PCR污染来源与对策

PCR污染来源众多，如采样、容器及运送过程、样本DNA模板制作和PCR试剂配制过程。实验室内环境等等，严重影响着实验的正确性。本文就PCR污染来源及其对策作扼要介绍。     

新型冠状病毒巢式PCR检测方法的建立与初步应用

目的:建立一种检测新型冠状病毒的巢式PCR方法,作为实时荧光PCR法检测新型冠状病毒的补充,并探讨该方法在临床样本检测中的初步应用价值。方法:根据新型冠状病毒基因保守序列,利用在线软件设计N、S基因引物,构建巢式PCR反应体系,N基因巢式PCR及产物测序用于定性检测,S基因PCR产物测序用于型别初步鉴定。检测梯度稀释新...     

阴道加德纳菌套式PCR检测及其临床应用

目的 建立阴道加德纳菌(Gv)灵敏、特异、快速检测方法，并探讨初步应用价值。方法 以Gv 16SrRNA～23SrRNA基因为靶基因，在Belkum等的Gv—PCR引物的外侧自行设计外套PCR引物和反应体系将Belkum等的Gv—PCR引物和和反应体系作为内套式PCR体系，由此构成Gv套式PCR检测体系。结果 34株Gv菌均能被Gv套式PCR正确检出，而生殖道可存在淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、白色念殊菌等微生物的典型株经Gv套式PCR扩增不出现任何条带。本套式PCR比Belkum等的PCR灵敏10～100倍。男性尿道炎者Gv检出率为15．8％、女性阴道炎为31．4％、女性膀胱炎者尿液为60．0％、男性不育症者精液为20．0％。结论 Gv套式PCR为检测Gv感染灵敏、特异、快速的分子检测方法．为Gv感染的临床诊断和分子流行病学研究提供了手段．     

在光纤芯片上进行高速个体化全基因组测序

新近发展的在光纤芯片上做高通量测序的技术，可以将人类全基因组序列的测定时间由目前所用的10年时间缩短到100d。光纤芯片上的基因组测序结合了磁珠、乳液PCR和焦磷酸测序法等技术，利用光纤优良的表面性质和有效的加工工艺，将光纤制作成一种基因芯片。在芯片上用磁珠来耦联DNA、RNA等微量反应物。乳液PCR可以获得大量的不同的基因组DNA片段。乳液PCR和光纤芯片都是由于有了磁珠作为微量反应物的载体，从而可以将反应一再小型化。而这些技术的结合，工作效率是目前常规的测序方法的100多倍。成功实现了基因组测序反应小型化、高通量化的思想，大大降低了成本，减少了完成全基因组测序的时间。     

荧光定量分型PCR、多重PCR和测序检测HBV基因型的方法学比较

目的 比较荧光定量分型PCR、直接测序和多重PCR三种HBV基因分型法,对本实验室建立的荧光定量分型PCR方法进行评价.方法 用多重PCR、直接测序和荧光定量分型PCR法检测113份HBV DNA阳性的临床样本.结果 荧光定量分型PCR和直接测序法检出率100%,多重PCR法检出率94.69%,6份样本未能分型.荧光定量分型PCR和多重PCR的Kappa系数0.915,荧光定量分型PCR和直接测序法的Kappa系数0.742,一致性均较好.对B/C基因型混合感染样本,荧光定量分型PCR法检出28例(24.78%),多重PCR法检出19例(16.81%),直接测序法检出13例(11.50%).结论 荧光定量分型PCR分型结果准确可靠,对基因型混合感染样本的检出率明显高于多重PCR及直接测序法,是一种高效、简便、快速、准确的HBV基因分型法,适用于大规模流行病学调查.     

三类整合酶基因(intⅠ)的简并引物PCR方法建立及应用

目的建立一种筛选第一、二和三类整合酶基因(intⅠ)的简并引物PCR方法，并对临床菌株进行整合子筛选和分类。方法用梯度PCR方法确定PCR反应的最适退火温度，并对16株临床标本进行PCR扩增，通过对阳性PCR扩增产物的限制性内切酶分析进行整合子分类。结果根据梯度PCR结果确定最适退火温度为46℃。应用简并引物PCR法检测16株临床分离株，其中8株阳性，经酶切分类后确定其中4株只含有第一类整合酶基因，有3株含有第二类整合酶基因，1株同时含有第一类和第二类整合酶基因。结论建立了一种同时筛选第一、二和三类整合子的方法，实际检测显示其可行性，为全面细致研究整合子介导的细菌耐药提供了一种快速、简便的方法。     

人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测

目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定量测定人 β 肌动蛋白 (hBA)的mRNA作为内对照。用梯度稀释的克隆的人 β 肌动蛋白基因制作标准曲线。结果 :标准曲线的相关系数为 1.0 0。实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为 7.1%。HepG2细胞hTERTmRNA与hBAmRNA的比值为 (1.3± 0 .3)× 10 -4。结论 :建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。本方法的建立将有助于研究端粒酶的生物功能     

一种较为简单的用竞争性内标准作定量PCR的方法及其准确性

目的　介绍一种较为简单的定量PCR方法 ,并检测该方法的准确性。方法　以PCR引入缺失突变的方法制作竞争性DNA内标准 ,使它略小于目的DNA扩增的片段。将竞争性内标准和标本放在一管中扩增 ,以两种PCR产物之比从标准曲线求得标本中目的DNA的含量。结果　同一标本不同加样量测定大鼠肺cDNA中内皮素 - 1(ET - 1)cDNA含量 ,结果之间的最大误差为 6 .3%。重复试验测定大鼠肺cDNA中胱硫醚γ裂解酶 (CSE)cDNA含量 ,批内误差为± 7.3% ,批间误差为± 3.1- 8.5 %。结论　本法的竞争性内标准容易制作 ,定量方法较为简单 ,误差不大 ,能符合大多数检测的要求。     

荧光定量PCR技术研究进展

基于荧光能量传递技术的荧光定量PCR技术可实时监测PCR反应 ,准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等 ,它的出现 ,极大地克服了原有PCR技术存在的不足如交叉污染等问题 ,并改善了PCR技术的应用如可广泛应用于临床观测患者病情发展及预后 ,判断药物疗效等。本文概述了目前几种荧光定量PCR技术即Taqman、Amplisensor、分子信标、Lightcycler及复合探针法的原理及特点。便于更好地理解及应用这项技术。     

应用改进的SSP-抑制PCR技术扩增cDNA片段旁侧序列

结合抑制PCR和单链特异引物PCR技术，降低RACE过程中由公用引物引发的非特异扩增、增加目的cDNA在原始模板中的相对比例，从而提高RACE特异性，有效地扩增靶序列。     

联合应用错配PCR和交替延伸PCR法提高抗TNFα抗体亲和力

目的：通过突变方法提高抗TNFα单链抗体pscTNF的亲和力。方法：以pscTNF质粒为模板，应用错配PCR构建突变抗体库，筛选亲和力得到改善的变种，再以所获变种为模板，用交替延伸PCR技术，再次构建突变库，筛选活性得到改良的克隆。以斑点ELISA方法及硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力的改善。结果：从错配PCR抗体库中筛选得到7个活性有所增强的变种，再通过交替延伸PCR使这7个变种的突变位点交换重组，获得了亲和力进一步提高的克隆。结论：联合应用错配PCR和交替延伸PCR法可提高单链抗体亲和力。     

MPN-PCR法快速定量检测海产品中致病性副溶血弧菌

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是在海洋环境及江湖河口广泛分布的一种条件性致病菌，是可引起人食物中毒的病原菌。患者以沿海地区居多，是食品检验的必检项目，常规检验多不能定量检测，常规PCR、多重PCR、荧光定量PCR等检测技术只对反应体系中模板DNA进行定量，无法鉴别污染食品中死活菌体。     

套式/多重PCR检测疟疾感染的应用研究

目的了解标签引物-套式/多重PCR技术在检测疟疾感染中的现场应用价值。方法随机采取我省疟疾流行区有发热症状的居民及家庭成员的耳垂血79份,同时制作厚血片和滤纸血样本各1份,用标签引物-套式/多重PCR检测所采集滤纸血样本中的疟原虫,并与镜检法进行比较。结果79份样本中,用标签引物-套式/多重PCR技术检出间日疟原虫阳性6例,镜检初检出10例间日疟原虫阳性,经复查血片后有4例排除了疟疾感染。镜检复核阳性的6例样本PCR均为阳性。以镜检复核为标准,两法阳性和阴性符合率为100%。结论标签引物-套式/多重PCR检测疟疾感染具高度敏感性和特异性,对疟疾鉴别诊断和明确诊断具有重要价值。     

免疫-PCR技术进展

免疫-PCR结合了抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏感性,是一种极为敏感的抗原检测技术,并适合于各种微量抗原的检测。免疫-PCR的关键在于形成抗体-标记DNA偶联物,作为桥梁连接免疫反应的特异性和PCR的高扩增能力。本文简述了免疫-PCR的基本流程以及抗体与标记DNA相偶联、PCR产物检测方法的进展。     

荧光定量 PCR与半定量PCR检测HBV DNA的对比分析

目的：对照分析荧光定量PCR与半定量PCR检测血清HBV DNA的载量，为临床基因检测实验室提供方法学选择依据。 方法： 取164份临床检测标本各用荧光定量PCR与半定量PCR检测，结果作统计学分析。 结果: 两种检测方法的灵敏度和特异度没有显著差异（χ2 =1.75，P>0.05）。 结论: 临床基因检测实验室可用半定量PCR法替代荧光定量 PCR法检测血清HBV DNA的载量。     

血清HBV二对半指标与PCR—DNA指标结果比较及临床意义

目的：探讨血清HBV二对半指标与DNA指标结果不一原因及临床价值。方法：PCR技术检测RIA有二对半阳性指标的血清、结果：抗HBs（＋）血清PCR检测的阳性率3．33％（2／60）。HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、抗HBc（＋）血清PCR阳性率98％（49／50）。HBsAg（＋）、抗HBe（＋）、抗HBc（＋）血清PCR阳性率24．14％（21／87）。HBsAg（＋）、抗HBc（＋）血清PCR阳性率66．67％（2／3）。单项抗HBc（＋）血清PCR阳性率10％（1／10）。阳性血清稀释，PCR可测到10（-6）浓度。结论：PCR结果能帮助血清二对半指标的解释，是了解HBV传染性的理想方法。     

石蜡包埋组织提取DNA不同条件下的PCR扩增

背景：在甲醛固定石蜡包埋组织的制作及保存过程中会对DNA造成损害,提取的DNA在用于PCR扩增时部分结果并不理想。 目的：比较分析石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应的影响因素。 方法：从10.0 μm×2、10.0 μm×4和10.0 μm×5石蜡包埋食管癌组织切片中提取DNA,以0.05,0.1,0.2 μg模板DNA量扩增内参基因β-actin,PCR反应循环次数分别为35,40,45次,分析影响PCR反应的因素。 结果与结论：琼脂糖凝胶电泳结果显示以10.0 μm×2组织切片量,PCR反应循环次数40次,PCR反应模板DNA量      0.05 μg扩增取得的目的基因DNA的质量最高。说明减少石蜡包埋组织用量和减少模板DNA量有助于获得高质量的PCR反应条带,且PCR反应循环次数应大于40次,小于45次,再增加循环次数,则意义不大。 关键词：石蜡包埋组织;提取DNA;PCR反应;循环次数;模板DNA doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.017     

江门成人散发急性腹泻者星状病毒的检测及毒株型别分析

目的研究江门地区成人腹泻者星状病毒感染情况及型别特点。方法收集江门地区病毒性腹泻流行期散发成人腹泻患者粪便标本，经胶体金法、RT-PCR法分别检测轮状病毒和诺如病毒后，运用实时荧光PCR进行星状病毒检测．并对阳性标本进行RT—nested PCR测序，鉴定型别。结果56份成人病毒性腹泻粪便标本中．荧光PCR法测出3份星状病毒株（5．4％），经RT—PCR测序1份，序列分析鉴定为HAtsV-4型。结论江门成人散发病毒性腹泻者存在星状病毒感染，型别为HAstV-4，未发现多致泻病毒混合感染。     

腺病毒重组质粒作为免疫PCR指示分子的研究

为探讨不同标记方式对制备免疫PCR指示分子的影响,首先制备了一个用于免疫PCR指示分子DNA片段的重组质粒（腺病毒六邻体基因片段）,用生物素-dUTP分别以不同的方式标记DNA:PCR产物标记、PCR直接标记、线性重级质粒标记和回收重组质粒插入片段的标记。结果表明,以线性重组质粒标记生物素制备的指示分子具有最佳的效果。     

PCR基因芯片上荧光PCR反应的研究

目的探讨能否在基因芯片上进行不同的荧光掺入PCR反应并根据基因芯片上荧光的变化判断基因的变异.方法利用健康外周血,正常脐血DNA,X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血(XLSA)家系成员6人外周血DNA做PCR-SSCP,并测序确定.设计检测此点突变的Taqman探针进行荧光PCR反应,在芯片上进行同样的反应,与上述反应结果进行对照.利用4步位点特异PCR结合SYBR荧光染料初筛HLAA2,并在芯片上进行同样的反应,与上述反应结果进行对照.结果PCR-SSCP分析与测序确定X连锁遗传性铁幼粒细胞贫血家系两患者的ALAS2基因第5外显子有G514A点突变,母亲、外祖母为杂合子携带者.设计Taqman探针时此家系中六位成员DNA与二份正常男性脐血DNA检测与预期结果相符.将上述结果中同样的样本移入芯片进行PCR反应,结果与常规荧光PCR反应的结果一致.SYBR荧光染料PCR反应与芯片上SYBR荧光染料PCR反应的结果与预期完全相符.结论利用TaqMan探针与SYBR Green荧光染料可以在PCR基因芯片上顺利进行PCR反应,根据基因芯片上荧光的变化检测出点突变与单核苷酸多态性.为基因芯片的临床应用打下了基础.