亚低温对缺血性神经元凋亡、细胞色素C释放的影响

通过大鼠短暂全脑缺血模型来探讨亚低温对大鼠脑缺血后细胞色素C(CytochromeC ,CytC)释放及缺血性神经元凋亡的影响 ,揭示亚低温的部分神经保护机制。用原位细胞凋亡检测法 (TUNEL染色 )检测及电镜观察脑缺血后大鼠脑海马CA1区神经元凋亡发生情况 ;免疫组织化学法测定脑缺血后大鼠脑海马区神经元中细胞色素C释放情况。结果显示 :①低温缺血组海马CA1区凋亡神经元数明显少于常温缺血组 (P <0 .0 1) ;②低温缺血3h组海马CA1区神经元CytC阳性表达低于常温缺血 3h组 (P <0 .0 1)。据此认为 ,全脑缺血后的迟发性神经元死亡很可能经由凋亡途径 ,而CytC激活、释放是缺血性神经元凋亡的一个关键事件。亚低温可抑制CytC的释放 ,推测经此途径减少缺血性神经元凋亡而发挥一定的神经保护作用。     

亚低温对大鼠短暂全脑缺血后神经元凋亡的影响

目的 探讨亚低温对大鼠脑缺血后神经元凋亡的影响，揭示亚低温的部分神经保护机制。方法 采用“双侧颈总动脉阻断＋全身低血压”方法来建立大鼠短暂性全脑缺血模型。用神经元尼氏体亚甲兰特殊染色法观察大鼠脑缺血后海马CA1区神经元损害情况；原位细胞凋亡检测法（TUNEL染色）及电镜观察脑缺血后CA1区神经元凋亡情况。结果 与假手术组、低温缺血组相比，常温缺血组海马CA1区神经元缺失明显（P＜0．01）。常温及低温缺血组海马CA1区均存在神经元凋亡，但低温缺血组海马CA1区凋亡神经元数明显少于缺血组（P＜0．01）。结论 经“双侧颈总动脉阻断＋全身低血压”方法建立的大鼠短暂全脑缺血模型证实了亚低温的脑保护作用。全脑缺血后的迟发性神经元死亡很可能经由凋亡途径，而亚低温可通过抑制缺血性神经元凋亡而发挥一定的神经保护作用。     

深低温对全脑缺血大鼠海马线粒体细胞色素C释放及细胞凋亡影响

目的 观察深低温对全脑缺血大鼠海马线粒体细胞色素C(Cyt-C)释放和细胞凋亡的影响,探讨深低温的脑保护作用机制. 方法 24只SD大鼠建立大鼠体外循环模型后按随机数字表法分成3组:对照组(建立大鼠体外循环模型5 min后迅速处死取海马组织)、常温缺血组[大鼠于(37±0.3)℃下停循环5 min后迅速处死取海马组织)和低温缺血组(热交换器配合体外冰屑诱导使大鼠肛温降至(18±0.5)℃,停循环5 min后迅速处死取海马组织),每组各8只.Western blotting检测3组大鼠海马神经细胞胞浆Cyt-C的表达,TUNEL法检测3组大鼠海马神经细胞凋亡率. 结果 常温缺血组海马神经细胞胞浆Cyt-C浓度(3.57±0.82)较对照组(0.48±0.14)明显升高,而低温缺血组Cyt-C浓度(1.24±0.53)较常温缺血组明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).常温缺血组海马神经细胞凋亡率(50.45％±3.71％)较对照组(2.56％±0.43％)明显升高,而低温缺血组海马神经细胞凋亡率(16.51％±2.65％)较常温缺血组明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 深低温可抑制全脑缺血大鼠海马线粒体Cyt-C释放和细胞凋亡,是其脑保护作用的重要机制之一.     

亚低温对脑缺血后Smac表达和释放的影响

目的 观察脑缺血模型第2个线粒体源胱天酶激活剂(Smac)在脑缺血后不同时间点的表达和释放情况,探讨亚低温治疗与Smac表达的可能相关机制.方法 将大鼠随机分为常温假手术组、亚低温假手术组、常温缺血组和亚低温缺血组,用线栓法制作局部脑缺血模型.亚低温治疗3 h后,在脑缺血3、6、12、24 h及3、7 d后进行神经功能评分,并用免疫组化法、蛋白免疫印迹法检测Smac表达,实时定量PCR法测定Smac mRNA表达.结果 亚低温各组神经功能评分均较常温组降低(P＜0.05或P＜0.01).常温组Smac释放、蛋白及mRNA表达均表现为随时间延长而增高,约24 h达峰值,经亚低温治疗后各组数值均较相应常温组显著降低(P＜0.05或P＜0.01).结论 亚低温可能通过抑制Smac转录、表达和释放减轻细胞凋亡水平,从而发挥脑保护作用.     

促红细胞生成素对大鼠脑缺血海马CA1区神经元凋亡和细胞色素C释放的影响

目的　探讨促红细胞生成素 (Erythropoietin ,EPO)的神经保护机制。方法　采用 4 VO法制作大鼠全脑缺血模型。将SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水组、EPO组。全脑缺血前 3h ,EPO组大鼠脑室立体定向注射重组人促红细胞生成素 (recombinantHumanErythropoietin ,rHuEPO) ,生理盐水组则给予生理盐水 ,假手术组只进行假手术处理。观察缺血后 2 4h海马CA1区细胞色素C(CytochromeC ,CytC)的变化 ,及缺血后 72h海马CA1区细胞凋亡情况。结果　EPO组海马CA1区呈现点状分布的CytC表达较生理盐水组增强 (P <0 .0 1) ,并且较生理盐水组呈现较少的凋亡细胞 (P <0 .0 1)。结论　EPO预处理可以抑制海马CA1区CytC从线粒体向胞浆释放及减少神经元凋亡。     

细胞色素c氧化酶与缺血性神经元损伤

细胞色素c氧化酶是细胞呼吸链终端酶 ,脑缺血缺氧时其活性下降与迟发性神经元损伤关系密切。研究其与迟发性神经元损伤的关系可能有助于认识缺血缺氧神经元损伤的发生机制。     

亚低温对缺血性神经元凋亡后凋亡诱导因子表达的影响

目的研究亚低温对凋亡诱导因子(AIF)介导的缺血性神经元凋亡通路的影响。方法建立离体大鼠皮质神经元凋亡模型。皮质神经元原代培养,分为常温组(37℃)和亚低温组(33℃),在剥夺血清后的8h、16h和24h,测定神经元生存率;应用免疫细胞化学的方法检测微管相关蛋白-2(MAP-2);通过Western Blotting方法测定神经元的细胞核和细胞浆中AIF的含量变化。结果缺血24h组,神经元生存率分别为42.34%(37℃)和65.76% (33℃),差异有统计学意义(P<0.05)。随着缺血时间的延长,MAP-2的表达逐渐减低,在缺血16h和24h,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。细胞核中AIF的含量逐渐增加,而细胞浆中AIF的含量逐渐减少,在缺血16h和24h,与常温组相比,低温组细胞核AIF的含量显著性减低(P<0.05)。结论亚低温能促进缺血后神经元的存活,减少MAP-2的降解。亚低温干预了AIF介导的细胞凋亡途径,减少了缺血性损伤导致的AIF核位移。     

亚低温对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及Bcl—2、Bax的影响

目的 研究不同时程的亚低温对大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax的影响。方法 利用MCAO模型,缺血3小时后再灌注。缺血后即刻分别进行不同时程（0．5、1、3小时）的亚低温治疗,再灌注后24小时取脑切片作TUNEL染色及Bcl-2、Bax免疫组化染色。结果 （1）亚低温1、3小时组的凋亡细胞、Bax细胞数与对照组比较均明显降低（P＜0．05,P＜0．01）。（2）亚低温3小时组的Bcl－2细胞阳性率与对照组相比明显增加（P＜0．05）。（3）凋亡细胞阳性率与Bcl-2／Bax比值呈负相关关系（r＝－0．9759,P＜0．01）。结论 缺血性脑损伤的病理过程与细胞凋亡有关,Bcl-2／Bax比值能决定细胞凋亡的发生。亚低温能增强Bcl－2并降低Bax基因的表达,有抑制细胞凋亡的作用,是保护缺血神经元的重要方法之一。     

亚低温对凝血酶所致大鼠脑水肿及神经细胞凋亡的影响

目的 探讨亚低温对凝血酶所致大鼠脑组织水肿及神经细胞凋亡的影响。方法 通过立体定位向大鼠颅内(基底节区)注射凝血酶,建立凝血酶所致的脑组织损伤大鼠模型。用干、湿重法测定脑组织水肿程度,用碘化丙啶(PI)染色流式细胞仪及透射电镜检测细胞凋亡百分率,分别观察了常温凝血酶组、常温对照组、亚低温凝血酶组和亚低温对照组大鼠脑组织水肿和神经细胞凋亡百分率。结果 与常温凝血酶组相比,亚低温凝血酶组大鼠脑组织水肿明显减轻(P<0.05),凋亡细胞百分率也明显降低(P<0.05)。结论 亚低温能减轻凝血酶所致脑组织水肿和减少神经细胞凋亡。     

亚低温对大鼠局灶性脑缺血后细胞凋亡及Caspase-3的影响

目的 探讨亚低温对脑缺血损伤的保护作用。方法 用原位末端标记（TUNEL）和原位杂交技术分别观察亚低温组、常温组脑缺血不同时间点神经细胞凋亡的变化及Caspase-3的表达。结果 （1）常温组脑缺血后凋亡神经细胞主要分布于缺血周围区,随着时间的延长凋亡细胞数逐渐增加,至12h达高峰,24h后开始下降,7d时仍高于假手术组;（2）亚低温组脑缺血后,凋亡神经细胞也主要位于缺血周围区,数量相对较少,其变化规律与常温组相似,同一时间点相比较,亚低温组均显著低于常温组;（3）常温组脑缺血2h后,神经细胞Caspase-3开始表达,并随着时间的延长而增强,24h达高峰,其后逐渐下降,至7d略高于假手术组;（4）亚低温组脑缺血后,神经细胞Caspase-3的表达也主要位于缺血周围区,其变化规律与常温组相似,同一时间点相比较,亚低温组均显著低于常温组。结论 脑缺血后,缺血周围区神经细胞的凋亡是一个动态的渐进过程,Caspase-3基因在介导脑缺血损伤神经元凋亡过程中起关键作用。亚低温对短暂性脑缺血后的神经元凋亡有明显的抑制作用,亚低温可能通过Caspase-3途径抵抗脑缺血损伤。     

Biphasic cytochrome c release after transient global ischemia and its inhibition by hypothermia.

Hypothermia is effective in preventing ischemic damage. A caspase-dependent apoptotic pathway is involved in ischemic damage, but how hypothermia inhibits this pathway after global cerebral ischemia has not been well explored. It was determined whether hypothermia protects the brain by altering cytochrome c release and caspase activity. Cerebral ischemia was produced by two-vessel occlusion plus hypotension for 10 mins. Body temperature in hypothermic animals was reduced to 33 degrees C before ischemia onset and maintained for 3 h after reperfusion. Western blots of subcellular fractions revealed biphasic cytosolic cytochrome c release, with an initial peak at about 5 h after ischemia, which decreased at 12 to 24 h, and a second, larger peak at 48 h. Caspase-3 and -9 activity increased at 12 and 24 h. A caspase inhibitor, Z-DEVD-FMK, administered 5 and 24 h after ischemia onset, protected hippocampal CA1 neurons from injury and blocked the second cytochrome c peak, suggesting that caspases mediate this second phase. Hypothermia (33 degrees C), which prevented CA1 injury, did not inhibit cytochrome c release at 5 h, but reduced cytochrome c release at 48 h. Caspase-3 and -9 activity was markedly attenuated by hypothermia at 12 and 24 h. Thus, biphasic cytochrome c release occurs after transient global ischemia and mild hypothermia protects against ischemic damage by blocking the second phase of cytochrome c release, possibly by blocking caspase activity.     

亚低温对大鼠短暂性全脑缺血后皮质NOS亚型表达及神经元凋亡的影响

目的观察亚低温对大鼠全脑缺血再灌注后皮质3种一氧化氮合酶亚型表达、一氧化氮产生以及神经元凋亡的影响,探讨亚低温的神经保护机制。方法成年雄性SD大鼠,采用双侧颈总动脉阻断闭塞+低血压法制备短暂性全脑缺血动物模型,随机分为常温缺血组、亚低温缺血组和常温假手术对照组;常温时的脑温为36.5℃～37.5℃,肛温为35.9℃～36.9℃;亚低温时控制在32.5℃～33.5℃,相对应肛温为32.2℃～33.1℃;分别于缺血后及亚低温治疗后30min、2h、24h和72h观察短暂缺血对脑组织一氧化氮合酶亚型表达及神经元凋亡的影响,以及亚低温对缺血性脑损伤的保护作用。行神经元尼氏体亚甲蓝染色观察神经元数目及形态学的变化;免疫组化染色检测神经元型、诱导型和内皮型一氧化氮合酶的表达水平;应用硝酸还原酶法检测硝酸盐/亚硝酸盐水平的变化;采用TUNEL染色法并结合电子显微镜观察神经元凋亡的变化。结果常温缺血组大鼠额叶皮质3种一氧化氮合酶亚型表达水平及硝酸盐/亚硝酸盐含量均明显高于常温假手术对照组(P<0.05或P<0.01),出现凋亡神经元;低温缺血组大鼠3种一氧化氮合酶亚型表达水平和硝酸盐/亚硝酸盐含量明显低于常温缺血组(P<0.05或P<0.01),未检测到凋亡神经元。结论脑缺血后一氧化氮参与了神经元的凋亡过程,而亚低温治疗可以     

局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血后神经元凋亡的影响

目的　研究局部亚低温对脑缺血后 Bax、Bcl- 2、细胞色素 C(Cyt C)和 caspase- 3表达的影响 ,揭示亚低温的脑保护机制。方法　采用改良的 L onga法制备永久性大鼠 MCAO模型。低温组在缺血后立即给予贴敷式局部亚低温 (33℃ )治疗 2 h。在缺血后 2 h、6 h、12 h、2 4 h、3d、1w和 2 w取脑 ,进行 HE染色 ,并采用 SABC法进行免疫组化染色 ,检测 Bax、Bcl- 2、Cyt C和 caspase- 3的表达。结果　脑缺血后 2 h,脑梗死病灶周围区即出现 Bax、Bcl- 2、Cyt C和caspase- 3免疫阳性细胞 ,在缺血 2 4 h达到高峰 ,之后开始逐渐减低 ,但在 2 w时仍可见少量免疫阳性细胞。 Bax、CytC和 caspase- 3在缺血中心区和周围区均有表达 ,而 Bcl- 2主要表达于脑梗死周围区。与常温组相比 ,低温组 Bcl- 2表达显著增加 ,而 Bax、Cyt C和 caspase- 3显著减低。低温组 Bax/ Bcl- 2比值在 2 4 h达到最低。结论　亚低温能促进 Bcl-2表达 ,抑制 Bax、Cyt C和 caspase- 3表达 ,其脑保护机制可能与促进蛋白质合成有关。亚低温可降低 Bax/ Bcl- 2比值 ,减少神经元凋亡。     

NADPH oxidase mediates striatal neuronal injury after transient global cerebral ischemia

Medium spiny neurons (MSNs) constitute most of the striatal neurons and are known to be vulnerable to ischemia; however, the mechanisms of the vulnerability remain unclear. Activated forms of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase (NOX), which require interaction between cytosolic and membrane-bound subunits, are among the major sources of superoxide in the central nervous system. Although increasing evidence suggests that NOX has important roles in neurodegenerative diseases, its roles in MSN injury after transient global cerebral ischemia (tGCI) have not been elucidated. To clarify this issue, C57BL/6 mice were subjected to tGCI by bilateral common carotid artery occlusion for 22 minutes. Western blot analysis revealed upregulation of NOX subunits and recruitment of cytosolic subunits to the cell membrane at early (3 to 6 hours) and late (72 hours) phases after tGCI. Taken together with immunofluorescent studies, this activation arose in MSNs and endothelial cells at the early phase, and in reactive microglia at the late phase. Pharmacological and genetic inhibition of NOX attenuated oxidative injury, microglial activation, and MSN death after tGCI. These findings suggest that NOX has pivotal roles in MSN injury after tGCI and could be a therapeutic target for brain ischemia.