DNA损伤激活的长链非编码RNA促进多发性骨髓瘤细胞增殖及耐药研究

摘要 目的：探讨DNA损伤激活的长链非编码RNA(NORAD)对多发性骨髓瘤（MM）细胞增殖及对硼替佐米（BTZ）化疗耐药性的影响。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测健康人和骨髓瘤患者、不同MM细胞系中NORAD表达差异，并分析其与MM患者生存率关系；运用慢病毒转染技术，干扰细胞系中NORAD的表达，检测其表达差异；定量PCR(qPCR)检测骨髓瘤细胞系中人类非编码RNA-144a-3p（hsa-miR-144a-3p）的表达；采用双荧光酶素报告验证NORAD和hsa-miR-144a-3p的结合；通过RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验进一步验证LncRNA和miRNA的结合；细胞计数试剂8（CCK8）法检测各细胞处理后细胞活性。细胞克隆试验检测细胞增殖能力。结果：MM患者细胞系中NORAD常高表达，提示预后差，生存期短；敲除NORAD基因后，MM耐药细胞系对BTZ药物敏感性增加。MM患者hsa-miR-144a-3p高表达，在骨髓瘤细胞系中加用miR-144a-3p类似物时细胞增殖能力下降；NORAD低表达可显著抑制细胞增殖，细胞对药物敏感性增强。细胞克隆形成实验也证实NORAD低表达可抑制癌细胞增殖。结论：NORAD高表达可增强 MM 对 BTZ 化疗耐药性，NORAD可直接与hsa-miR-144a-3p结合，上调其在MM细胞中的表达，进一步调控癌细胞增殖，同时调控患者对BTZ药物敏感性。     

在多发性骨髓瘤中IL-8基因多态性及硼替佐米的干预效果

目的 探讨多发性骨髓瘤(MM)中IL-8基因多态性及硼替佐米(万珂)的干预效果.方法 在多种细胞株中找到3个细胞株分别含有IL-8启动子区-251位的三个基因多态性,加入万珂后检测分析各细胞株生存率,并测定各细胞株IL-8水平以及IL-8 mRNA表达水平.结果 基因型为A/A的纯合子细胞株IL-8表达量最高,对万珂最敏感,T/T细胞株IL-8表达量最低对万珂最不敏感.结论 MM中IL-8基因存在多态性,且与万珂干预治疗有关.     

LAPTM4β在人结直肠癌耐药细胞株中的表达及意义

目的建立耐奥沙利铂(L-OHP)的人结直肠癌耐药细胞株(HT-29/L-OHP),检测相关耐药基因LAPTM4β的表达,探讨其在L-OHP耐药中的作用机制。 方法采用药物浓度梯度递增间歇诱导法建立人结直肠癌耐药株HT-29/L-OHP;应用LAPTM4β-35蛋白抑制剂作用于HT-29/L-OHP细胞株后,流式细胞技术检测细胞凋亡,比较其与HT-29/L-OHP细胞株对于L-OHP的耐药情况;应用RT-PCR检测LAPTM4β mRNA的表达;应用Western blot测定LAPTM4β-35蛋白的表达。 结果成功建立人结直肠癌耐药细胞株HT-29/L-OHP,流式细胞技术检测结果表明应用LAPTM4β-35蛋白抑制剂作用于HT-29/L-OHP细胞株后,其对于L-OHP的耐药明显低于HT-29/L-OHP细胞株。HT-29/L-OHP细胞株中LAPTM4β mRNA表达水平明显高于亲本细胞株HT-29,分别为5.613±0.139和1.105±0.187,(P<0.05),LAPTM4β-35蛋白在HT-29/L-OHP细胞和HT-29细胞的相对表达量2.203±0.080和1.033±0.070,(P<0.05)。 结论LAPTM4β在结直肠癌耐药细胞株中过表达,与结直肠癌奥沙利铂耐药密切相关,可以作为结直肠癌耐药的一个敏感的生物学标志物。     

去甲斑蝥酸钠对耐顺铂肺腺癌A549/DDP细胞的逆转作用及机制

目的 探讨去甲斑蝥酸钠(SNCTD)对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作用及可能分子机制.方法 (1)采用CCK法筛选出SNCTD对A549/DDP的无毒浓度(即对细胞抑制率＜10%的药物浓度),并检测出顺铂及与无毒浓度SNCTD联合对耐药细胞株的IC50;(2)采用流式细胞仪检测无毒浓度SNCTD对细胞内罗丹明123的蓄积情况;(3)采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测1、2倍无毒浓度SNCTD处理细胞48h后耐药相关基因mdrlmRNA,MRP1 mRNA的表达.结果 (1)SNCTD对A549/DDP的无毒浓度为5μg/ml,与顺铂联合用药降低A549/DDP的耐药性,逆转倍数为1.97;(2)无毒浓度SNCTD处理耐药细胞48h后细胞内罗丹明123荧光强度明显增强(F=36.99,P＜0.05);(3)1、2倍无毒浓度SNCTD处理耐药细胞后mdr1,MRP1mRNA表达明显减低,并具有浓度依赖性.结论 SNCTD对A549/DDP具有耐药逆转作用,其作用机制可能与下调耐药相关基因mdr1,MRP1的表达,影响膜蛋白外排泵功能有关.     

miR-21转染对卵巢癌细胞株A2780/Taxol紫杉醇耐药性的影响及机制探讨

目的探讨microRNA-21(miR-21)在卵巢癌化疗耐药中的作用及机制。方法荧光定量RT-PCR法检测miR-21在人卵巢癌细胞株A2780及A2780/Taxol的表达水平,合成miR-21的干扰序列,以脂质体为载体转染A2780/Taxol细胞;MTT法检测细胞转染前后对紫杉醇的耐药性;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;蛋白质印迹法检测磷酸酶基因(PTEN)、BAX及Bcl-2蛋白。结果 miR-21表达下调后,A2780/Taxol对紫杉醇的IC50值明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显增加(P<0.05),细胞内PTEN、BAX蛋白表达水平增加,Bcl-2表达降低。结论 miR-21在人卵巢癌耐药株中呈高表达,其可能是介导人卵巢癌耐药的主要因素之一,具体机制可能是降低PTEN、BAX及升高Bcl-2来介导肿瘤细胞耐药。     

三叶青提取物诱导肺癌A549株细胞凋亡的研究

目的探讨三叶青提取物对肺癌细胞A549的作用,初步探讨其机制。方法采用体外细胞培养技术,采用流式细胞仪检测A549细胞株的细胞周期分布相和细胞凋亡率。结果流式细胞仪检测结果显示:加三叶青提取物10-1g/L、10-2g/L处理后的细胞凋亡比例明显高于对照组。结论三叶青提取物对A549细胞具有诱导凋亡的作用。     

多发性骨髓瘤患者p16基因甲基化及砷剂诱导去甲基化的研究

目的探讨p16基因启动子区CpG岛甲基化在多发性骨髓瘤(MM)患者发病中的作用以及三氧化二砷(As2O3)诱导p16基因的去甲基化作用。方法采用巢式甲基特异性PCR法检测MM患者以及利用As2O3作用前后人MM细胞株U266的p16基因的甲基化状态,RTPCR检测U266细胞用药前后p16基因mRNA的表达变化,生长曲线、MTT法检测As2O3对细胞的生长和增殖抑制。利用流式细胞仪检测DNA含量分析法探讨As2O3对骨髓瘤细胞系U266周期的影响。结果MM患者p16基因的甲基化比例为54.8%,U266细胞存在p16基因甲基化,p16基因不表达,As2O3作用后p16基因甲基化程度明显减弱至消失,与未处理组相比,不同剂量作用72h后p16基因表达阳性条带灰度值与βactin比值分别为0.22±0.10、0.59±0.11、0.68±0.09,阳性对照灰度比值为0.77±0.13,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论p16基因甲基化在MM患者中较为常见,这可能为MM的诊断和治疗提供借鉴;As2O3可诱导p16基因去甲基化,使p16基因表达上调,恢复其活性,为去甲基化治疗提供新思路。     

CD56与新诊断多发性骨髓瘤的预后关系分析

目的:评估骨髓瘤细胞CD56表达在新诊断多发性骨髓瘤（MM）患者中的预后价值。方法:选择2011年1月1日至2021年1月1日在首都医科大学北京朝阳医院治疗的332例新诊断MM患者,中位年龄为60岁,男女比例为1.2∶1,所有患者在诱导治疗前均利用流式细胞术的方法检测骨髓瘤细胞表面CD56的表达,分析骨髓瘤细胞CD56...     

三氧化二砷及干扰素对U266细胞TRAIL和其受体表达的影响

目的 探讨三氧化二砷（As2O3）联合IFNα-2a治疗人多发性骨髓瘤（MM）的可行性。方法将人MM细胞系U266细胞株随机分为4组,空白对照组不行特殊处理,As2O3组加入As2O3,IFNα-2a组加入IFNα-2a,As2O3＋IFNα-2a组同时加入As2O3及IFNα-2a。孵育48h后用双标记流式细胞术检测细胞凋亡率,用流式细胞仪检测细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其受体表达。结果As2O3＋IFNα-2a组细胞凋亡率、TRAIL及其受体表达均显著高于其他三组（P〈0．05）,空白对照组TRAIL及其受体表达均显著低于其他三组（P〈0．05）。结论As2O3,及IFNα-2a均可上调TRAIL及其受体表达,促进U266细胞凋亡,且两者有协同作用;此为临床治疗MM提供了新的思路。     

驱动蛋白家族成员2C参与卵巢癌化疗耐药的机制研究

目的探讨KIF2C在上皮性卵巢癌化疗耐药中的作用及其潜在的分子机制。方法检测驱动蛋白家族成员(KIF)2C在顺铂敏感细胞株A2780和顺铂耐药细胞株A2780DDP中的差异表达。在A2780细胞株中加入不同浓度、不同时间的顺铂, 检测KIF2C的差异表达。用慢病毒感染A2780DDP细胞株, 构建KIF2C稳定过表达的卵巢癌细胞株(KIF2C-OV)。将相同浓度的顺铂添加到KIF2C-OV及其对照组(Ctrl-OV)细胞系中。用CCK-8检测KIF2C过表达对耐药细胞株A2780DDP细胞增殖的影响。最后, 对KIF2C在卵巢癌细胞系中发挥耐药作用的分子机制进行初步探索。结果 KIF2C在A2780DDP细胞株中显著低表达。在A2780细胞株中加入顺铂后, KIF2C的表达随着顺铂浓度和作用时间的增加而降低。用慢病毒感染A2780DDP细胞株, 构建KIF2C-OV。加入顺铂后, KIF2C-OV细胞株的增殖能力明显低于Ctrl-OV细胞系。p-Erk在A2780DDP细胞株中表达升高。在A2780细胞株中加入不同浓度梯度及不同时间梯度的顺铂, p-Erk的表达随顺铂浓度的升高而升高,...     

多发性骨髓瘤多药耐药机制及治疗学进展

多发性骨髓瘤（MM）是原发于浆细胞的恶性肿瘤,其对化疗药物产生耐药是影响疗效的主要障碍。虽然多数MM患者对初次化疗敏感,但最终都会复发。最新研究表明,临床难治MM患者有多种多药耐药（MDR）机制,。如P-gp介导的MDR、肺耐药相关蛋白（LRP）过度表达、BCL-X表达引起的凋亡抑制、糖皮质激素受体异常、谷胱甘肽和谷胱甘肽转移酶（GSH/GST）增高及拓朴异构酶Ⅱ表达下降等,而异博定等药物在逆转MDR方面有一定作用。近年来,强烈化疗,干扰素、大剂量化疗加移植等方法相继出现,为MM的治疗开辟了新途径。     

多发性骨髓瘤患者Sorcin基因表达与多药耐药的关系

应用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)技术 ,检测 32例多发性骨髓瘤 (MM)患者、2 7例非恶性血液病患者和健康人的 Sorcin基因表达水平。结果为 MM患者 Sorcin基因表达高于正常对照组 ,差异高度显著(P<0 .0 0 1) ;Sorcin基因阳性表达初诊组 4例 (2 2 .2 % )、缓解组 1例 (14 .3% )、复发难治组 5例 (71.4 % ) ,复发难治组高于初诊组和缓解组 ,差异显著 (分别为 P=0 .0 315 ,P=0 .0 4 89) ;临床耐药组 Sorcin基因阳性表达显著高于非临床耐药组 (P=0 .0 0 4 ) ;Sorcin基因阳性表达者缓解率为 2 0 .0 % ,阴性表达者为 86 .4 % ,差异高度显著 (P=0 .0 0 2 )。认为多发性骨髓瘤患者临床耐药与 Sorcin基因过度表达密切相关 ,Sorcin基因过度表达是影响预后的重要因素 ,可作为检测临床耐药和判断预后的指标之一     

人肺腺癌A549细胞系培美曲塞耐药细胞株模型的建立

目的建立人肺腺癌A549细胞培美曲塞耐药细胞株模型。方法以人肺腺癌A549细胞为亲本株,应用高浓度反复间歇法模拟临床给药模式建立人肺腺癌A549细胞培美曲塞耐药细胞株。MTT法绘制生长曲线、计算倍增时间,同时检测耐药株细胞对顺铂、依托泊苷、紫杉醇、长春新碱的药物敏感性。结果亲本株IC_50为(181.75±12.56)ng/ml,耐药株IC_50为(4930.40±129.71)ng/ml,最终获得耐药指数为27.18±1.16的人肺腺癌A549细胞培美曲塞耐药细胞株,命名为A549/PEM。A549和A549/PEM增殖速度接近,倍增时间分别为(62.78±1.06)h和(62.35±0.89)h(P=0.773)。A549/PEM同时对顺铂、依托泊苷耐药,耐药指数分别为(1.93±0.02)、(8.26±1.55);对紫杉醇、长春新碱敏感,耐药指数分别为(0.89±0.10)、(0.95±0.11)。结论本研究成功建立的人肺腺癌A549细胞培美曲塞耐药细胞株模型。     

全反式维甲酸对多种胰腺癌细胞的诱导凋亡作用

目的观察全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)能否诱导人胰腺癌细胞的凋亡。方法分别将人胰腺癌细胞SW1990、PaTu8988、BxPC3和ATRA共同孵育后,用MTT法检测细胞活性,分别用流式细胞仪检测、TUNEL和透射电镜观察细胞的凋亡。结果MTT法显示,ATRA对3株人胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988和BxPC3的生长均有明显的抑制作用(P<0.05)。流式细胞仪的检测、TUNEL和电镜的观察结果均证实ATRA诱导后,3株胰腺癌细胞株凋亡率均高于对照(P<0.01),并随诱导时间延长而增加。结论ATRA在体外能显著抑制多株胰腺癌细胞株的生长,并促进其凋亡。     

JNK信号通路介导MDR1/P-gp调控人结肠癌多药耐药

目的:探讨在人结肠癌多药耐药细胞株HCT8/V中JNK信号传导通路与多药耐药1(MDR1)基因表达的关系.方法:MTT法检测人结肠癌多药耐药细胞株HCT8/V及其敏感株HCT8细胞对多种抗肿瘤药物的敏感性;抑制JNK信号通路的激活后,采用双荧光素酶活性报告基因检测MDR1启动子转录活性的表达;实时荧光定量PCR检测MD...     

多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞CUL4A表达及意义

目的检测多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓单个核细胞中CUL4A mRNA表达,探讨其临床意义。方法采用实时荧光PCR相对定量法检测38例MM患者(MM组)和20例非血液肿瘤患者(对照组)骨髓单个核细胞CUL4A mRNA的表达情况。结果 MM组骨髓单个核细胞CUL4A mRNA相对表达量较对照组增加(P<0.05)。MM患者骨髓单个核细胞CUL4A mRNA相对表达量与临床分期、血清β2-MG水平相关(P均<0.05),与性别、年龄、免疫学分型不相关(P均>0.05)。治疗有效的MM患者骨髓单个核细胞CUL4A mRNA相对表达水平低于治疗无效患者(P=0.003)。结论 MM患者骨髓单个核细胞CUL4A mRNA表达上调可能是促进MM发展的因素之一,检测CUL4A可以为MM的诊断及治疗提供参考。     

全反式维甲酸对多种胰腺癌细胞的诱导凋亡作用

目的 观察全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)能否诱导人胰腺癌细胞的凋亡.方法 分别将人胰腺癌细胞SW1990、PaTu8988、BxPC3和ATRA共同孵育后,用MTT法检测细胞活性,分别用流式细胞仪检测、TUNEL和透射电镜观察细胞的凋亡.结果 MTT法显示,ATRA对3株人胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988和BxPC3的生长均有明显的抑制作用(P ＜ 0.05).流式细胞仪的检测、TUNEL和电镜的观察结果均证实ATRA诱导后,3株胰腺癌细胞株凋亡率均高于对照(P ＜ 0.01),并随诱导时间延长而增加.结论 ATRA在体外能显著抑制多株胰腺癌细胞株的生长,并促进其凋亡.     

《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2020年修订)》微小残留病疗效标准部分解读

《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2020年修订)》关于微小残留病(MRD)疗效标准部分仍参照2016年发表在《柳叶刀》上的国际骨髓瘤工作组(IMWG)多发性骨髓瘤(MM)疗效和MRD评估共识。大量研究证实MM治疗后的MRD转阴与患者的长期无进展生存(PFS)密切相关,而且越来越多的学者建议在临床试验中将MRD作为PFS的替代终点。因此,应用二代流式细胞仪、二代测序等方法检测MRD,对于MM患者预后预测、分层治疗等具有重要意义。由于新药治疗的出现以及各种检测方法自身存在的不足,MRD疗效评估尚存在一些问题,需要血液科医生高度关注。     

人肝癌多药耐药细胞株survivin蛋白的表达及意义

目的探讨人肝癌多药耐药细胞株survivin蛋白表达与肝癌细胞多药耐药的关系.方法用阿霉素(DOX)浓度梯度递增导法,建立人肝癌多药耐药细胞株(Bel-7402/DOX).用流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡率,同时用蛋白印迹(Western blot)检测其survivin蛋白表达.结果随着培养液中 DOX 浓度的增加Bel-7402/DOX 的凋亡率逐渐增加,survivin蛋白的表达逐渐增强.结论Survivin蛋白的表达变化可能与人肝癌细胞获得性耐药有关.     

Notch1活化对骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖及药物敏感性的影响

目的观察Notch1信号通路活化与多发性骨髓瘤(MM)发生、发展及耐药的关系,为MM治疗提供新靶点。方法利用携带Notch1-ICN逆转录病毒载体及Notch1-对照病毒(CON)载体感染RPMI8226细胞(分别为病毒组及病毒对照组),同时设未经感染的细胞为未转染组,采用Western blot法检测Notch1-ICN蛋白表达鉴定细胞;采用CCK-8法检测细胞增殖情况及对硼替佐米敏感性的影响;流式细胞术检测细胞周期。结果病毒组Notch1-ICN表达明显上调,约为病毒对照组和未转染组的2.5倍;培养后48、72、96 h病毒组细胞增殖率均显著高于病毒对照组(P均<0.01);随硼替佐米浓度增高,各组细胞抑制作用均逐渐增加,且同浓度条件下病毒组抑制率显著低于病毒对照组及未转染组(P<0.05或0.01);病毒组S期细胞比例明显高于其余两组(P均<0.01)。结论 Notch1信号通路活化与MM的发生、发展及耐药密切相关,有望成为MM治疗的新靶点。