气管内滴入与雾化博莱霉素致小鼠肺纤维化模型的比较研究

摘要：目的比较气管内滴入与气管内雾化博莱霉素溶液复制的肺纤维化小鼠模型病理生理特征。方法小鼠麻醉后分别采用气
管内滴入（ITI组）与气管内雾化（ITA组）博莱霉素（5 mg/kg）的方法复制肺纤维化小鼠模型,同期用伊文斯蓝取代博莱霉素显示
不同给药方法药物的肺内分布。在博莱霉素处理14 d后处死小鼠,分别取肺组织行肺系数及肺组织匀浆检测羟脯氨酸含量、肺
组织HE染色进行病理评分及Masson染色进行纤维化评分。结果大体标本可见气管内雾化伊文斯蓝较气管内滴入在各肺叶
中分布更均匀。博莱霉素处理后,ITI组与ITA组小鼠肺系数、总病理评分及纤维化评分均较对照组升高（P<0.05）,但ITI组与
ITA组间无显著差异（P>0.05）。ITI组小鼠肺纤维化病灶分布不均,严重程度不一,各肺叶间组织病理评分与纤维化评分的差异
有统计学意义（P=0.016;P=0.038）,而ITA组小鼠各肺叶间评分的差异无统计学意义（P=0.446;P=0.290）。ITA组小鼠的肺组织
匀浆中羟脯氨酸含量高于ITI组（P=0.020）。结论气管内滴入与气管内雾化博莱霉素溶液均引起肺组织损伤与纤维化,而气管
内雾化博莱霉素可引起更广泛、更均匀的组织损伤与纤维化。
     

脂多糖经不同给药方式致急性肺损伤小鼠模型的比较研究

目的比较脂多糖(LPS)经三种不同给药方式复制急性肺损伤(ALI)小鼠模型的病理损伤特征及炎症反应程度,优化ALI小鼠造模方法。方法 BLAB/c小鼠麻醉后分别采用气管内雾化(ITA组)、气管内滴入(ITI组)和腹腔注射(IPI组)LPS(5 mg/kg)的方法复制ALI小鼠模型,同时用伊文斯蓝取代LPS显示气管内雾化和滴入时药物的肺内分布。LPS给药2 h后处死小鼠,分别取肺组织行干湿重比、HE染色及病理评分,Western blot检测肺组织IκB-α含量及IκB-α、NF-κB p65磷酸化水平,qRT-PCR检测肺组织TNF-α和IL-1βmRNA转录强度。结果 ITA组伊文斯蓝在小鼠各肺叶中分布较ITI组更均匀。LPS给药2 h后ITA组、ITI组和IPI组小鼠肺组织干湿重比和病理损伤评分均显著高于正常对照组(NC组,P<0.01),其中ITA组病理损伤评分最重(P<0.05)。Westernblot结果显示ITA组小鼠肺组织IκB-α降解程度、IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平均显著高于ITI组(P<0.05),而ITI组又显著高于IPI组(P<0.05)。qRT-PCR结果显示ITA组小鼠肺组织TNF-α和IL-1βmRNA转录强度均显著高于ITI组(P<0.05),而ITI组又显著高于IPI组(P<0.05)。结论气管内雾化LPS造成的肺组织病理损伤和炎症反应更加广泛和严重,且具有手术创伤小、操作方便等特点,是复制急性肺损伤小鼠模型的优选方案。     

N-乙酰半胱氨酸下调NOX4表达抑制博莱霉素诱导纤维化小鼠的氧化损伤

目的观察活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠的影响,探讨NAC抑制肺纤维化的可能机制。方法将45只SPF级雌性昆明小鼠随机分为3组：对照组（气管内雾化生理盐水）、纤维化组（气管内博莱霉素3mg／kg溶于100μL生理盐水内雾化）、NAC处理组（气管内雾化博莱霉素后,NAC400mg·kg-1·d-1溶于100μL生理盐水内灌胃）。处理后第28d收集样本。小鼠左肺置于10％中性甲醛固定,石蜡包埋切片后行HE与Masson染色;右肺碱水解法检测肺组织羟脯氨酸的含量;比色法检测血清丙二醛（MDA）的浓度和总抗氧化能力（T-AOC）;提取肺组织总蛋白和总RNA,分别采用Westernblot和RT—PCR法检测NADPH氧化酶1（NOX1）、NOX2及NOX4的基因和蛋白表达水平。结果NAC处理组小鼠肺组织病理损伤较纤维化组减轻,气道上皮下胶原沉积及肺组织羟脯氨酸含量明显减少（P〈0．05）,血清MDA浓度较纤维化组显著降低（P〉0．05）,血清T—AOC较纤维化组升高（P=0．029）。纤维化组NOX1／2／4基因及蛋白表达较对照组显著增强（P〈0．05）,NAC干预后NOX1／2／4基因及蛋白表达水平均有所下调,NOX4蛋白表达明显低于纤维化组（P=0．001）。与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论NAC能显著改善博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化,其机制与抑制NOX4蛋白表达、下调氧化应激损伤有关。     

结缔组织生长因子单链抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化程度及羟脯氨酸含量的影响

目的:研究结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(ScFv)对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠的治疗作用.方法:昆明小鼠36只,随机分为对照组、模型组和治疗组,每组12只;对照组气管内滴入生理盐水,模型组和治疗组气管内滴入博莱霉素(5 mg·kg-1)制备肺纤维化模型.第2天开始治疗组尾静脉注射ScFv(4 mg·kg-1),对照组和模型组给予等量的生理盐水(约100 μl·次-1),3次·周-1.第14、28天分两批处理动物,用HE染色行病理组织学检查并进行纤维化分级,用酸水解法测定肺组织羟脯氨酸的含量.结果:对照组小鼠肺组织无纤维化形成;模型组肺组织可见肺泡破坏,肺泡间隔大量纤维化,肺组织中羟脯氨酸含量及纤维化程度较对照组明显增高(P<0.01).治疗组肺组织纤维化程度较模型组明显减轻,且羟脯氨酸含量较模型组显著降低(P＜0.01).结论:ScFv作为CTGF单链抗体可明显减轻纤维化程度,有可能成为治疗肺纤维化一种新的药物.     

两种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂对小鼠肺纤维化的干预作用比较

目的比较两种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)吉非替尼与厄罗替尼对博莱霉素致小鼠肺纤维化的干预作用。方法 40只雌性BALB/c小鼠分为对照组(NS组)、博莱霉素纤维化组(BLM组)、吉非替尼组(GE组)和厄罗替尼组(ER组)。实验第1d,BLM组、GE组和ER组小鼠经气管滴入博莱霉素致肺纤维化,NS组气管内滴入生理盐水;同时,GE组及ER组分别口服吉非替尼(20mg.kg-1.d-1)和厄罗替尼(25mg.kg-1.d-1),余两组口服生理盐水。持续给药2周后杀鼠取肺,左肺石蜡包埋切片行HE染色与Masson染色,免疫组化检测总EGFR及磷酸化EGFR;右肺匀浆检测羟脯氨酸含量。结果吉非替尼与厄罗替尼均能明显减轻博莱霉素引起的肺结构破坏、胶原沉积,降低磷酸化EGFR表达及纤维化小鼠肺羟脯氨酸含量(P0.05),两者的上述作用无明显差异(P0.05)。结论 EGFR-TKI通过抑制EGFR磷酸化,有效减轻博莱霉素诱导的肺纤维化形成,为肺纤维化的靶向治疗提供了新思路。     

苦胆草对博来霉素致大鼠肺纤维化的防治作用

［摘要］目的　探讨苦胆草对博莱霉素致大鼠肺纤维化的防治作用．方法　健康成年SD大鼠40只（200±20）g随机分为4组:正常对照组（未做处理）、生理盐水组（气管滴入生理盐水）、模型组（气管滴入博莱霉素5 mg/kg）和苦胆草干预组［灌胃给予苦胆草片混悬液0.705 g/(100 g.d),2次/d、共5次,末次给药1 h,气管滴入博莱霉素5 mg/kg］．分别于气管内滴注后14 d和28 d处死动物,检测各项指标．采用碱水解法测定肺组织中羟脯氨酸（HYP）含量,HE染色和银染观察肺组织病理变化．结果　与正常对照组和生理盐水组比较,模型组大鼠肺组织HYP含量明显升高（P＜0.01）;与模型组比较,苦胆草干预组大鼠肺组织HYP含量明显降低（P＜0.01）;病理检查发现,模型组大鼠肺组织有明显肺纤维化样改变,苦胆草干预组可明显减轻肺纤维化程度．结论　苦胆草能降低博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织羟脯氨酸含量,减轻肺纤维化程度,有望成为防治肺纤维化的候选药物．     

吉非替尼对博莱霉素致肺纤维化小鼠α平滑肌肌动蛋白的抑制作用

目的 观察吉非替尼对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠a平滑肌肌动蛋白(a-SMA)表达的影响,探讨EGFR在肺纤维化上皮间质转分化中的作用.方法 将30只SPF级雌性BALB/c小鼠分为三组:对照组(气管滴人生理盐水)、纤维化组(气管滴人博莱霉素3 mg/kg )、纤维化吉非替尼干预组(气管滴人博莱霉素+吉非替尼灌胃20 mg/Kg ).实验第14天杀鼠取肺,肺组织石蜡切片行HE染色与Masson染色;RT-PCR法检测a-SMA的mRNA表达水平;免疫组化检测总EGFR,磷酸化EGFR及a-SMA表达.结果 纤维化吉非替尼干预组肺病理损伤较纤维化组减轻,气道上皮下胶原沉积减少,气道上皮及肺间质细胞磷酸化EGFR表达评分下降(P<0.05);同时,肺a-SMA的mRNA表达减少,免疫组化评分也明显降低(P<0.05).结论 吉非替尼抑制博莱霉素诱导小鼠肺纤维化可能与其抑制EGFR活性,下调a-SMA表达有关.     

浓当归注射液对博莱霉素致鼠肺纤维化治疗作用的研究

为观察当归对博莱霉素致鼠肺纤维化后的治疗作用,对用博莱霉素气管内灌注30d后的SD大鼠,治疗组给予25%当归注射液每日注射共15d,对照组注射生理盐水,结果显示：治疗组肺组织学检查,纤维化明显轻于对照组;肺间质所占面积百分比显著低于对照组;肺匀浆羟脯氨酸含量显著减少（P＜0.01)。结果表明,当归能延缓博莱霉素诱导的肺纤维化进程,缓解其所致的肺纤维化病变。     

经鼻滴入博莱霉素致小鼠肺纤维化模型的建立及其病理演变

目的 经鼻快速滴人博莱霉素复制小鼠肺纤维化模型,观察肺纤维化模型小鼠的病理形态学改变及其羟脯氮酸含量变化,鉴定肺纤维化模型的成功建立.方法 经鼻滴人博莱霉素建立小鼠肺纤维化模型.分别于造模第14天和第28天后,取肺组织行HE染色和天狼猩红染色,取心、肝、脾、肾、脑组织行HE染色,光镜下观察组织病理学变化;造模第28天后用样本碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸(HYP)的含量.结果 ①肺组织病理形态学改变:造模第14天和第28天后模型组小鼠肺泡炎及纤维化程度均明显高于阴性对照组,并且在造模第28天后肺纤维化程度进一步加重;②肺组织中HYP含量:与阴性对照组比较,模型组显著升高(P<0.05).结论 经鼻滴入博莱霉素可以成功复制小鼠肺纤维化模型,肺纤维化模型小鼠HYP含量升高.     

地塞米松对大鼠肺纤维化及其肺组织ET-1的影响

目的探讨地塞米松对实验性大鼠肺纤维化肺组织内皮素-1（Endothelin-1,ET-1）的影响。方法实验分为博莱霉素组、地塞米松组和正常对照组。博莱霉素组和地塞米松组给以博莱霉素（5mg/kg）气管内注射复制大鼠肺纤维化模型,正常对照组以生理盐水替代。气管内注药,次日地塞米松组给以腹腔注射地塞米松（1mg/kg）隔日1次,博莱霉素组和正常对照组以生理盐水替代。造模后第28d处死大鼠,测定肺组织ET-1和羟脯氨酸（HYP）含量,并进行组织病理学观察。结果博莱霉素组肺组织内羟脯氨酸（790.530±131.930μg/g）高于正常对照组（570.964±62.411μg/g）和地塞米松组（584.447±51.921μg/g）（P〈0.01）,病理为肺纤维化改变。博莱霉素组肺组织中的ET-1水平（61.001±2.722pg/mL）高于正常对照组（57.618±2.731pg/mL）和地塞米松组（56.083±3.379pg/mL）（P〈0.01）。结论ET-1可能参与肺纤维化的形成,地塞米松可能通过降低ET-1水平抑制肺纤维化形成。     

小剂量多次尾静脉注射与气管内滴注博来霉素致小鼠肺纤维化模型的比较研究

目的：与单剂量气管内滴药模型比较,研究小剂量多次尾静脉注射博莱霉素（bleomycin,BLM）致小鼠肺纤维化的特点与差异。方法：40只雄性ICR（Iastitute for Cancer Research）小鼠随机分为模型组I、模型组II和两个对照组,每组10只。模型组I尾静脉注射10mg／kgBLM均持续14d;模型组II于实验第一天气管内注入5mg／kg BLM,两对照组分别给与等量生理盐水,28aM处死并收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）。检测BALF细胞总数及蛋白含量、肺系数、羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）,观察肺组织病理改变。结果：1）两种给药方法均能使肺组织发生明显的炎性和纤维化反应,两模型组BALF细胞总数及蛋白含量、肺系数、HYP含量、肺间质损伤指数较两对照组均显著增加（P〈0．01）;2）模型组I病灶主要分布在胸膜下及血管周围,模型组II则主要分布在支气管和细支气管周围;3）模型组II病死率高于模型组I;4）模型组IIBALF蛋白含量高于模型组I（P〈0．05）;BALF细胞总数、肺系数、HYP含量、肺间质损伤指数两组间差异无统计学意义（p〉0．05）。结论：小剂量多次尾静脉注射与气管内滴入BLM都能成功制备肺间质纤维化动物模型,但两者纤维化形成的部位存在着一定的差异,小剂量多次尾静脉给药肺间质纤维化模型更接近特发性肺间质纤维化。     

博莱霉素诱导肺纤维化小鼠模型的建立及特征

目的探讨博莱霉素气管灌注诱导肺纤维化小鼠模型在不同时期分子生物学及组织病理学的改变。方法 6～8周龄C57BL/6小鼠60只,30只为正常对照组,30只以博莱霉素2.5 mg/kg单次气管灌注建立小鼠肺纤维化模型（模型组）,以肺组织病理学形态及基因表达水平为指标,判断模型小鼠肺纤维化发展阶段。结果正常对照组小鼠的肺组织无明显病理改变,模型组小鼠肺部有不同程度的肺泡结构破坏、炎性细胞浸润以及大量以胶原为主的细胞外基质沉积。基因表达检测结果显示:模型组灌注博莱霉素1～2周,小鼠肺组织白介素（IL）-4、IL-13较正常对照组升高,而3～5周模型组与正常对照组无差异（P>0.05）。模型组肺组织中胶原基因Colla2、Cola13、结缔组织生长因子（CTGF）、转化生长因子-β₁（TGF-β₁）均较正常对照组有不同程度的升高,与组织病理学改变一致。结论博莱霉素2.5 mg/kg单次气管灌注可成功建立肺纤维化小鼠模型;博莱霉素灌注早期以肺部炎性浸润为主,第3周时肺纤维化达到高峰,第5周开始纤维化有所缓解。     

不同品系小鼠肺纤维化模型的比较研究

目的  通过对博来霉素诱导3个不同品系小鼠肺纤维化程度的比较研究,寻找最适合研究肺纤维化的小鼠模型。方法  选用C57BL/6、BALB/c以及KM 3种品系的小鼠,分别设为模型组和对照组。模型组向气管注射博来霉素（5 mg/kg）,正常对照组注入等量的生理盐水。3个品系的小鼠分别于造模后的第7天、14天和28天处死8只,观察在不同的时间点肺系数、羟脯氨酸含量的变化以及通过Masson染色观察肺纤维化程度的改变。结果  各模型组不同时间点的肺系数、羟脯氨酸含量和肺组织的病理学改变积分与对照组比较,差异有统计学意义（P <0.05）;C57BL/6模型组小鼠在不同时间点肺系数、羟脯氨酸含量和肺组织病理学改变积分与BALB/c和KM比较,差异有统计学意义（P <0.05）。结论  C57BL/6小鼠对博来霉素反应敏感,肺纤维化明显,是3个品系小鼠中研究肺纤维化的最理想模型。

     

肺特灵Ⅲ对博莱霉素致小鼠肺纤维化的影响

目的观察肺特灵Ⅲ对博莱霉素致小鼠肺纤维化的干预作用。方法通过气管内注射博莱霉素制作小鼠肺纤维化模型,给予肺特灵Ⅲ灌胃（ig）治疗14d后,进行肺系数、肺组织病理形态及羟脯氨酸（HYP）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）等血清和肺组织中生化指标水平的测定和分析,观察肺特灵Ⅲ对小鼠肺纤维化的影响。结果经肺特灵Ⅲ治疗后,与模型组相比,各组小鼠肺系数和HYP含量显著降低,小鼠血清中T-AOC增强、MDA含量明显降低,肺组织中GSH含量明显增加,肺泡炎和肺纤维化程度明显减轻。上述变化均有统计学意义（皆P〈0.05或〈0.01）。结论肺特灵Ⅲ对博莱霉素致鼠肺纤维化早期病变有一定的治疗作用,其机制可能与抑制炎症细胞的浸润活化、抗氧化作用及抑制胶原的形成有关。     

Gefitinib attenuates murine pulmonary fibrosis induced by bleomycin

Background Gefitinib, an inhibitor of epidermal growth factor receptor （EGFR） tyrosine kinase, is an effective treatment for epithelial tumors, including non-small cell lung cancer （NSCLC）, and is generally well tolerated.However, some clinical trials revealed that gefitinib exposure caused lung fibrosis, a severe adverse reaction.This study investigated the effect of gefitinib on lung fibrosis in mice.Methods We generated a mouse model of lung fibrosis induced by bleomycin to investigate the fibrotic effect of gefitinib.C57BL/6 mice were injected intratracheally with bleomycin or saline, with intragastric administration of gefitinib or saline.Lung tissues were harvested on day 14 or 21 for histology and genetic analysis.Results The histological results showed that bleomycin successfully induced lung fibrosis in mice, and gefitinib prevented lung fibrosis and suppressed the proliferation of S100A4-positive fibroblast cells.In addition, Western blotting analysis revealed that gefitinib decreased the expression of phosphorylated EGFR （p-EGFR）.Furthermore, quantitative real-time PCR （qRT-PCR） demonstrated that gefitinib inhibited the accumulation of collagens Ⅰ and Ⅲ.Conclusions These results reveal that gefitinib reduces pulmonary fibrosis induced by bleomycin in mice and suggest that administration of small molecule EGFR tyrosine kinase inhibitors has the potential to prevent pulmonary fibrosis by inhibiting the proliferation of mesenchymal cells, and that targeting tyrosine kinase receptors might be useful for the treatment of pulmonary fibrosis in humans.     

核因子κB反义寡核苷酸对博莱霉素致小鼠肺间质纤维化形成及白细胞介素4表达的影响

目的探讨核因子-κB（NF-κB）在博莱霉素（BLM）致肺间质纤维化小鼠支气管肺泡灌洗细胞中的表达和对白细胞介素4（IL-4）的影响,及其反义寡核苷酸（ASON）对肺间质纤维化的干预作用。方法将C5781／6小鼠随机均分为4组,对照组和BLM组经尾静脉注射生理盐水,ASON组注射p65ASON,SON组注射p65顺义寡核苷酸（SON）,6h后,BLM组、ASON组、SON组气管内注射博莱霉素-A5（BLM-A5）,对照组注射生理盐水。对照组在气管注射后0．5、1、14d,其余各组在0．5、1、3、7、14、28d处死小鼠,行支气管肺泡灌洗,灌洗液测IL4,灌洗细胞行P65和IL-4免疫组织化学染色。每组另取5只小鼠,在气管注射后28d处死,左肺行HE及Masson三色病理染色,右肺测羟脯氨酸。结果（1）BLM组和SON组肺病理可见大片实变及胶原沉积。而ASON组无实变,肺间质可见少量胶原纤维。（2）BLM组和SON组肺组织羟脯氨酸含量较对照组明显增高,ASON组明显低于BLM组和SON组。（3）BLM组和SON组支气管肺泡灌洗细胞的胞核p65表达明显高于对照组,亦明显高于ASON组。（4）BLM组和SON组支气管肺泡灌洗细胞IL-4的表达明显高于对照组,亦明显高于ASON组。（5）BLM组和SON组支气管肺泡灌洗液IL-4含量明显高于对照组,亦明显高于ASON组。（6）BLM组和ASON组小鼠支气管肺泡灌洗细胞表达的p65与IL-4均呈正相关（r=0．890,P〈0．05;r=0．909,P〈0．05）。结论BLM致肺间质纤维化的病理过程中,支气管肺泡灌洗细胞NF-κB的表达明显增强,并可能通过IL-4途径形成肺间质纤维化。NF-κBASON可明显抑制NF-κB的活化和IL-4的表达,并进而抑制BLM所致的肺间质纤维化。     

益气化纤汤对博来霉素A5诱导的大鼠肺纤维化的影响

目的：研究益气化纤汤对博莱霉素A5（BLMA5）诱导的大鼠肺间质纤维化的治疗作用。方法：利用博莱霉素气管内注射制作大鼠肺纤维化模型。90只健康雄性SD大鼠被随机分为正常组、模型组、强的松组和小、大剂量益气化纤汤组。在同样条件下，药物灌胃饲养28d后，断颈处死。取双肺标本进行病理切片、测定转化生长因子（TGF-β1）表达和羟脯氨酸（HYP）含量。结果：从病理切片、肺组织中TGF-β1表达和肺组织匀浆中羟脯氨酸的含量方面来看，药物治疗各组的肺纤维化均比模型组轻。结论：益气化纤汤对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化有一定的治疗作用，其作用机制可能通过抑制TGF-β1生成实现。