双水相萃取与疏水层析分离基因工程人溶菌酶

采用双水相萃取与疏水层析分离纯化重组巴氏毕赤酵母表达的基因工程人溶菌酶.通过正交实验方法研究了聚合物浓度、盐浓度和pH对双水相体系萃取人溶菌酶过程的影响.结果表明:当双水相萃取的pH为4,硫酸钠、氯化钠、PEG4000的质量浓度为0.13、0.06和0.08时,人溶菌酶上相回收率达98.8%,纯化因子18.0,浓缩因子3.6.双水相萃取后选用高效疏水层析色谱纯化人溶菌酶,经苯基高取代基介质疏水层析后得到纯化因子为22.7,收率为88.4%的人溶菌酶纯化产品,电泳纯度检测为100%.     

双水相萃取技术应用在医药工业中的展望

本文着重分析了双水相萃取适应和促进医药工业发展的技术特征以及在基因工程药物、酶工程药物、抗生素和天然植物药用有效成份分离和提取应用研究,指出双水相萃取技术的日臻成熟必将带来医药工业的更大进步。     

用双水相体系分离血红蛋白(HB)

利用聚乙二醇（PEG）／硫酸铵双水相系统分离纯化盐析得到了血红蛋白(HB)样品,考察了PEG相对分子质量、PEG质量分数、 （NH4)2SO4质量分数、pH、温度等因素对HB分离的影响。结果表明PEG双水相系统的最佳分离条件为：wPEG400=20％,w(NH4) 2SO4=20%,pH=7,温度为30 ℃。在此条件下HB分配系数可达到65,回收率可以达到89.5%,纯度达到80.5%。     

溶菌酶分离纯化综合性实验的开设

介绍溶菌酶分离纯化综合性实验开设的背景、课程改革的思路以及实施过程。通过开设综合性实验,对生物工程下游技术课程中分散的实验教学内容进行改革,极大地激发了学生的学习兴趣,对其他医药院校改革生物工程下游技术实验教学有一定的参考意义。     

人溶菌酶转基因小鼠乳汁的抑菌活性及稳定性研究

目的 研究表达人溶菌酶转基因小鼠乳汁的抑菌活性及稳定性.方法 取重组人溶菌酶(rhLYZ)表达的母鼠乳汁和人初乳,以平板扩散法检测乳样的抑菌谱.转基因小鼠乳汁的稳定性研究,系通过将乳样置于不同温度的水浴中加热,测定其溶菌活性;将稀释乳样调节到不同的pH值,或者加入不同种类的金属离子,分别测定酸碱度和金属离子对乳汁抑菌活性的影响.结果 人溶菌酶转基因小鼠乳汁对多种革兰阳性及阴性细菌具有不同程度的抑制作用,并具有很强的热稳定性、广泛的pH活性范围,金属离子对其活性的影响较小.结论 人溶菌酶转基因小鼠乳汁和人初乳有较相似的生物学活性,是动物乳"人乳化"的良好模型.     

巴氏毕赤酵母SMD1168表达人溶菌酶的发酵条件

研究用毕赤酵母SMD1168菌株(MutS,HIS4+)表达人溶菌酶(HLZ)的发酵条件。此菌株具有对胞外分泌的外源蛋白不降解、对反应器氧传递效率的限制不敏感的特性,有利于在常规反应器条件下的过程放大。在培养基中添加复合维生素,在流加甲醇溶液中添加山梨醇或甘露醇可维持细胞正常的生长和代谢,并表达高活性的HLZ。采用恒溶解氧的方式流加甘油溶液以提高细胞密度,在一段时间内使细胞处于碳源半饥饿状态后,使用恒速流加甲醇溶液诱导HLZ表达。HLZ的体积生成速率达到9.6mg/(L·h)左右,上清液中HLZ的含量约为1.6g/L,发酵周期为110h。     

双水相萃取的葛根黄酮搽剂对神经根型颈椎病大鼠的疗效

目的考察基于聚合物双水相萃取技术所得葛根黄酮搽剂对神经根型颈椎病大鼠的疗效。方法采用椎管插线法建立神经根型颈椎病大鼠模型,随机分为搽剂高、中、低剂量外用给药组、阳性对照组和模型组共5组,通过行为学和病理形态学考察药物的作用。结果造模后,大鼠术侧前肢弯曲,五趾紧缩,落地即抬起。给药10 d后,模型组大鼠症状无明显改变;葛根黄酮搽剂中、高剂量组和阳性对照组自发痛值、步态评分值降低,游泳时间增长,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05),受损神经根出现空泡样变、坏死灶和轴突扭曲症状减轻。结论葛根黄酮搽剂能有效减轻神经根型颈椎病大鼠的神经根性疼痛,改善受损神经根状态。     

回流辅助的双水相体系提取防己中粉防己碱

目的：改进粉防己碱的提取分离工艺,减少环境污染,降低生产成本。方法：采用乙醇/（NH4）2SO4双水相体系,辅以加热回流,提取并分离纯化防己粉末中粉防己碱,考察了乙醇质量分数、（NH4）2SO4体积分数、料液比、pH、回流时间和提取次数等因素对粉防己碱萃取率的影响,并建立高效液相色谱法测定萃取液中粉防己碱含量的分析方法。结果：在乙醇质量分数为20%、（NH4）2SO4体积分数为35%、料液比为1∶8、pH为9时,双水相萃取率为84.50%;回流提取1次、时间为2 h时,防己粗提物的得率为19.80 mg/g,纯度为20.30%。结论：本方法相比于传统提取分离方法如乙醇回流提取以及酸碱法等,操作简便、萃取率高、方法重复性好,所得粗提物纯度较高,可适用于提取粉防己碱。     

家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白的生物信息学分析

目的利用生物信息学方法分析家蝇天蚕素-人溶菌酶融合基因推导的氨基酸序列。方法用ProtParam Tool、CDD、ProtScal、sopma等软件对其理化性质、疏水性/亲水性、信号肽、功能结构域及蛋白质二级结构等重要参数进行预测。结果家蝇天蚕素-人溶菌酶由187个氨基酸组成,预测相对分子质量为20 131.7,理论等电点(pI)为9.69,分子式为C862H1375N277O260S11;半衰期预测结果显示其利于基因工程表达。融合蛋白的氨基酸序列含有天蚕素家族和溶菌酶家族二者的保守结构域,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成。结论分析结果为家蝇天蚕素-人溶菌酶融合基因的原核表达及表达产物的生物学功能研究奠定了基础。     

溶菌酶分离纯化方法的研究新进展

对近年来最新的溶菌酶分离纯化的方法，如包括膜色谱法、超滤法、反胶团萃取法、IMAC、亲和沉淀及扩张床吸附法等进行了总结。     

两水相系统萃取糖化酶的相平衡

含有聚乙二醇(PEG)和硫酸铵(NH_4)_2SO_4的两水相系统,能有效地用于从发酵液中提取糖化酶。研究表明:随着PEG平均分子量降低、成相组分浓度的适当增加以及加入较高浓度的无机盐,均能提高酶的分配系数。PEG浓度增大,(NH_4)_2SO_4浓度的减小有利于相比的增大。在同一条系线上,相比的确定应从提取收率和酶的浓缩两方面综合考虑。已发现,在含有26%PEG400-16%(NH_4)_2SO_4,pH4.4的系统中(相比1.2),糖化酶的分配系数为47,收率为96%。     

液膜法提取发酵液中的苯丙氨酸：Ⅲ.实际发酵液的萃取

采用乳化液膜分离法，对苯丙氨酸的实际发酵液进行了间歇式单级萃取，拟三级逆流萃取和连续微分逆流塔式萃取。考察了三种操作形式下液膜萃取效率及乳液稳定性，结果表明了液膜分离的可行性及塔式操作的潜在优势。     

含菌丝体林可霉素发酵液的预分散溶剂萃取

以醋酸丁酯为萃取溶剂，采用预分散溶剂萃取法从含菌丝发酵液中直接萃取林可霉素。实验结果表明：由于胶状液沫、胶状气沫和菌丝体的相互作用，被萃取液中适量菌丝体的存在有利于萃取和分层，分层效果好于不含菌丝体的林可霉素水溶液。当发酵液的菌丝体含量控制在15～150g／L时，分层效果较好，油相富集迅速，在实验条件下一次萃取率最高可达78．6％。     

Aqueous Two-phase Systems with Ultrasonic Extraction Used for Extracting Phenolic Compounds from Inonotus obliquus

Objective To optimize the extracting technology of assessing the maximum yield of phenolic compounds (PC) from Inonotus obliquus by single factor experiments and orthogonal array design methods through aqueous two-phase systems combined with ultrasonic extraction. Methods The range of the independent variables, namely levels of acetone and ammonium sulfate, and ultrasonic time were identified by a first set of single factor experiments. The actual values of the independent variables coded at four levels and three factors were selected based on the results of the single factor experiments. Subsequently, the levels of acetone and ammonium sulfate, and ultrasonic time were optimized using the orthogonal array method. Results The optimum conditions for the extraction of PC were found to use 7.0 mL acetone, 5.5 mg ammonium sulfate, with ultrasonic time for 5 min. Under these optimized conditions, the experimental maximum yield of PC was 37.8 mg/g, much higher than that of the traditional ultrasonic extraction (UE, 29.0 mg/g). And the PC obtained by this method had stronger anti-oxidative activities than those by traditional UE method. Conclusion These results indicate the suitability of the models developed and the success in optimizing the extraction conditions. This is an economical and efficient method for extracting polyphenols from I. obliquus.     

溶剂萃取法提取苹果酸

通过对萃取剂、稀释剂的筛选,确定了一个以三烷基氧化膦(TRPO)为萃取剂、提取苹果酸的萃取体系。采用双对数法、红外图谱和水分分析对萃合机理的研究表明,TRPO萃取苹果酸的可能萃合物结构式为MA.2TRPO.3H_2O。对萃取过程中的各影响因素进行了考察,从而得到了最佳操作条件,并提出了一条采用溶剂萃取法从水溶液中提取苹果酸的流程。     

基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵表达重组人血清白蛋白

在摇瓶条件下对基因工程菌Pichia pastoris的发酵条件进行了实验，并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在分批发酵时，接种量为10%且种子细胞光密度（OD600）为20左右时，细胞生长的延迟期约为2.11h，细胞生长光密度与培养时间的关系模型为：y=0.7841e^0.2319t（线性相关系数r=0.9936）；在补料发酵时细胞浓度可达115g/L-160g/L（干重），在120h重组人血清白蛋白表达量达3.6g/L。     

固定化青霉素酰化酶在光敏感可再生两水相体系中催化青霉素G为6-APA

在一种光敏感可再生高聚物(PNBC 300000)与葡聚糖20000(Dextran 20000)形成的两水相体系中进行固定化青霉素酰化酶的相转移催化青霉素G产生6-APA的反应。在这个两水相体系中,当pH为7.8,底物浓度为62 mmol/L,反应温度为20℃,在50 mmol/L KCl存在下,6-APA的分配系数可达8.4。催化动力学显示,达到平衡的时间近6 h,PG(Na)转化率约82.6%。3批半连续反应转化率为60%~70%,较相近条件下的单水相反应得率提高近20%。在两水相中,底物及产物主要分配在上相,固定化酶分配在下相,底物青霉素G进入下相经酶催化产生的6-APA及苯乙酸又转入上相,从而解除了青霉素酰化酶催化反应的底物及产物抑制作用,达到提高产物得率的效果。形成两水相的高聚物通过488 nm的激光照射可实现循环利用,高聚物的光照回收率在95%~98%。