻痹而致的声门闭合不全,于术后8个月取材行透射电镜及光镜观察。B组9只分别于左侧声带植入自体脂肪,右侧声带植入自体筋膜各0.4ml,分别手术后1、3、5个月以材行光镜观察。结果 自体脂肪能存活于声带组织中,但吸收较明显,功能观察显示,疗效维持不超过5个月;自体筋膜可成功存活于声带,疗效可维持8个月以上。结论 自体脂肪吸收明显,疗效不能持久,仅能人为短期的声带填充材料,自体膜性质较为稳定,疗效持久,具有良好的应用前景。     

脂肪干细胞胶在单侧声带麻痹中的临床应用

目的:探讨脂肪干细胞胶(SVF-gel)在单侧声带麻痹临床应用中的治疗效果.方法:回顾性研究自2017年6月-2018年12月在东南大学医学院附属南京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科进行声带SVF-gel自体移植治疗的22例单侧声带麻痹患者的临床资料.全身麻醉支撑喉镜下,选取大腿内侧作为脂肪供区,采用SVF-gel技术获取SV...     

脱细胞猪真皮基质治疗气管瘢痕狭窄的实验研究

目的研究脱细胞猪真皮基质促进气管纤毛上皮修复、抑制瘢痕形成的可行性。方法制造3cm气管黏膜环形缺损的小型猪动物模型,用脱细胞猪真皮基质覆盖修复创面。术后定期处死动物观察创面修复、细胞外基质和成纤维细胞生长代谢情况。结果采用脱细胞猪真皮基质修复创面,1个月内创面被假复层纤毛上皮完全覆盖,6个月观察期内无瘢痕增生。细胞外基质排列较规则,纤维连接蛋白,I、III型胶原半定量统计与对照组有显著差别。结论脱细胞猪真皮基质能有效促进气管黏膜上皮缺损的修复,并能有效抑制瘢痕的形成。其抑制瘢痕形成的机制是通过指导细胞外基质合成代谢来实现的。     

自体脂肪声带内注射术治疗单侧声带麻痹的远期疗效观察

目的　探讨自体脂肪声带内注射术治疗单侧声带麻痹的远期疗效。方法　 2 0例单侧声带麻痹患者将取自体腹部的脂肪颗粒注射到麻痹侧声带 ,使声带隆起 ,声门闭合 ,恢复嗓音功能 ;所有病例均随访 12个月以上 ,并按术前及术后即刻、近期 (3～ 6个月 )、远期 (>12个月 )通过电子喉镜以计算机软件测得患侧与健侧声带上表面面积比为参数代表患侧声带大小变化指标 ,并用嗓音疾病评估仪进行嗓音声学测试分析。按术前嗓音声学测试结果分为轻度、中度、重度 3组 ,采用自身对照统计分析结果。结果　注射后麻痹侧声带相应体积较术前明显增大 ,但随时间推移 ,麻痹侧声带内的脂肪部分吸收 ,麻痹侧声带体积逐渐减小 ,而术后近期各组及远期中重度声嘶组测得的麻痹侧声带相应体积与术前差异有显著性 ,轻度声嘶组远期测得的麻痹侧声带相应体积与术前差异无显著性。声学测试客观分析 ,注射后较注射前嘶哑程度明显好转 ,随时间延长嘶哑程度有所下降 ,但术后近期及远期嘶哑程度接近。直接反映声门闭合程度的噪声能量在注射脂肪后较注射前明显下降 ,达到正常或接近正常 ;随时间延长噪声能量稍升高 ,但与术前差异有显著性 ,且术后近期及远期的差异无显著性。结论　自体脂肪声带内注射治疗单侧声带麻痹是可选择的有效方法 ,其远期     

脂肪源干细胞上皮分化在喉组织工程中的应用

声带瘢痕是一个较难解决的临床问题,尚缺乏有效的治疗手段,目前其主要的治疗方法是向声带中注射填充物或细胞,试图恢复声带浅层的振动性。声带振动受损主要是由于固有层细胞外基质的中断、胶原沉积增多、弹性纤维的丢失等引起。有证据表明声带注射细胞或基质对恢复声带黏膜波的作用是有限的。另外,从人的声带中获取成纤维细胞比较困难。现有的组织工程方法是将声带的成纤维     

经环甲间隙自体脂肪声带注射矫治声门闭合不全的实验研究

目的：观察家兔声带自体脂肪注射后急、慢性期喉局部反应、声带大体形态及组织学转归，探讨这一方法在矫治声门闭合不全中的应用价值。方法：8只家兔建立声带缺损动物模型后分4组，取腹部自体脂肪经环甲间隙注射入损伤侧声带，分别于注射后急性期（24小时内）及慢性期（1、3、5个月）行直接喉镜及喉组织学检查，观察喉局部反应、声带形态和声门闭合情况以及声带组织学改变。结果：所有家兔声带自体脂肪注射后急性期均无喉水肿发生；慢性期无肉芽肿、结节等改变；急、慢性期均未发生过敏及排斥反应。注射后3个月内声带体积渐缩小，声门闭合程度略降低，3个月后上述声门形态改变不明显。组织学证实注射后急性期可有轻度炎症反应；自体脂肪能在声带组织内存活，3个月内可发生部分脂肪吸收，3个月后脂肪吸收减少，在声带内保持相对稳定的体积。结论：自体脂肪声带注射具有无过敏、无排斥、无异物反应等特点。注射后虽可发生部分吸收，但3个月后吸收减少。该技术是一较为安全、有效的矫治声门闭合不全的方法。     

声带外侧自体脂肪注射填充术治疗声门闭合不良

目的对声带外侧自体脂肪注射填充术方法选择、预后及其影响因素进行研究,探讨声带外侧自体脂肪注射在声门闭合不良性发声障碍治疗中的价值。方法病例选择:29例声门闭合不良、发声障碍患者,27例为单侧声带麻痹(麻痹时间均超过半年),2例为声带萎缩。手术选择:全麻支撑喉镜下,应用特制Brunning高压脂肪注射器进行自体脂肪声带外侧注射。患者手术前后均行嗓音声学、气流动力学及频闪喉镜检查,确定患者发音质量及疗效。结果术后随诊10～18个月,24例患者发声明显改善,2例发声好转,3例无效。注射1个月后脂肪部分吸收,声门闭合程度及发音逐渐改善。3～6个月声带振动、声门闭合正常,发声明显改善,音质稳定,主、客观声学评价及气流动力学参数改善明显(P<0.01)。结论单侧声带麻痹或声带萎缩引起的声门闭合不良,选择声带外侧声门旁间隙脂肪注射手术,使声带膜部内移,改善声门闭合,并保留声带振动特性,患者可获得良好的发音效果。     

支撑喉镜下喉硅胶膜置入及声带缝合手术治疗喉蹼

目的探讨喉硅胶膜置入及声带黏膜缝合术在治疗喉蹼中的价值及预后转归。方法21例喉蹼患者，4例儿童，17例成人；其中既往有双侧声带手术史（声带任克水肿、声带小结、声带息肉、声带角化）8例，喉乳头状瘤手术史6例，喉部外伤史6例，先天性喉蹼1例。患者在全麻支撑喉镜下行喉蹼瘢痕松解后，15例成人行声带黏膜缝合及喉硅胶膜置入术；4例儿童及2例成人行单纯声带黏膜缝合术。结果15例喉硅胶膜置入患者3—4周后取出支撑的硅胶膜，除1例既往曾有喉裂开史，治疗后前联合处仍残留2—3mm粘连带外，其余14例患者声带前联合均获得良好三角形形态，发音明显改善，无呼吸困难。6例行单纯声带黏膜缝合患者呼吸及发音得到明显改善，2例成年患者前联合处残存2～3mm正常黏膜，术后声带即获得很好成形效果；4例患儿术后前联合残留2—3mm粘连。全部患者随诊6个月-3年，无瘢痕再生。结论喉硅胶膜置入及声带缝合手术治疗喉蹼，利于患者呼吸及发音功能的改善，避免颈外入路手术或气管切开及长期声门支撑，创伤小，并发症少。而声带黏膜单纯缝合手术还可以单独应用于粘连带相对较薄（小于5mm）、黏膜相对丰富的儿童及前联合残存正常黏膜的喉蹼患者。     

不同功率CO2激光对声带损伤的实验研究

目的 观察不同功率CO2激光对声带上皮下切除后的损伤和修复.方法 采用30只实验犬随机分成A(1 W)、B(3 W)、C(5W)、D(8W)、E(冷器械)5组,每组6只,分别行声带上皮下切除术,观察比较组织损伤及术后不同时间创面修复情况.结果 C、D组创面黏膜反应较A、B、E组重,创面愈合慢,可见病理性瘢痕.光学显微镜下测定单位面积成纤维细胞数量及毛细血管数量,C、D组明显高于A、B、E组,差异有统计学意义(P值均＜0.05).电镜下观察发现A、B、E组损伤较轻,声带修复过程无明显差别,而C、D组损伤较重,声带修复后成固有层内弹力纤维稀少,胶原纤维明显增多.结论 CO2激光采用低功率(1～3 W)行声带上皮下切除术,组织修复结果与冷器械手术相似.     

人羊膜上皮细胞移植用于兔损伤声带组织修复的初步研究

目的 研究人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAEC)移植入兔声带损伤组织内的生长分布特点,探索hAEC促进声带损伤后修复再生的潜能.方法 分离和培养hAEC,慢病毒增强型绿色荧光蛋白(1entivirus enhanced green fluorescent protein,Lenti-EGFP)基因转染作标记.建立深及声韧带的兔声带损伤模型,设hAEC移植组(13侧声带)、损伤对照组(13侧声带)及正常对照组(4侧声带).荧光显微镜下连续观察hAEC在声带内的存活、分布情况,应用HE染色和免疫组化染色分析胶原、纤维连接蛋白等主要细胞外基质在损伤后3个月时的含量及分布.结果 hAEC原代培养6 d后呈铺路石样生长,植入声带损伤组织后可在固有层内持续存活2个月,细胞呈纵向排列,有趋向性.声带损伤2个月时免疫荧光显示hAEC移植组兔肌细胞标志结蛋白荧光阳性,提示hAEC向肌细胞分化;同时Ⅲ型胶原荧光阳性,提示hAEC植入后具有分泌Ⅲ型胶原功能.光镜观察见hAEC移植后3个月兔胶原纤维密度和排序较损伤对照组改善,但未及正常;免疫组化染色示hAEC移植组纤维连接蛋白含量和分布介于损伤对照组和正常对照组之间.结论 hAEC可在异种动物声带损伤组织内持续存活、生长,并有向声带组织分化和分泌部分细胞外基质的潜能,可能促进声带损伤后的修复再生.

Abstract：

Objective To investigate the survival, growth and distribution of human amniotic epithelial cells (hAEC) after injected into injured rabbit vocal folds, in addition, to assess the ability of hAEC to affect the components of lamina propria extracellular matrix (ECM) and prevent vocal fold scarring.Methods hAEC were isolated from human amnion and marked by Lenti-EGFP. Fifteen New Zealand rabbits were used for this experiment. EGFP-hAEC was injected into the left injured vocal folds in thirteen rabbits, and the contralateral thirteen vocal folds experienced an injured procedure only (" injured untreated control"), and four vocal folds were left as untreated controls. The survival, distribution, differentiation potential and secretion function of hAEC were examined by immunofluorescence method. HE staining and immunohistochemical staining were performed for the evaluation of collagen and fibronectin respectively.Results hAEC showed a cobblestone-like growth. After implanted into the injured vocal folds, hAEC could survive in vocal fold lamina propria for 2 months. The immunofluorescence analysis showed the evidence of hAEC differentiation into muscle cells as well as secretion the ECM protein. Three months postoperatively, the density of collagen was higher in the injured untreated control folds than that in the injured vocal folds injected with hAEC and the untreated controls. Besides, the content of fibronectin in the injured untreated control group was significantly increased. Conclusions hAEC survived in the vocal folds lamina propria,and had the potentiality to differentiate into vocal folds tissue and secret some ECM components. The histological improvement caused by the injected cells demonstrate that hAEC had the ability to promote the repairment and regeneration of injured vocal folds.     

An immunohistochemical and electron-microscopic study of vascular endothelial cells in vocal fold polyps

Summary Gelatinous and telangiectatic types can be differentiated among the human vocal fold polyps. Telangiectatic polyps are characterized by eosinophilic deposits consisting of fibrin and cellular blood constituents. Labyrinthine vascular channels are characteristic of these polyps, and are partially or completely lined by a single layer of flat cells. Using electron microscopy and immunohistochemical stainings (antibodies against factor VIII-related antigen, Ulex europaeus I lectin, and antibodies against lysozyme), we found that the lining cells are true vascular endothelial cells and are not organizing histiocytic cells that are arranged in an endothelial-like pattern.Professor Dr. W. Hort to his 60th birthday     

大鼠胚胎神经干细胞经蜗窗移植到正常耳蜗的研究

目的 探讨感染携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus with GFP,Ad-GFP))的大鼠胚胎神经干细胞(neural stem cell,NSC)经蜗窗径路移植到正常大鼠耳蜗后的存活、分布及报告基凶的表达情况,并检测移植后大鼠听力和耳蜗形态结构的变化.方法 大鼠随机分为三组:组Ⅰ(感染Ad-GFP的NSC移植组)10只,组Ⅱ(人工外淋巴注射组)10只,组Ⅲ(空白对照组)10只.组Ⅰ及组Ⅱ的手术径路均为经蜗窗途径;两组移植前后分别测试大鼠听性脑干反应(ABR),了解其听力的改变;移植后14 d在荧光显微镜下观察耳蜗中轴切片中感染Ad-GFP的NSC的存活、分布及报告基凶的表达情况,并通过耳蜗切片HE染色及摹底膜铺片硝酸银染色观察耳蜗形态结构及毛细胞数目的 变化.结果 组Ⅰ及组Ⅱ术后ABR反应阈分别为(33.5±3.4)dB和(32.5±3.5)dB,与移植前相比差异均无统计学意义(P值均＞0.05),两组术后ABR反应阈问的差异亦无统计学意义(t=0.526,P＞0.05).两组大鼠术后耳蜗形态结构均正常.组Ⅰ NSC移植入耳蜗14 d后,存活的细胞主要分布在耳蜗底回的前庭阶和鼓阶,耳蜗其他各回的前庭阶和鼓阶中也有存活,同时表达强烈的绿色荧光.三组均出现耳蜗外毛细胞的散在缺失,总缺失率均未超过1%,且三组各回的缺失率及总缺失率之间的差异均无统计学意义(P值均＞0.05);三组耳蜗各回均未见内毛细胞的缺失.结论 感染Ad-GFP的NSC经蜗窗径路移植到正常大鼠耳蜗后可以存活并表达GFP基因,移植对大鼠听反应阈及耳蜗形态结构无明显影响.     

大鼠脂肪干细胞构建组织工程化鼓膜修复材料的初步研究

目的 观察大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ASC)在聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)支架上的生长状态、分裂增殖能力及黏附性,为进一步构建组织工程化鼓膜修复材料提供实验参考.方法 以Wistar大鼠为研究对象,分离其ASC,并与PLGA支架材料复合培养.分别行细胞波形蛋白(Vimentin)和Ki67免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察ASC在PLGA支架上的生长状态及分裂增殖能力.扫描电镜观察ASC与PLGA的黏附性.结果 Vimentin免疫荧光结果显示ASC在PLGA支架材料中生长状态良好,排列有序;ASC在PLGA支架上能正常活跃增殖,Ki67平均阳性指数((x)±s)为(8.21±1.76)％,对照组(未放支架材料,直接生长的ASC) Ki67平均阳性指数为(9.06±1.95)％,两组间差异无统计学意义(=1.03,P=0.30).扫描电镜结果显示,ASC与支架材料有较好的黏附性,伪足清晰可见,增殖的细胞间连接紧密.结论 大鼠ASC与PLGA有较好的相容性,可以在PLGA上正常黏附、增殖.