人p27kip1可调控性重组腺病毒载体的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的:体外构建人p27kip1可调控性重组腺病毒载体,并观察其在前列腺癌细胞系PC-3细胞中的表达及其对细胞生长的影响.方法:采用Ad-X Tet-Off表达系统,将人全长p27kip1 cDNA经过穿梭载体,与可调控性腺病毒载体骨架连接,得到重组人p27kip1基因腺病毒(Ad-p27kip1),在HEK293细胞包装、扩增,获得高滴度病毒,采用空斑试验测定病毒滴度,体外转染PC-3细胞,RT-PCR、Western 杂交分别检测目的基因不同水平的表达,并通过MTT法观察转染前后细胞增殖力的变化.Ad-X-TRE-β gal病毒作为对照.结果:构建的Ad-p27kip1病毒滴度为1.2×109 pfu/ml,RT-PCR、Western 杂交检测有特异的高表达,转染后对细胞的生长有抑制作用.结论:体外连接法成功地构建携带人p27kip1基因的可调控性重组腺病毒载体,在人前列腺癌细胞系PC-3中有高表达并对细胞生长有抑制作用.     

大鼠促红细胞生成素重组腺病毒载体的构建及其在大鼠SGNs中的表达

目的构建大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)重组腺病毒载体,并转染于体外培养的大鼠螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)。方法全基因合成大鼠EPO基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-EPO。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PacⅠ酶切线性化后电转化感受态细胞,获得重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO,经PacⅠ酶切后转染至293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。并转染至体外培养的螺旋神经元,免疫荧光检测及蛋白水平检测螺旋神经元中EPO表达。结果经KpnⅠ、HindⅢ酶切与测序鉴定显示,腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO构建成功,重组腺病毒AdEPO在293细胞中成功包装,扩增后病毒滴度为1.17×1011U/ml;经RT-PCR和Western blot检测EPO在293细胞中成功表达。重组腺病毒载体AdEPO经鉴定均构建正确;免疫荧光及Western blot检测转染腺病毒后螺旋神经元中EPO表达显著增强。结论成功构建了EPO重组腺病毒载体,并成功转染螺旋神经元,可显著增强螺旋神经元中EPO表达水平。     

腺病毒介导的p27mt基因转染对肝癌细胞及裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的:研究携带突变型p27的重组腺病毒(Ad-p27mt)基因转染对肝癌的体内、外抑制作用,并探讨其抑癌机制。方法:⑴将Ad-p27mt转染人肝癌细胞SMMC-7721,Western blotting检测P27、Bcl-2、Bax的表达;流式细胞仪(FCM)观察Ad-p27mt对肝癌细胞生长抑制作用。⑵Ad-p27mt直接注射入人肝癌裸鼠移植瘤中,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率。结果:Ad-p27mt转染肝癌细胞后,细胞增殖明显受抑制,G0/G1期细胞比例增加,P27表达增强,Bax/Bcl-2比例增高,采用Ad-p27mt基因治疗肝癌裸鼠移植瘤生长受抑制,肿瘤生长抑制率达57.09%。结论:Ad-p27mt基因转染对肝癌具有较显著的体内、外抑制作用和诱导凋亡作用,其机制是通过增强P27表达,使细胞产生周期阻滞,诱导凋亡的机理可能是上调Bax/Bcl-2比例所引起。     

腺病毒介导血管平滑肌细胞转染表达p27基因的研究

目的体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)并以腺病毒介导转染表达p27。方法取大鼠主动脉血管,以常规组织块贴壁法培养VSMC。用位置特异性重组方法构建带p27基因的复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-p27),经鉴定、扩增,以获取高滴度AdCMV-p27转染液,体外转染VSMC。用RT-PCR方法检测p27 mRNA表达,免疫细胞化学法检测p27蛋白表达,流式细胞仪检测p27细胞表达率。结果构建的AdCMV-p27体外转染培养VSMC表达率为85.81%。以免疫细胞化学、流式细胞仪和RT-PCR检测p27表明,转染后p27表达明显增强,并随表达时间延长而增加,24h达峰值。结论腺病毒载体可较高效率介导p27在体外培养的VSMC转染表达。转染表达p27的VSMC可作为研究有丝分裂原对其增殖、迁移以及凋亡等生物学行为影响的良好细胞模型。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.     

针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用

目的:构建针对乙型肝炎病毒x基因(HBx基因)的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体,并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-HBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western Blot方法证实,在HepG2细胞中,HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低.结论:腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.     

共表达野生型p53及siRNA-mdm2质粒的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的：构建可同时表达野生型p53 (wt-p53)及siRNA-mdm2的重组真核表达载体用于激素非依赖性前列腺癌的联合基因治疗。方法：利用亚克隆、T-A克隆和PCR技术合成并构建pcDNA3.1-p53、siRNA-mdm2、p53/siRNA-mdm2和siRNA-scramble重组质粒。脂质体法将上述重组质粒转染至PC-3细胞,半定量RT-PCR和Western blotting检测共表达质粒对mdm2和p53表达的影响,MTT法检测共表达质粒转染后PC-3细胞增殖活性。结果：克隆出wt-p53全长及带有U6启动子的siRNA-mdm2序列,经DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建上述真核重组表达载体;转染细胞48 h后可见siRNA-mdm2组GFP明显表达; RT-PCR和Western blotting检测显示转染共表达质粒后PC-3细胞中 wt-p53表达增强,mdm2表达下调;MTT检测显示共表达质粒转染后PC-3细胞生长抑制率为40.4%。结论：成功构建p53与siRNA-mdm2共表达质粒,共表达质粒可抑制前列腺癌细胞PC-3的增殖。     

p38丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用

目的构建p38丝裂原激活蛋白激酶基因(MAPK)重组慢病毒载体并建立表达外源性p38基因的人前列腺癌稳定细胞株。方法采用限制性内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接等方法,将EGFP/p38融合基因插入慢病毒载体pTYF-EF1α-IRES-EGFP中,构建启动子EF1α调控的EGFP/p38共表达慢病毒载体pTYF-EF1α-EGFP/p38,经酶切鉴定后,利用慢病毒三质粒系统,通过脂质体法转染包装细胞HEK 293T细胞,收集病毒上清后转导人前列腺癌DU145细胞株,经有限稀释法筛选重组EGFP/p38稳定细胞株,用Western blotting检测细胞总p38的表达,用计数法绘制细胞的生长曲线。结果经酶切鉴定,成功构建EGFP/p38重组慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为4.7×106 TU/ml,利用此病毒悬液感染DU145细胞,成功筛选到EGFP/p38稳定表达细胞株,Western blotting显示该细胞株能稳定表达外源性EGFP/p38融合蛋白,这种过表达p38的细胞株的生长速度明显低于对照组。结论成功构建p38 MAPK重组慢病毒载体并建立了表达外源性p38 MAPK基因的稳定细胞株EGFP/p38-DU145,细胞内p38过表达能够抑制DU145细胞的增殖。     

构建人三叶因子3腺病毒载体对胆管上皮细胞迁移的调控作用

目的 构建含有人三叶因子3(trefoil factor family 3,TFF3)基因的腺病毒载体,并观察其对胆管上皮细胞迁移的调控作用.方法 利用PCR技术对目的基因TFF3全长进行扩增,测序后亚克隆至腺病毒穿梭质粒构建载体pAdTrack-CMV-TFF3,转化至含腺病毒骨架质粒pAd-Easy的大肠杆菌株BJ5183感受态细胞中进行同源重组,筛选重组子并经内切酶Pac Ⅰ线性化,转染293细胞进行病毒包装及扩增,并进行滴度测定.构建的TFF3腺病毒载体感染人胆管上皮细胞后用RT-PCR及Western blot检测目的基因表达水平,并进行划痕实验观察细胞迁移能力的变化.结果 成功扩增了大小约为458 bp的人TFF3基因,测序报告显示目的基因序列与NCBI报道一致;成功构建了TFF3的同源重组腺病毒穿梭载体,经293细胞包装及扩增的病毒滴度为1.3 × 109 CPU/mL.RT-PCR及Western blot结果显示转染人胆管上皮细胞后其TFF3表达明显增强,细胞迁移能力也明显高于对照组.结论 成功构建含TFF3基因的腺病毒载体,为进一步研究TFF3在胆管上皮损伤修复中的作用奠定了基础.     

TAP1基因慢病毒载体的构建

目的:构建TAP1基因慢病毒过表达载体及检测其过表达效率,为制备前列腺癌的免疫细胞疫苗提供基础。方法:将pDONR223-TAP1质粒和pLenti6.3-IRES-EGFP构建形成pLenti6.3-TAP1-IRES-EGFP表达质粒,采用慢病毒包装试剂盒包装产生慢病毒;感染293T细胞后RT-PCR检测目的基因TAP1的表达;采用荧光FACS计算病毒活性滴度。RT-PCR检测转染PC-3细胞后TAP1表达。结果:PCR和测序证实pLenti6.3-TAP1-IRES-EGFP慢病毒质粒构建成功;包装纯化后收集的病毒液滴度经流式细胞仪检测滴度为2.87×107 TU/ml;转染后的PC-3后,TAP1转染组TAP1的表达量显著高于对照组。结论:成功构建人TAP1基因慢病毒过表达载体,可以上调PC-3细胞TAP1的表达。     

人突变p27重组腺病毒的构建及其在结肠癌细胞SW480中的表达

目的 :为了探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及突变 p2 7的抗肿瘤特性 ,构建复制缺陷型重组hp2 7mt基因腺病毒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,经 2次亚克隆 ,插入到穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,形成转移质粒 pShuttle -CMV -hp2 7mt;然后再用PmeI线性化的 pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含腺病毒骨架质粒 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183,使其在细菌内发生同源重组。重组质粒鉴定正确后经PacⅠ酶切 ,转入Ad2 93细胞 ,包装成重组腺病毒Ad -hp2 7mt。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定 ,用紫外分光光度计进行滴度测定。用重组 p2 7mt的腺病毒Ad - p2 7mt感染大肠癌细胞SW 4 80 ,WesternBlot检测p2 7蛋白的表达。结果 :用含pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183后 ,可获得约 30 %的阳性重组质粒。PCR检测表明重组腺病毒DNA中含有目的基因。重组腺病毒滴度为 7.95× 10 15pfu/L。转染大肠癌细胞后 ,p2 7在SW4 80中获得了高表达 ,而未转染细胞和Ad -LacZ转染的细胞中仅有低表达。结论 :腺病毒作为一种基因转移载体 ,可有效介导 p2 7在肿瘤细胞中的表达 ,在肿瘤基因治疗方面具有很大的应用前景。     

整合素连接激酶基因敲降和黑色素瘤分化相关基因过表达慢病毒载体构建和鉴定

目的：建立整合素相关激酶(ILK)基因敲降和黑色素瘤分化相关基因(mda7)过表达慢病毒包装表达系统。方法：针对人ILK基因序列,设计基因敲降靶点序列(A、B、C),通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接,将ILK插入慢病毒载体pSicoR-eGFP,构建siILK-pSicoR-eGFP重组质粒;根据人mda7基因序列,设计引物扩增mda7全长,并插入慢病毒载体pLVX-Puro,构建mda7-pLVX-Puro重组质粒。经双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染人胚肾细胞系293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度、观察感染效率。各组病毒载体转染PC-3细胞后,用定量PCR和蛋白质印迹法检测ILK基因和mda7 mRNA转录水平及蛋白表达水平。通过MTT法和Transwell实验考察ILK和mda7对PC-3细胞增殖和迁移的影响。结果：成功构建ILK基因敲降及mda7过表达的慢病毒载体,四质粒系统共转染293T细胞后可见大量绿色荧光染色阳性细胞。浓缩病毒后293T细胞的感染效率在90%以上,并能高效率感染PC-3前列腺癌细胞。ILK-A-pSicoR-eGFP和ILK-B-pSicoR-eGFP组ILK干扰效果最佳（P<0.05）,mda7的表达水平远高于对照组（P<0.05）,且持续稳定表达至少1个月。ILK和mda7对PC-3细胞的增殖在96 h内有明显抑制作用,并对其迁移亦有显著抑制（均P<0.05）。结论：成功构建并鉴定人ILK 基因敲降和mda7过表达慢病毒载体,可为探讨ILK和mda7基因在肿瘤细胞中的生物学功能提供良好工具,也为探索安全、高效的肿瘤治疗途径奠定实验基础。     

腺病毒介导的p27kip1基因转移对食管癌细胞及裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的 :研究p2 7kip1基因转移对食管癌的体内、外抑制作用 ,并探讨其抑癌机制。方法 :①构建携带人p2 7kip1cDNA的重组腺病毒 (Ad p2 7kip1) ;②将Ad p2 7kip1转染人食管癌细胞Eca970 6 ,MTT法、3 H TdR和3 H Leucine掺入试验检测对细胞增殖的影响 ,流式细胞仪 (FCM)、DNA片段分析检测对细胞周期和凋亡的影响 ,TRAPPCR -ELISA法检测端粒酶活性 ,免疫细胞化学法及Westernblotting法检测p2 7kip1和Survivin的表达 ;③Ad p2 7kip1直接注射入人食管癌裸鼠移植瘤中 ,观测抑瘤效应 ,并检测p2 7kip1和Survivin的表达。结果 :①Ad p2 7kip1转染食管癌细胞后 ,细胞增殖明显受抑制 ,G0 /G1期细胞比例增加 ,并出现明显的亚二倍体凋亡峰和特征性的凋亡梯状条带 ,细胞端粒酶活性降低 ,p2 7kip1表达增强 ,Survivin表达降低 ;②采用p2 7kip1基因治疗 ,食管癌裸鼠移植瘤生长明显受抑制 ,肿瘤生长抑制率达 6 4 .1% ,移植瘤中p2 7kip1表达增强 ,Survivin表达降低。结论 :p2 7kip1基因转移对食管癌具有较显著的体内、外抑制作用 ,其机制是增强p2 7kip1表达、抑制Survivin表达 ,使细胞产生G1期阻滞 ,抑制端粒酶活性 ,并诱导凋亡 ,表明该基因疗法是食管癌治疗的新途径。     

含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链基因表达载体的构建

目的：构建含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链(DTA)基因的重组表达载体。方法：利用PCR技术从人乳癌细胞MCF-7中扩增出DF3／MUC1启动子的转录调控序列并克隆入pMD18T载体中,再从pMD18T-DF3重组质粒中切下DF3／MUC1启动子的转录调控序列并亚克隆入pGL3-Basic载体,构建重组质粒pGL3-DF3。从质粒pIBI30-DTA中切下DTA片断,以DTA基因替换重组质粒pG13-DF3中的虫荧光素酶基因,构建重组质粒pGL3-DF3-DTA。结果：构建了含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和DTA的表达载体,酶切和测序结果与预期完全相符。结论：重组质粒pGL3-DF3-DTA构建成功。     

人SMOC1重组腺病毒载体的构建及其在主动脉瓣间质细胞中的表达

目的:利用AdEasyTM vector system构建携带人SMOC1基因的重组腺病毒表达载体,感染人主动脉瓣间质细胞(hAVICs)并检测外源性SMOC1在细胞中的表达和对细胞增殖的影响?方法:用PCR的方法扩增SMOC1 cDNA,将其克隆到pGEM-T Easy载体中并测序鉴定?经NotⅠ和XhoⅠ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-CMV-SMOC1?将经PmeⅠ线性化的pShuttle-CMV穿梭载体与pAdEasyTM DNA电穿孔共转化BJ5183重组细菌,获取重组腺病毒质粒pAdEasy-SMOC1,再将经PacⅠ线性化的重组病毒骨架质粒转染HEK293A包装细胞,包装并扩增重组腺病毒(Ad-SMOC1)?用Ad-SMOC1感染hAVICs,以Western blot法和免疫荧光染色法检测重组SMOC1在hAVICs中的表达与定位,用MTS法检测SMOC1对主动脉瓣间质细胞增殖的影响?结果:成功构建并包装表达SMOC1蛋白的重组腺病毒,该重组腺病毒在体外能有效感染hAVICs并高表达SMOC1蛋白,且其介导表达的SMOC1蛋白主要定位于hAVICs的胞浆和胞膜上,MTS分析表明重组SMOC1能够显著促进主动脉瓣间质细胞的增殖? 结论:成功地构建了携带人SMOC1基因的重组腺病毒,并证实SMOC1具有促进增殖的作用?本研究为进一步研究SMOC1在瓣膜间质细胞中的作用奠定了实验基础?     

过表达DLL3促进人胃癌细胞的增殖

目的构建人全长DLL3的真核表达质粒,并分析上调和下调DLL3对人胃癌细胞增殖的影响。方法采用PCR扩增人全 长DLL3 基因并克隆至真核表达载体pCMV-Tag4中,通过酶切及测序鉴定后,瞬时转染HEK293T细胞,并以转染pCMV-Tag4 质粒和无转染HEK293T细胞分别为阴性对照和空白对照,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot鉴定人全长DLL3基因 的表达;进一步通过qRT-PCR和Western blot检测人DLL3在人正常口腔上皮细胞GES-1和AGS等3株胃癌细胞中的表达差异; 当人DLL3/pCMV-Tag4 瞬时转染3 株胃癌细胞后,利用MTT检测DLL3 过表达后胃癌细胞的增殖;同时,特异性人DLL3 siRNA 转染人胃癌细胞MGC803 和MKN45,利用MTT检测DLL3 下调后胃癌细胞的增殖。结果成功构建了人全长DLL3/ pCMV-Tag4重组质粒,转染HEK293T细胞24 h后,qRT-PCR和Western blot表明DLL3在mRNA和蛋白水平上的表达显著高于对 照组;MTT细胞增殖实验显示：过表达DLL3促进胃癌细胞的增殖,下调DLL3后抑制胃癌细胞的增殖。结论成功构建了人全长 DLL3/pCMV-Tag4 真核表达质粒并在HEK293T细胞中获得表达,过表达DLL3促进胃癌细胞的增殖,下调DLL3抑制胃癌细胞的 增殖,本研究为以DLL3为新靶点对胃癌进行靶向治疗提供新思路。     

外源性p16基因与放疗联合治疗喉鳞癌的实验研究

目的　探讨外源性 p16基因对人喉鳞状细胞癌的抑制作用及与放射治疗联合应用的协同增敏作用。方法　应用携带 p16基因的复制缺陷型腺病毒 (Ad- p16 )转染人喉鳞癌细胞株 ,用 Western Blot方法检测 p16基因在喉鳞癌细胞中的表达 ,体外、体内实验观察 p16基因治疗和放射治疗对喉癌细胞的生长抑制作用。结果　复制缺陷型腺病毒载体可有效地将外源性 p16基因转染入人喉鳞癌细胞株中并使其表达 P16蛋白 ;体外、体内抑瘤实验表明 :Ad- p16基因治疗组、单纯放疗组和 Ad- p16基因与放疗联合治疗组肿瘤生长均明显受抑制 ,疗效显著优于携带 L ac Z基因的重组腺病毒 (Ad- L ac Z)组和 PBS对照组 (P<0 .0 5 ) ,其中联合治疗组肿瘤生长最为缓慢 ,与 Ad- p16基因治疗组和单纯放疗组比较均有显著性差异 (P<0 .0 5 )。结论　 p16基因可有效地抑制人喉鳞癌细胞生长 ,与放射治疗联合应用具有相加和协同效应     

野生型p53,GM-CSF和B7-1基因转移对卵巢癌细胞系SKOV-3增生的影响

目的研究人野生型p53、GM-CSF和协同刺激因子B7-1基因共转染对卵巢癌细胞增生的影响。方法以携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体转染卵巢癌细胞系SKOV-3,荧光显微镜观察,流式细胞计数计算转染效率;以携带野生型p53、GM-CSF和B7-1基因的腺病毒转染SKOV-3细胞,RT-PCR检测目的基因表达,观察转染前后细胞形态的变化,绘制细胞生长曲线。结果当腺病毒的感染强度达到400 pfu/细胞时,转染率可达到81%;以携带目的基因的腺病毒转染SKOV-3细胞,能检测到相应基因表达;转染后SKOV-3细胞形态发生改变,增生减缓。结论腺病毒载体能介导目的基因转入卵巢癌细胞,并有效表达;人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因共转染能减缓卵巢癌细胞的增生。     

人同源盒基因NKX3.1cDNA真核表达载体的构建及表达

目的：构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC 3、LNCaP中的表达情况。方法：以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,T/A克隆至pCR2.1载体中。经酶切、测序鉴定后,将NKX3.1cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中。将pcDNA3.1 NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP 细胞,RT PCR和Western blot法检测NKX3.1cDNA在转录水平和蛋白水平的表达。结果：人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1经酶切及测序鉴定正确。 pcDNA3.1 NKX3.1转染PC 3和LNCaP细胞后,经RT PCR和Western blot证明在mRNA和蛋白水平均能有效表达NKX3.1。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP后能有效表达。     

野生型p53基因转染前列腺癌细胞系PC-3m对细胞凋亡的不同影响

目的：观察野生型p53基因转染对前列腺癌细胞PC-3m增殖和凋亡的影响。方法：用脂质体Lipofectamine将真核表达载体pCMV—p53和pCMV—p53mt135分别转染PC-3m细胞，MTT法检测转染前后细胞生长情况，转染48h后采用流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率。结果：pCMV—p53转染后的PC-3m细胞生长明显受到抑制，FCM显示，转染48h后，细胞凋亡率为15％。结论：野生型p53基因瞬间转染PC-3m细胞可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。