siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学

目的 研究化学合成的小干扰RNA(483 siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达及细胞生物学特性的影响.方法 以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483siRNA转染培养72 h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组.收集孵育96 h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT-PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量.结果 与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调(92±5)%,α-SMA染色阳性细胞减少(58±6)%,细胞增殖活性下调(18±5)%,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调(53±6)%和(41±7)%;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低(48±5)%和(33±8)%.结论 483 siRNA能显著下调原代HSCsCTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌.提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力.     

siRNA干扰下调Moesin表达对U251细胞生长和侵袭能力的影响

目的：研究RNA干扰（RNAi）对人脑胶质细胞瘤（U251）中Moesin蛋白基因表达的抑制作用及其对U251细胞生长、侵袭的影响.方法：以人脑胶质细胞瘤U251细胞系为研究对象,针对Moesin编码基因设计小干扰RNA（siRNA）片段,转染入细胞,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）筛选沉默效率最高的siRNA片段,并用WesternBlot技术检测定量转染后U251细胞Moesin蛋白的表达水平.转染后以MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞的凋亡水平;Transwell法检测侵袭能力的变化,并以扫描电镜观察转染后的细胞形态变化.结果：RT-PCR,WesternBlot筛选出的MOESIN-139片段沉默效果最好,siRNA转染后U251细胞生长速度减慢,在转染48h时,siRNA组U251细胞生长速度明显低于空白对照组和阴性对照组（P〈0.01）,平均凋亡率siRNA组为（17.30±2.01）%,远高于空白对照组（1.95±0.33）%和阴性对照组（2.02±0.28）%（P〈0.01）.siRNA转染后的U251细胞穿过聚碳酯膜的细胞数量明显减少,由空白对照组26.47±4.07,阴性对照组24.27±3.63下降至siRNA组11.53±2.61（P〈0.01）.细胞形态发生改变,细胞表面伪足数由空白对照组14.20±2.58,阴性对照组15.80±1.30下降至siRNA组6.60±1.82（P〈0.01）.结论：siRNA可下调Moesin的表达,并能有效抑制U251细胞的生长,减低其侵袭性.Moesin有可能成为治疗人脑胶质瘤的靶点分子.     

Effects of UbcH10 gene silencing combined with paclitaxel treatment on proliferation and apoptosis of NCI-H226 cells

目的 观察小干扰RNA(siRNA)介导的UbcH10基因沉默联合紫杉醇处理对人肺鳞癌细胞株NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响.方法 化学合成针对UbcH10基因的siRNA-UbcH10序列,脂质体转染siRNA至NCI-H226细胞(siRNA转染组),转染后24 h,采用Real-Time PCR和Western blotting分别检测UbcH10 mRNA和蛋白的表达水平,以未予任何转染细胞作为空白对照,以阴性序列转染细胞作为阴性对照.以紫杉醇(1μmol/L)处理siRNA转染及未转染NCI-H226细胞(siRNA+紫杉醇组和紫杉醇组),分别于转染后24、48 h收集细胞,MTT比色法检测细胞增殖;转染后24 h收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以未经紫杉醇处理的siRNA转染、阴性序列转染和未予转染的NCI-H226细胞作为siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组.结果 Real-Time PCR和Western blotting检测结果显示:转染后24 h,siRNA转染组UbcH10 mRNA和蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组显著下调(P＜0.01).MTT比色法检测结果显示,siRNA转染组细胞增殖抑制率显著高于紫杉醇组和对照组(P＜0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞增殖抑制率显著高于siRNA转染组(P＜0.05).siRNA转染组细胞凋亡率显著高于紫杉醇组和对照组(P＜0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞凋亡率显著高于siRNA转染组(P＜0.05),紫杉醇组与对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 UbcH10基因沉默可显著增强NCI-H226细胞对于化疗药物紫杉醇的敏感性.     

HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的初步研究

目的检测HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的情况,为HBV宫内传播机制研究提供理论依据。方法用胰蛋白酶(0.25%)-DNase Ⅰ(0.15 U/ml)联合消化法,获取纯度较高的人绒毛膜滋养层细胞。将状态良好的对数生长期人绒毛膜滋养层细胞分为6组,HBsAg-anti-HBs 复合物组(Ⅰ),热灭活的HBsAg、HBeAg、anti-HBc均阳性血清和高滴度anti-HBs阳性血清共同孵育物组(Ⅱ), 热灭活的HBsAg、HBeAg、anti-HBc均阳性血清组(Ⅲ),HBsAg组(Ⅳ),热灭活的正常人血清组(Ⅴ),及正常细胞培养液组(Ⅵ,空白对照组)。分别收集各组细胞铺片,免疫组化检测细胞的感染状况。结果所获人绒毛膜滋养层细胞纯度较高,符合后续实验要求。用鼠抗人anti-HBs免疫组化检测收集的细胞铺片,发现Ⅰ、Ⅱ组均有大量HBsAg阳性信号,Ⅲ组细胞亦有少量HBsAg阳性信号出现,其他各组细胞均未发现HBsAg阳性信号。结论体外培养的人胎盘滋养层细胞能将HBsAg-抗HBs复合物中的HBsAg,但不能将单独的HBsAg“摄入”胞内。     

靶向于雄激素受体的siRNA筛选及效能评价

目的 设计并合成新的靶向于雄激素受体(AR)的siRNA序列,转染前列腺癌细胞筛选最佳干扰序列.方法 设计并合成靶向于雄激素受体的siRNA,以不同浓度转染雄激素非依赖性前列腺癌细胞C4-2,确定最佳转染浓度.以最佳转染浓度转染细胞,分为siRNA Ⅰ组、siRNAⅡ组、siRNAⅢ组、阴性对照组、空白对照组和无关对照...     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学

目的研究化学合成的小干扰RNA(483 siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483siRNA转染培养72 h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96 h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT-PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调(92±5)%,α-SMA染色阳性细胞减少(58±6)%,细胞增殖活性下调(18±5)%,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调(53±6)%和(41±7)%;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低(48±5)%和(33±8)%。结论483 siRNA能显著下调原代HSCsCTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。     

UbcH10基因沉默联合紫杉醇干预对NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响

目的观察小干扰RNA(siRNA)介导的UbcH10基因沉默联合紫杉醇处理对人肺鳞癌细胞株NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响。方法化学合成针对UbcH10基因的siRNA-UbcH10序列,脂质体转染siRNA至NCI-H226细胞(siRNA转染组),转染后24 h,采用Real-Time PCR和Western blotting分别检测UbcH10 mRNA和蛋白的表达水平,以未予任何转染细胞作为空白对照,以阴性序列转染细胞作为阴性对照。以紫杉醇(1μmol/L)处理siRNA转染及未转染NCI-H226细胞(siRNA+紫杉醇组和紫杉醇组),分别于转染后24、48 h收集细胞,MTT比色法检测细胞增殖;转染后24 h收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以未经紫杉醇处理的siRNA转染、阴性序列转染和未予转染的NCI-H226细胞作为siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组。结果Real-Time PCR和Western blotting检测结果显示:转染后24 h,siRNA转染组UbcH10 mRNA和蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组显著下调(P0.01)。MTT比色法检测结果显示,siRNA转染组细胞增殖抑制率显著高于紫杉醇组和对照组(P0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞增殖抑制率显著高于siRNA转染组(P0.05)。siRNA转染组细胞凋亡率显著高于紫杉醇组和对照组(P0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞凋亡率显著高于siRNA转染组(P0.05),紫杉醇组与对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 UbcH10基因沉默可显著增强NCI-H226细胞对于化疗药物紫杉醇的敏感性。     

RNAi抑制食管癌EC109细胞株叶酸受体αmRNA表达的实验

目的 利用RNAi技术特异性抑制食管癌EC109细胞株叶酸受体α(folate receptor α,FRα)mRNA 表达,研究其对EC109细胞株体外增殖能力的影响.方法 化学合成针对FRα基因3个不同靶点的3条FRαsiRNA(FRαsiRNA1,FRαsiRNA2和FRαsiRNA3),分别转染EC109细胞株,以未转染细胞为正常对照,转染阴性siRNA的细胞为阴性对照.免疫印迹法检测FRα蛋白表达,CCK8法检测RNA干扰后24,48,72,96 h细胞增殖,流式细胞仪检测RNA干扰后24,48,72,96 h细胞凋亡.结果 免疫印迹法提示FRαsiRNA1组FRα表达为正常对照组的14.7%;FRαsiRNA2组FRα表达为正常对照组的55.1%;FRαsiRNA3组FRα表达为正常对照组的62.9%;干扰后24,48,72,96 h细胞存活率均降低,分别为(81.15±1.97)%,(68.18±3.45)%,(49.82±7.64)%,(32.92±2.61)%.干扰后96 h细胞存活率最低,与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.001);干扰后24,48,72,96h干扰组凋亡分别为(3.95±0.45)%,(6.23±1.11)%,(10.00±0.30)%,(3.07±0.40)%,干扰后72 h凋亡率最高,与正常对照组和阴性对照组比较差异有显著性(P<0.001).结论 化学转染法成功转染并抑制了FRα在食管癌细胞株EC109中的表达,干扰后细胞增殖受抑制,凋亡增加.     

RNA干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性影响

目的探讨RNA干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性的影响。方法构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-387。设置空白对照组(不加载体)、阴性对照组(加入pshRNA-survivin-NC)及siRNA转染组(加入pshRNA-survivin-387),用脂质体2000转染HepG2细胞,采用逆转录聚合酶链反应技术检测各组survivin基因mRNA表达水平。分别设置空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组、X线照射组、siRNA转染+X线照射组,收集各组细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数。结果 siRNA转染组survivin基因mRNA表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组,差异有显著性(F=218.93,q=17.73、18.66,P<0.05)。siRNA转染+X线照射组细胞凋亡率明显高于其他各组,差异有显著性(F=1 421.83,q=13.81～57.48,P<0.05);siRNA转染组及X线照射组与空白组、阴性组比较,细胞凋亡率也明显提高(q=17.55～39.10,P<0.05)。siRNA转染+X线照射组细胞存活分数显著低于其他各组(F=2870.58,q=15.32～72.51,P<0.05);siRNA转染组及单纯X线照射组细胞存活分数与空白对照组、阴性对照组比较也明显降低(q=11.14～73.90,P<0.05)。结论 pshRNA-survivin-387转染能抑制survivin基因表达,诱导肝癌细胞凋亡,增强肝癌细胞的放射敏感性。     

RNAi沉默FAK基因表达对人舌鳞癌细胞CAL-27凋亡和侵袭的影响

目的 应用RNA干扰技术将FAK基因表达沉默后,观察人舌鳞癌细胞株CAL-27凋亡和侵袭能力的变化.方法 使用RNAi技术构建3对FAK siRNA后,瞬时转染细胞.运用实时定量聚合酶链反应(qPCR)法检测FAK mRNA的表达情况,筛选出沉默效率最佳的siRNA用于后续实验.运用蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测细胞FAK蛋白的表达情况,流式细胞仪观察细胞的凋亡情况,Transwell侵袭实验观察细胞体外侵袭能力的变化.结果 qPCR实验结果显示转染siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组FAK mR-NA表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01),其中以siRNA-3沉默效率最高;Western blot结果显示转染组细胞FAK蛋白表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05);流式细胞仪检测结果显示转染组细胞凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01);Transwell法实验结果显示转染组细胞穿膜的数量明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).结论 沉默FAK基因表达可诱导舌鳞癌细胞CAL-27的凋亡,有效抑制其侵袭能力.     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

内毒素对睾丸功能影响的研究进展

众所周知生殖道感染、炎症和其他疾病可抑制雄性生殖功能,但对系统性炎症和疾病引起男性不育的具体机制却所知甚少。内毒素是一种高效炎症激活物,可诱导炎症感染、内毒素血症、败血症休克及多组织器官损伤等,虽然内毒素广泛用于其他系统的炎症研究,但对其在生殖系统炎症的研究较少,因而深入了解内毒素对睾丸功能的影响,有助于进一步理解内毒素所致疾病对雄性生殖功能的影响。本文就内毒素的结构和生物学功能及其对睾丸生精细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞功能的影响进行了相关研究。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

莪术注射液抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡的研究

目的：探寻新的抗白血病药物。方法：采用ＭＴＴ法,以柔红霉素（ＤＮＲ）、阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）和羟基脲作对照,了解莪术注射液对Ｋ５６２细胞增殖抑制作用;通过流式细胞仪检测和ＤＮＡ凝胶电泳,观察莪术注射液诱导Ｋ５６２细胞凋亡的情况。结果：莪术注射液对Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显强于对照ＤＮＲ、Ａｒａ－Ｃ和羟基脲;而它更主要的作用是诱导Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

免疫性肝损伤大鼠枯否细胞对肝星状细胞增殖的影响及芍药苷的作用

目的探讨芍药苷(Pae)通过免疫性肝损伤大鼠枯否细胞(KC)影响肝星状细胞(HSC)的增殖能力。方法用卡介苗加脂多糖诱导大鼠肝损伤模型,肝脏原位灌流分离大鼠KC和HSC,观察共培养的形态学改变,观察Pae作用后的KC培养上清对HSC增殖的影响。结果免疫性肝损伤大鼠KC能明显促进HSC的增殖,在Pae作用后,KC培养上清能抑制HSC的增殖。结论KC是Pae发挥作用的靶细胞之一,Pae可通过作用于KC抑制HSC的增殖。