致病性大肠杆菌绿色荧光蛋白标记

目的:用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记致病性大肠杆菌(enteropathogenic escherichia coli,EPEC),以方便研究细菌的黏附。方法:以真核表达载体p EGFP-C1为模板设计引物,采用PCR方法扩增EGFP基因并测序后,克隆入原核表达质粒载体p Trc99a,转染EPEC,用荧光显微镜观察IPTG诱导后EPEC对Hep-2细胞的黏附及荧光表达情况。结果:成功构建原核表达质粒p Trc99a-EGFP和菌株EPEC/EGFP,黏附到Hep-2细胞表面的细菌克隆能够表达绿色荧光蛋白。结论:对EPEC进行了EGFP标记,为计数细菌的黏附提供方便。     

增强型绿色荧光蛋白的基因克隆、表达及蛋白纯化

目的研究增强型绿色荧光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein,EGFP)基因在大肠杆菌中的基因克隆、重组表达及纯化。方法采用PCR方法克隆EGFP全长cDNA序列,构建原核表达载体pGEX4T-1-EGFP,经过DNA序列测定证实其序列正确,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,用谷胱甘肽-Sepharose4B层析法纯化GST-EGFP融合蛋白。结果成功地克隆了EGFP全长cDNA序列,并进行原核表达以及蛋白的纯化,GST-EGFP的表达量占菌体蛋白量的40%以上。经纯化后纯度高于90%。菌体超声裂解后上清液及其纯化产物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光。结论本研究为应用EGFP追踪细胞吞噬功能等动态活动奠定了实验基础。     

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

Pr1基因和绿色荧光蛋白基因融合表达载体的构建

目的:以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)基因为报告基因,类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like protease,Pr1)基因为目的基因,分别构建含有EGFP-Pr1和Pr1-EGFP融合基因的原核表达载体.方法:将Pr1基因分别连接到EGFP基因的上游和下游,插入质粒pTWIN1,构建表达载体pEGFP-Pr1和pPr1-EGFP.结果:经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,重组菌株在长波紫外线的照射下,均能发出明亮的绿色荧光,并且诱导菌株破碎后均可检测到Pr1蛋白酶的活性.结论:应用基因工程技术成功构建pPr1-EGFP和pEGFP-Pr1融合基因表达载体,EGFP作为Pr1生物标记分子,有利于进一步开展Pr1基因的特异性功能研究.     

间隙连接蛋白26-EGFP载体的构建与表达

目的：构建间隙连接蛋白(connexin，Cx)26-EGFP真核表达载体，观察其在细胞内的表达和功能情况。方法：经RT-PCR获得Cx26基因全长片段，重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2中，经脂质体转染至宫颈癌Hela细胞中，通过激光共聚焦显微镜、免疫细胞化学方法、蛋白印迹法(Western blot)检测蛋白表达，应用荧光染料(Lucifer Yellow)细胞划痕法检测细胞间间隙连接通信状态。结果：转染细胞有增强绿色荧光蛋白及Cx26的表达，细胞间间隙连接通讯恢复。结论：融合表达增强绿色荧光蛋白后，不影响间隙连接蛋白的功能，在间隙连接蛋白的研究中，pEGFP-N载体可以作为一个优选载体。     

GRP78重组表达腺病毒的构建及在HepG2细胞的表达及其相关功能研究

目的:构建葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)重组表达腺病毒pAd-GRP78,并感染HepG2细胞建立能够高表达GRP78的细胞模型,同时在HepG2细胞中研究重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖能力的影响。方法:利用腺病毒穿梭质粒pAd Track-TO4构建载有GRP78基因的穿梭质粒pAd Track-TO4-GRP78载体,并通过基因测序鉴定载体序列正确。将载体用PmeⅠ酶切线性化,与Ad Easy-BJ5183感受态细胞进行基因同源重组。将重组后的腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,转染到HEK293细胞中进行包裹,根据增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的表达判断重组腺病毒的包装情况。通过反复离心和低温裂解细胞提取GRP78重组表达腺病毒。以人肝癌HepG2细胞为目标,进行病毒感染。通过qRT-PCR检测GRP78基因表达情况,使用Western blot检测GRP78蛋白的表达。最后感染HepG2细胞,通过MTS比色法检测重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖的影响。结果:测序验证pAd Track-TO4-GRP78构建成功,酶切验证重组腺病毒载体pAd-GRP78构建成功。在HEK293细胞中将pAd-GRP78包裹,GPF荧光检测结果表示病毒包装成功。使用pAd-GRP78感染人肝癌HepG2细胞,qRT-PCR检测到细胞中GRP78基因的过表达,Western blot方法检测到GRP78蛋白的高表达。MTS检测结果显示重组表达GRP78腺病毒对HepG2肝癌细胞有促增殖作用。结论:实验成功构建了GRP78重组表达腺病毒,并验证了构建的腺病毒载体可以收集并感染HepG2细胞表达GRP78蛋白。证明了重组表达GRP78腺病毒能够促进肝癌细胞的增殖。为进一步研究GRP78的功能奠定了基础。     

构建由绿色荧光标记巨噬细胞的转基因斑马鱼模型

目的:建立由绿色荧光蛋白(EGFP)标记巨噬细胞和巨噬细胞聚集的转基因斑马鱼模型(zlyz - EGFP).方法:利用分子克隆、显微注射、活体摄像等方法,建立由绿色荧光蛋白标记巨噬细胞的转基因斑马鱼.结果:建立并筛选出绿色荧光蛋白稳定表达的转基因斑马鱼,同时通过切割尾部构建巨噬细胞聚集的炎症模型.结论:通过建立由绿色荧...     

HCBP1的细胞定位及与HCV核心蛋白在体内的相互作用

目的探讨HCV核心蛋白与（HCBP1）HCV核心蛋白的相互作用蛋白在真核细胞内的相互作用。构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与HCBP1融合蛋白真核表达载体,分析其在COS．7细胞中的表达和亚细胞定位。方法PCR分别扩增含HCV核心及HCBP1的eDNA片段,克隆人pGEMT载体,经测序正确后,分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM和pVP16中,并转染入COS-7细胞,48h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平。将HCBPl的eDNA片段克隆人绿色荧光表达载体pEGFP-C1中,构建HCBP1-EGFP融合蛋白的表达载体,转染COS-7细胞,以Westernblot和荧光显微镜分析融合蛋白的表达及其细胞定位。结果CAT．EUSA检测显示pM-核心蛋白与pVP16-HCBP1实验孔吸光度值高于其他阴性对照,但低于阳性对照组。成功构建HCBP1-EGFP融合蛋白的表达载体,Westernblot证实融合蛋白在转染细胞中的表达,荧光显微镜示HCBPl．EGFP融合蛋白分布于细胞浆,而转染空载体的细胞内EGFP的分布无明显改变。结论成功构建HCBP1-EGFP融合蛋白表达载体,并在COS-7细胞中得到表达。哺乳双杂交系统证实HCV核心蛋白与新基因HCBP1确有一定的相互作用。     

GRP78蛋白在胃癌中的表达及作用

目的探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在胃癌中的表达及作用。方法收集不同临床分期和分化程度的胃癌标本48例,癌旁正常胃黏膜组织28例。运用免疫组织化学技术检测胃癌及其转移癌组织中GRP78蛋白的表达;采用MTT及Transwell观察GRP78蛋白对SGC-7901胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。结果免疫组织化学结合临床病理分析结果显示:GRP78蛋白位于胞质,且在胃癌组织中GRP78蛋白较正常胃黏膜组织明显增加,其阳性表达率与胃癌的直径、分化、淋巴结转移、分期、复发有关(P＜0.05)。MTT及Transwell结果显示:干扰GRP78蛋白表达可抑制SGC-7901胃癌细胞的增殖和迁移能力。结论GRP78蛋白在胃癌组织中高表达,其表达水平与胃癌肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、临床分期及预后有关。     

GRP78基因短发夹RNA表达载体的构建和鉴定

目的构建葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因短发夹RNA表达载体并鉴定,为探讨GRP78对胃癌发生发展作用及机制提供前期基础。方法运用核糖核酸(RNA)干扰技术构建靶向干扰GRP78蛋白短发夹RNA(GRP78-shRNA)载体,载体经转化、抽提及测序,用脂质体将GRP78-shRNA载体瞬时转染至SGC-7901胃癌细胞中,应用荧光显微镜、反转录定量PCR(qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot)观察GRP78表达情况。结果GRP78-shRNA载体测序显示序列正确;转染GRP78-shRNA载体的SGC-7901胃癌细胞可见绿色荧光;qRT-PCR和Western blot结果显示,转染GRP78-shRNA载体的SGC-7901胃癌细胞中GRP78基因和蛋白表达降低。结论成功构建并鉴定GRP78基因短发夹RNA表达载体。     

稳定沉默GRP78基因的胰腺腺泡细胞株AR42J的建立

目的设计并构建编码大鼠葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的短发夹样RNA(shRNA)慢病毒载体,用以建立稳定沉默GRP78基因的大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J。方法设计并合成3条编码大鼠GRP78mRNA的shRNA质粒表达载体,用三质粒包装系统包装成慢病毒,并以相应慢病毒转导大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J。经流式细胞分选术(FCAS)筛选出绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞,采用real-time PCR及Western blot方法检测GRP78基因的mRNA和蛋白表达。结果测序证实,成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3。慢病毒转导AR42J细胞后,经荧光显微镜和FCAS证实转导效率>85%。经real-time PCR验证,与未处理组相比,LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3处理组对GRP78mRNA表达的沉默效率分别为69.4%±1.42%、74.7%±1.69%和86.6%±1.73%(P<0.05),含无义序列的阴性质粒LV-Non Target对照组与未处理组相比,GRP78mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示各组GRP78蛋白表达与mRNA表达趋势一致。结论成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体,建立了稳定沉默GRP78基因的胰腺腺泡细胞株AR42J,为探讨GRP78基因在急性胰腺炎发病机制中的作用提供了新的细胞模型。     

Luminal型乳腺癌组织中GRP78和Ki67的表达与临床病理因素之间的相关性研究*

目的：探讨葡萄糖调节蛋白78(78 kDa-glucose-regulated protein, GRP78)及增殖因子Ki67在Luminal型乳腺癌中的表达水平,及其与患者预后的相关性。方法：采用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)测定GRP78、Ki67在60例Luminal型乳腺癌中的表达水平,分析二者表达量的相关性及对患者预后的影响。结果：GRP78在Luminal型乳腺癌癌组织中高表达,GRP78和Ki67二者的表达,呈正相关;患者的无复发生存期(recurrence-free survival, RFS)与脉管侵犯、GRP78高表达、Ki67高表达、HER-2阳性表达之间有关,GRP78高表达是Luminal型乳腺癌患者RFS时间的影响因素。结论：GRP78和Ki67在Luminal型乳腺癌中的表达呈正相关,GRP78高表达影响Luminal型乳腺癌患者的预后。     

GRP_(78)在弱精症精子和活力正常精子蛋白中的表达差异研究

目的:探讨GRP78在弱精症精子和活力正常精子蛋白中的表达差异。方法:取50μg正常精子和弱精样品蛋白质,加入上样缓冲液后,沸水浴5min,充分变性蛋白质,100V恒压电泳分离,直至溴酚蓝前沿达到凝胶底部;再用Western-Blot检测GRP78表达变化。结果:GRP78正常精子蛋白样品中高表达,而在弱精子蛋白样品中低表达,Western-Blot检测结果与双向电泳凝胶图中的差异高度吻合。结论:GRP78在弱精子蛋白中低表达,提示GRP78在弱精子症发生中可能扮演着重要角色。     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭、转移的作用

目的 探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在乳腺癌细胞（231）侵袭、转移过程所起的作用。方法 构建GRP78真核反义表达载体,转染入231细胞,利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况;并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果 转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞;反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论 GRP78是乳腺癌的一个促癌基因,下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

胃癌中葡萄糖调节蛋白78和葡萄糖调节蛋白94表达的临床意义及与预后的相关性

目的确定葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78,GRP78）和葡萄糖调节蛋白94（glucose-regulated protein 94,GRP94）与胃癌（gastric cancer,GC）临床病理特征及预后的相关性。方法应用Western blotting和免疫组织化学方法检测GC和切缘组织中GRP78和GRP94的表达;Kaplan-Meier或卡方检验GRP78、GRP94和临床病理资料与GC术后整体生存期相关性。结果 GRP78和GRP94蛋白主要表达于胃癌细胞的胞质及胞膜,其阳性表达与淋巴结转移、TNM分期呈负相关,与分化程度正相关（P〈0.05）;GRP78、GRP94高表达及低表达GC患者术后平均生存时间分别为（23.51±2.32）个月和（37.54±3.24）个月、（21.31±1.46）个月和（40.02±2.19）个月,5年整体生存率分别为21.23%和41.42%、20.73%和43.86%（log-rank test,P〈0.01）,TNM分期、GRP78和GRP94是影响GC预后的独立因素。结论 GRP78和GRP94高表达可能是GC预后不良的分子标志物之一。     

Butein增强mH2A靶向GRP78蛋白通过MAPK信号通路 调控黑色素瘤的生物学行为

目的：探讨组蛋白变异体macroH2A(mH2A)和Butein共同作用GRP78蛋白通过丝裂原激活蛋白激酶 (mitogen-activation protein kinase,MAPK)信号通路调控黑色素瘤的生物学行为。方法：采用免疫组织化学检测黑色 素瘤和癌旁正常组织中mH2A和葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein of 78,GRP78)的表达情况;分析临床资料 与mH2A和GRP78表达的关系;免疫共沉淀实验检测GRP78和mH2A蛋白的相互作用;Western印迹检测mH2A和GRP78 的相关作用及Butein与mH2A之间的作用。Transwell试验检测mH2A的表达对黑色素瘤细胞侵袭能力的影响;划痕试 验检测mH2A的表达对黑色素瘤细胞迁移能力的影响;Western印迹检测沉默mH2A后细胞外信号调节激酶1(ERK1) 和MAPK/ERK激酶(MEK)蛋白的表达。结果：与癌旁正常组织相比,黑色素瘤组织中mH2A和GRP78表达明显降低 (P<0.05);Butein可以增强mH2A的表达水平(P<0.05),mH2A可以调节GRP78蛋白的表达(P<0.05);沉默mH2A促进黑色素 瘤A375细胞的侵袭迁移能力,上调MEK和ERK1蛋白的表达。结论： Butein可以增强mH2A靶向GRP78蛋白通过MAPK信 号通路抑制黑色素瘤细胞的迁移和侵袭行为。     

ER阳性乳腺癌中FOXM1和GRP78蛋白表达与临床病理因素及预后的相关性研究*

目的：检测ER阳性乳腺癌组织中叉头框M1（forkhead boxM1，FOXM1）及葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein of 78kDa，GRP78）的表达水平，探讨其与临床各参数及预后的关系。方法：应用免疫组化技术检测FOXM1、GRP78在60例ER阳性乳腺癌中的表达，分析两者表达量的相关性，与临床病理参数的相关性及其对患者预后的影响。结果：FOXM1和GRP78在ER阳性乳腺癌癌组织中高表达，两者的表达呈正相关性；患者的无复发生存期（recurrence-free survival，RFS）与脉管侵犯、FOXM1、GRP78、Ki67表达、HER2表达有关，GRP78和FOXM1高表达均是ER阳性乳腺癌患者RFS的影响因素。结论：通过本研究发现FOXM1和GRP78在ER阳性乳腺癌癌组织中高表达，两者均影响ER阳性乳腺癌患者5年RFS时间。     

脑心通对大鼠脑缺血损伤的保护机制

目的:观察脑心通对大鼠缺血脑组织(纹状体)葡萄糖调控蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、GRP94表达的影响,探讨其对大鼠局灶性脑缺血损伤可能的保护机制.方法:大鼠随机分为假手术组、缺血损伤组(线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型)以及脑心通治疗组(缺血损伤前予脑心通治疗,n=30).应用组织学观察、免疫组织化学及半定量RT-PCR检测缺血不同时段(6、12、24 h)各组大鼠纹状体GRP78、GRP94表达的变化.结果:成功建立大鼠局灶性脑缺血模型.组织学观察表明脑心通治疗组大鼠脑缺血损伤程度较缺血损伤组明显减轻.免疫组织化学检查和RT-PCR检测均发现各时间点假手术组大鼠纹状体GRP78、GRP94表达高于缺血损伤组(P<0.01);缺血后6、12、24 h缺血损伤组、脑心通治疗组GRP78、GRP94表达呈现先升高后降低趋势, 缺血后12 h的表达最高;各时间点缺血损伤组GRP78、 GRP94表达低于脑心通治疗组(P<0.05或P<0.01).结论:大鼠纹状体缺血损伤后12 h内出现GRP78、 GRP94表达升高;脑心通能够提高脑缺血损伤组织GRP78、GRP94表达;脑心通可能是通过促进GRP78、GRP94表达来发挥保护内质网功能,减轻脑缺血损伤.     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭及转移中的作佑

目的探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在乳腺癌细胞(231)侵袭、转移过程所起的作用。方法构建GRP78真核反义表达载体,转染入231细胞,利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况;并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞;反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论GRP78是乳腺癌的一个促癌基因,下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。