转染ANT1基因诱导颈动脉球囊损伤大鼠血管平滑肌细胞凋亡

目的通过腺病毒载体在体转染大鼠颈总动脉球囊损伤模型,研究过表达腺嘌呤核苷酸转位酶-1(adeninenucleotide translocase 1,ANT1)对血管平滑肌细胞凋亡的影响。方法将72只雄性SD大鼠随机分为正常组、单纯损伤组、Ad-GFP转染组、Ad-ANT1转染组,每组18只。用携带ANT1的腺病毒载体(Ad-ANT1)或空载体腺病毒载体(Ad-GFP)局部感染大鼠颈总动脉球囊损伤动物模型,在损伤后7、14、28 d,取大鼠损伤侧颈动脉RT-PCR检测ANT1 mRNA表达,West-ern blot以及免疫组化检测BAX和Bcl-2表达,TUNEL法原位检测新生内膜及中膜VSMCs凋亡率。结果 Ad-ANT1腺病毒转染后大鼠颈动脉ANT1大量表达,在14 d达到高峰,显著高于Ad-GFP转染组及单纯球囊损伤组(P<0.01),至28 d时仍有表达。在7、14 d时,Ad-ANT1转染组BAX阳性表达率显著高于Ad-GFP转染组及单纯损伤组(P<0.05);Bcl-2阳性表达率高于正常血管,但与Ad-GFP转染组和单纯损伤组无显著差异(P>0.05);Ad-ANT1转染组新生内膜及中膜平滑肌细胞凋亡率显著高于其他各组(P<0.05);在14、28 d时,Ad-ANT1转染组新生内膜及中膜面积比(IA/MA)小于Ad-GFP转染组及单纯损伤组(P<0.05)。结论腺病毒载体介导过表达ANT1可诱导大鼠颈总动脉球囊损伤动物模型新生内膜及中膜VSMC的凋亡,其作用可能通过上调促凋亡蛋白BAX的表达实现。     

Adenine translocase 1gene transfection induces apoptosis of vascular smooth muscle cells in rats with carotid balloon injury

目的 通过腺病毒载体在体转染大鼠颈总动脉球囊损伤模型,研究过表达腺嘌呤核苷酸转位酶-1( adeninenucleotide translocase 1,ANT1)对血管平滑肌细胞凋亡的影响.方法 将72只雄性SD大鼠随机分为正常组、单纯损伤组、Ad-GFP转染组、Ad-ANT1转染组,每组18只.用携带ANT1的腺病毒载体(Ad-ANT1)或空载体腺病毒载体(Ad-GFP)局部感染大鼠颈总动脉球囊损伤动物模型,在损伤后7、14、28 d,取大鼠损伤侧颈动脉RT-PCR检测ANT1mRNA表达,West-ern blot以及免疫组化检测BAX和Bcl-2表达,TUNEL法原位检测新生内膜及中膜VSMCs凋亡率.结果 Ad-ANT1腺病毒转染后大鼠颈动脉ANT1大量表达,在14 d达到高峰,显著高于Ad-GFP转染组及单纯球囊损伤组(P＜0.01),至28 d时仍有表达.在7、14 d时,Ad-ANT1转染组BAX阳性表达率显著高于Ad-GFP转染组及单纯损伤组(P＜0.05);Bcl-2阳性表达率高于正常血管,但与Ad-GFP转染组和单纯损伤组无显著差异(P＞0.05);Ad-ANT1转染组新生内膜及中膜平滑肌细胞凋亡率显著高于其他各组(P＜0.05);在14、28 d时,Ad-ANT1转染组新生内膜及中膜面积比(IA/MA)小于Ad-GFP转染组及单纯损伤组(P＜0.05).结论 腺病毒载体介导过表达ANT1可诱导大鼠颈总动脉球囊损伤动物模型新生内膜及中膜VSMC的凋亡,其作用可能通过上调促凋亡蛋白BAX的表达实现.     

组织型金属蛋白酶抑制剂4对血管组织胶原代谢的影响

目的探讨组织型金属蛋白酶抑制剂4(tissue inh ib itors of m atrix m etalloprote inases-4,TIMP-4)对基质金属蛋白酶(MMP)活性的作用,观察其对血管组织胶原含量的影响。方法实验动物分3组,单纯损伤组,损伤后转染AdGFP组和损伤后转染AdGFP-4组。以复制缺陷型腺病毒为载体,将TIMP-4转移到培养的大鼠血管平滑肌细胞中,用凝胶电泳酶谱分析和反向酶谱分析法检测TIMP-4对MMP活性的影响;制备大鼠颈总动脉球囊损伤模型并转染TIMP-4基因,检测TIMP-4对血管组织MMP活性及对胶原含量的影响。结果转染AdTIMP-4可使培养的血管平滑肌细胞MMP-2的活性降低至对照组(未转基因组和转染AdGFP组)的26%。动物实验中血管损伤后转染AdTIMP-4组与单纯损伤组比较,其活化形式的MMP-2几乎完全被抑制;损伤后转染AdTIMP-4组与转染AdGFP组比较,血管新生内膜的面积和细胞均减少,细胞内膜天狼星红含量的吸光度(55 030±5899)明显低于转染AdGFP组(91 530±7729,P<0.05),并不促进血管组织胶原沉积(每个细胞的胶原含量135±11 vs 118±13,P>0.05)。结论TIMP-4通过改变MMP/TIMP的平衡调节血管组织胶原代谢,在血管损伤后修复过程中发挥重要作用。     

反义Smad3阻断TGF-β1信号转导对血管平滑肌细胞增殖能力的影响

目的 观察反义Smad3腺病毒载体转染增生型血管平滑肌细胞(VSMC)后对其增殖能力的影响.方法 构建大鼠颈总动脉急性球囊损伤模型.取损伤处血管组织,组织块贴壁法培养增生型VSMC,反义Smad3腺病毒载体转染(实验组).以空载病毒作为阴性对照组,以无病毒载体作为空白对照组.抽提转染后细胞总RNA,RT-PCR检测转染后各组Smad3 mRNA表达;MTT比色法检测转染后细胞增殖能力的变化.结果 与阴性对照组和空白对照组比较,转染后实验组Smad3 mRNA表达明显减少;转染后第2、3、5天,实验组细胞增殖能力明显降低(P<0.05),转染后第7天各组细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05).结论 反义Smad3腺病毒载体转染对增生型VSMC具有增殖抑制作用,为通过基因修饰阻断TGF-β1信号转导从而预防增生性血管病变奠定了基础.     

体内转染eNOS基因抑制损伤后动脉内膜新生的实验研究

目的 研究体内转染eNOS(内皮型一氧化氮合酶)基因对损伤后血管内膜新生的抑制作用.方法 2F球囊导管损伤大鼠颈总动脉内膜后,随机分成空白对照组、pcDNA3、1(-)组和pcDNA3.1-eNOS组,分别以PBS、脂质体Fugene 6介导pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1-eNOS体内转染至损伤后血管段,2周后对转染后血管平滑肌细胞行RT-PCR鉴定eNOS基因mRNA表达;转染1个月和2个月后对各组颈总动脉行免疫组化染色,计算机图像分析计算新生内膜面积(1)、新生内膜/中膜面积比值(I/M).结果 pcDNA3.1-eNOS体内转染组的颈总动脉血管平滑肌细胞有效表达eNOS基因mRNA.转染后1个月和2个月,eNOS基因体内转染组血管新生内膜面积、I/M比值均比PBS对照组、空载体pcDNA3.1(-)转染组显著减少(0.01).结论 eNOS基因体内转染损伤后动脉能有效抑制血管内膜新生,防止损伤后血管再狭窄.     

腺病毒介导的AT2R基因转染对培养大鼠颈动脉内膜增生的影响

目的构建AT2R重组腺病毒载体并研究AT2R对动脉损伤后新生内膜增生的影响.方法将AT2R基因克隆至腺病毒载体,构建AT2R重组腺病毒;球囊损伤大鼠颈动脉后立即取下颈动脉,用重组腺病毒转染,在体外培养2周后,观察AT2R基因转染对损伤动脉新生内膜形成的影响.结果构建的AT2R重组腺病毒经鉴定正确,其滴度为1×109pfu/ml;AT2R重组腺病毒转染可明显抑制培养大鼠颈动脉新生内膜增生.结论成功构建了AT2R重组腺病毒载体;AT2R可明显抑制大鼠颈动脉球囊损伤后的新生内膜增生.     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转移预防再狭窄的实验研究

目的 观察腺病毒介导的血管内皮生长因子(vEGF)基因转移对大鼠颈总动脉损伤后新生内膜增生的影响。方法 将颈总动脉球囊损伤的大鼠分为3组，用局部灌注法将50μl溶液注射至颈总动脉。20min后恢复血流。分别于14d和28d处死大鼠。观察vEGF基因转移对再内皮化及内膜增厚的影响。结果 与两对照组比较，动脉损伤后14d和28d时，VEGF基因转移加速血管再内皮化，减少内皮缺失区域(P＜0．05)；且显著抑制动脉损伤后新生内膜增厚(P＜0．01)。结论 重组腺病毒介导VEGF基因转移对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用。     

AT2R基因在体电穿孔转染抑制大鼠颈总动脉新生内膜增生

目的 探讨AngⅡ2型受体(AT2R)基因局部电穿孔转染对大鼠颈总动脉球囊损伤后新生内膜增生的影响.方法 建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型,用局部电穿孔方法转染AT2R真核表达载体 (pEGFP-AT2R)或空载体(pEGFP-N2),分别于术后7、14 d和21 d采用HE染色及RT-PCR方法进行AT2R、AngⅡ1型...     

实验家兔血管球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖和迁移及通心络对其影响

目的　探讨通心络对兔血管球囊损伤后血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖和迁移的影响及其可能机制。方法　新西兰大白兔 6 4只 ,普食饲养 ,随机分为假手术组、对照组和通心络组 ,并分别于术前以及术后即刻及第 1、2、4周留取各组受损动脉标本和手术前后血液标本 ,分别行病理、电镜、RT PCR检验及血清NO浓度测定。结果　 ( 1)术后对照组新生内膜明显增厚 ,内含大量增殖、迁移的VSMC ,VSMC呈典型的“合成型”表现 ,血管腔狭窄 ;通心络组以上改变较同期对照组显著减轻。 ( 2 )对照组新生内膜面积、内膜增生指数和增殖细胞核抗原 (PCNA)增殖指数均显著高于通心络组 (P <0 .0 1) ,但管腔面积和管腔狭窄指数均显著小于通心络组 ( P <0 .0 1)。 ( 3)对照组PCNA、基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )、MMP 3和血小板源性生长因子 BB(PDGF BB)的免疫组化及RT PCR表达均显著高于通心络组 ,而组织抑制因子 1(TIMP 1)的表达则相对低于通心络组。 ( 4 )术后对照组血清NO浓度显著低于通心络组 ( P<0 .0 5 )。结论　通心络能明显抑制球囊损伤后VSMC增殖和迁移 ,阻止内膜增生 ,防止血管狭窄等作用     

MPC30-DEA70载AMO-miR-146a对大鼠颈总动脉球囊损伤后血管内膜增生的影响

目的 阳离子磷酸胆碱聚合物(MPC30-DEA70)负载反义miR-146a寡核苷酸(AMO-miR-146a)转染大鼠颈总动脉球囊损伤处血管平滑肌细胞(VSMC),观察其对血管内膜增生的影响.方法 60只SD大鼠完全随机化分为未损伤组、单纯损伤组、多聚赖氨酸(PLL)组、AMO-miR-146a组、PLL载MPC30-DEA70/AMO-miR-146a复合物(P/M=3:1组和P/M=5:1组),每组10只.通过光学显微镜观察4周后大鼠颈总动脉组织形态学变化,q-PCR法检测miR-146a的表达以及应用Western blot法检测增殖细胞核抗原蛋白(PCNA)、NFκBp65的表达情况.结果 苏木精-伊红染色,光镜下显示,除未损伤组外,单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组、P/M=3:1组、P/M=5:1组大鼠颈总动脉血管新生内膜有不同程度的增生,而中膜面积无明显改变;与单纯损伤组比较,PLL组、AMO-miR-146a组新生内膜面积差异无统计学意义(P>0.05),P/M=3:1组和P/M=5:1组新生内膜面积明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),后两组组间比较差异无统计学意义(P>0.05);q-PCR及Western blot检测显示P/M=3:1组和P/M=5:1组miR-146a及目的蛋白PCNA、NFκBp56的表达较未损伤组高,差异有统计学意义(P<0.05),但明显低于单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组,差异有统计学意义(P<0.05),而P/M=3:1组和P/M=5:1组组间miR-146a、PCNA、NFκBp56的表达差异无统计学意义(P>0.05);单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组组间miR-146a、PCNA、NFκBp56的表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 MPC30-DEA70可与AMO-miR-146a络合,借助PLL进入VSMC,有效抑制球囊损伤后VSMC的miRNA-146a的表达,使PCNA、NFκBp56下调,抑制新生内膜增生,防止血管狭窄.     

Inhibitory effect of adenoviral vector-mediated AT2R gene transfection on neointimal hyperplasia

Objective： To investigate the effect of adenoviral vector-mediated AT2R gene transfection on neointimal hyperplasia after rat carotid artery balloon injury. Methods ：AT2R gene was transferred into rat carotid arteries by recombinant adenovirus pAd-AT2R after the establishment of rat carotid balloon injury restenosis model. The arteries were harvested on the 14th day after gene transfer. The efficiency of transgene delivery was measured by the expression of adenovirus-encoding green fluorescent protein （GFP） under fluorescent microscope. The expression of AT2R and PCNA （proliferating cell nuclear antigen） was evaluated by RT-PCR, immunocytochemistry, immunofluorescence staining, confocal microscopy, respectively. The ratio of intimal to medial area （I/M） was quantified with images and determined by an image analysis system. Results, GFP-positive area in adventitia, media and the forming neointima was about 40%. Adenoviral delivery of rat AT2R gene up-regulated AT2R expression in balloon-injured rat carotid and reduced PCNA expression and I/M significantly in neointima（P〈0.01）. Double immunofluorescence labeling of AT2R and PCNA also showed that AT2R gene transfer inhibited VSMCs proliferation in neointima. Conclusion： AT2R gene transfer may be a novel promising therapy to limit neointimal hyperplasia.     

Adenovirus-mediated gene transfer of TIMP-4 reduces neointimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery

Objective:To determine the effects of a recombinant replication-deficient adenovirus encoding human tissue inhibitor of metalloproteinase-4(Ad.TIMP-4) on vascular smooth muscle cell(VSMC) function in vitro and neointimal development in the injured rat carotid artery.Methods:Western blotting,gelatin zymography and reverse zymography were used to characterize the expression and functional activity of the TIMP-4 secreted by Ad.TIMP-4-infected VSMCs.The migration and proliferation of VSMCs in vitro were separat...     

野生型Rb基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的：探讨人野生型Rb基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法：通过逆转录病毒载体介导，将野生型Rb基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，21天后观察其对新生内膜形成的影响，并检测Rb蛋白表达水平。结果：成功地构建和包装了人野生型Rb基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中成功表达；免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型Rb蛋白，与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了49％。结论：人野生型Rb基因治疗时血管成形术后再狭窄有一定的预防作用。     

ROLE OF ENDOGENOUS CARBON MONOXIDE IN NEOINTIMAL FORMATION INDUCED BY BALLOON-INJURY IN RAT AORTA

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＰｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙｉｓｎｏｗａｗｅｌ－ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｎｄｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙｐｅｒｆｏｒｍｅｄｐｒｏｃｅｄｕｒｅｔｈａｔｉｓｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄｂｙｒｅｓｔｅｎｏ...     

脉冲电场介导AT2R基因在血管局部表达及其对血管新生内膜的影响

目的研究脉冲电场对血管紧张素2型受体(AT2R)基因在血管局部表达的作用,探讨AT2R基因在体转染对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的作用。方法大鼠颈动脉球囊损伤后,用脉冲电穿孔法介导AT2R cDNA真核表达质粒或空质粒载体在动脉局部表达,于术后3、7 d和21 d用免疫组织化学、HE染色等方法,进行AT2R在颈动脉壁中表达的变化及定量组织形态学分析。结果免疫组织化学染色结果显示:脉冲电场介导AT2R cDNA真核表达质粒表达后,3 d时可见内膜、中膜、外膜大量AT2R的棕色阳性着色,7 d时可见少量棕色阳性着色,21 d棕色阳性着色几乎消失,未转染组及空质粒转染组未见AT2R的棕色阳性着色,表明脉冲电穿孔能有效导入AT2R基因,并在动脉壁获得稳定表达。在21 d时,AT2R cDNA真核表达质粒组的内膜面积与中膜面积比显著低于未转染组和空质粒载体组[分别为(0.76±0.08)、(1.39±0.08)、(1.32±0.10),P<0.01],空质粒转染组和未转染组间无统计学差异(P>0.01)。结论脉冲电穿孔可介导AT2R基因在血管局部有效表达,AT2R在体转染可抑制球囊损伤后大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖和新生内膜增生。     

HSV-tk基因对实验性血管成形术后再狭窄的抑制作用

为探讨转染单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ ｔｋ）基因联合ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）治疗方案用于治疗冠状动脉成形术后再狭窄的可行性,构建了携带ＨＳＶ ｔｋ基因的复制缺陷型逆转录病毒,利用该病毒将ＨＳＶ ｔｋ基因转染至体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）和大鼠腹主动脉再狭窄模型的损伤动脉中,并均给予ＧＣＶ,分别观察上述处理对ＶＳＭＣ的增殖和新生内膜的形成是否有抑制作用。结果：该方案使培养的ＶＳＭＣ增殖受抑制,抑制程度对ＧＣＶ有剂量依赖关系;既往在恶性肿瘤中发现的旁观者效应,在培养的ＶＳＭＣ中也存在。同时,该方案使大鼠腹主动脉再狭窄模型的新生内膜面积减少。但单纯转染ＨＳＶ ｔｋ基因或单纯应用ＧＣＶ无论在体外还是在体内均无上述抑制作用。提示本基因治疗方案对人类冠脉成形术后再狭窄有治疗价值。     

野生型p53基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的探讨逆转录病毒载体介导的人野生型ｐ５３基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法构建野生型ｐ５３基因逆转录病毒载体，通过逆转录病毒载体介导，将野生型ｐ５３基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，２１ｄ后观察其对新生内膜形成的影响，并检测ｐ５３蛋白表达水平。结果构建和包装了人野生型ｐ５３基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中表达；用逆转录病毒载体转导野生型ｐ５３基因至大鼠球囊损伤的颈动脉，免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型ｐ５３蛋白，且与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了４４％。结论人野生型ｐ５３基因治疗对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用     

基质金属蛋白酶组织抑制因子-3基因转染血管平滑肌细胞移植对大鼠心肌梗死的治疗作用

目的 观察基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP-3)基因转染血管平滑肌细胞(VSMCs)移植,对大鼠心肌梗死(AMI)的治疗效果,并探讨其可能的机制.方法 取Wistar大鼠胸主动脉,采用组织块法培养VSMCs.左冠状动脉远端结扎方法复制AMI模型.随机分三组:冠状动脉结扎后3d向缺血心室壁内分别注射含有1×106个TIMP-3基因转染的VSMCs(TIMP-3组)、1×106个VSMCs(VSMC组)、不含细胞的DMEM液(DMEM组)各0.5mL.术后第4周,观察大鼠心脏功能变化,免疫组化染色检测TIMP-3和基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达,RT-PCR法检测缺血心肌组织中TIMP-3和MMP-2 mRNA含量.结果 TIMP-3基因成功转入VSMCs中.术后4周,TIMP-3组的LVIDd、LVIDs、EDV和ESV值较正常鼠升高(P＜0.05),但小于VSMC(P ＜0.01)组和DMEM组(P＜0.01).RT-PCR结果显示:各移植组TIMP-3 mRNA含量均较对照组显著升高(P＜0.01),TIMP-3组较VSMC组、DMEM组明显增高(P＜0.01);TIMP-3组MMP-2 mRNA含量较VSMC组、DMEM组明显降低(P＜0.01).结论 将TIMP-3基因转染的VSMCs移植入心肌缺血区可明显抑制MMP-2的表达,进而抑制AMI后早期心肌重塑,改善心功能.