正常人表皮 真皮结合珠蛋白mRNA表达研究

目的　检测正常人表皮及真皮内结合珠蛋白mRNA的表达。方法　采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法。结果　在 12例正常人表皮及真皮总RNART PCR产物中均扩增出结合珠蛋白片段。结论　在正常人表皮及真皮内均有结合珠蛋白mRNA的表达。     

地塞米松及甲氨蝶呤上调HaCaT细胞结合珠蛋白的表达

目的:探讨地塞米松及甲氨蝶呤对人角质形成细胞系HaCaT细胞合成结合珠蛋白(Hp)的影响。方法:采用RT-PCR方法检测Hp mRNA表达水平,ELISA方法检测Hp浓度。结果:地塞米松或甲氨蝶呤刺激HaCaT24h后,HaCaT细胞表达Hp增加;但较短刺激时间或较低刺激浓度时,HaCaT细胞表达Hp水平无明显变化。结论:地塞米松及甲氨蝶呤能够上调HaCaT细胞Hp的合成,这种作用具有时间依赖性及剂量依赖性的趋势。     

紫外线对HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达的影响

目的 观察紫外线照射对人角质形成细胞系HaCaT细胞表达结合珠蛋白的影响。方法 用逆转录-聚合酶链反应法检测长波紫外线UVA、中波紫外线UVB照射后HaCaT细胞各时相结合珠蛋白mRNA表达水平。结果 UVA12J/cm²照射后HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达明显升高。照射后20min结合珠蛋白mRNA表达已开始升高,6h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后2h、4h、6h、24h、48h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)UVB30mJ/cm²照射HaCaT细胞后结合珠蛋白mRNA表达也出现时相变化:4h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后20min、2h、4h、6h、12h、48h、72h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 紫外线UVA、311nmUVB上调HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达,随照射时间,结合珠蛋白mRNA表达呈时相变化。     

阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7及血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。 方法 将10-5、10-6、10-7、10-8 mol/L的阿维A分别作用于HaCaT细胞24、48、72 h后,采用CCK8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测阿维A对HaCaT细胞凋亡率的影响;Western印迹和RT-PCR法检测阿维A对HaCaT细胞IGFBP7、VEGF蛋白及其mRNA表达的影响。 结果 10-8 mol/L阿维A处理HaCaT细胞48 h时表现出对细胞增殖的抑制作用,随着时间延长和药物浓度升高,抗增殖作用亦增强,当药物浓度增加到10-5 mol/L时,48 h和72 h的抑制率分别为39.94% ± 2.27%和49.77% ± 1.87%。与对照组相比,10-5 mol/L阿维A作用48 h后,凋亡率由1.803% ± 0.313%（对照组）上升至7.617% ± 0.767%（阿维A组）（P ＜ 0.05）,IGFBP7的表达由0.436 ± 0.013上升至0.939 ± 0.040（P ＜ 0.05）,IGFBP7 mRNA的表达由0.190 ± 0.056上升至0.872 ± 0.079（P ＜ 0.05）,VEGF的表达由0.798 ± 0.036下降至0.213 ± 0.032（P ＜ 0.05）,VEGF mRNA的表达由0.933 ± 0.054下降至0.274 ± 0.041（P ＜ 0.05）。 结论 阿维A可促进HaCaT细胞的体外凋亡,并可在蛋白及mRNA水平上调IGFBP7及下调VEGF的表达。     

黑素瘤细胞及表皮黑素细胞中酪氨酸激酶c-abl,c-kit和PDGFRα/β的表达

目的观察酪氨酸激酶在多株黑素瘤细胞系及原代表皮黑素细胞中的表达,探讨酪氨酸激酶在黑素瘤发生发展过程中的作用。方法分离并培养人原代表皮黑素细胞,培养浅表垂直生长期黑素瘤细胞株WM793B,转移性黑素瘤细胞株A2058,WM-266-4,Hs294T,SK-MEL-5和SK-MEL-1,用RT-PCR法分别检测7株细胞中酪氨酸激酶c-abl,c-kit和PDGFRα/βmRNA的表达;Western-blot法检测7组细胞中非受体性酪氨酸激酶c-abl蛋白水平的表达。结果与表皮黑素细胞和WM793B细胞相比,5株转移性黑素瘤细胞中的c-ablmRNA及其蛋白水平的表达偏高;而PDGFRα/βmRNA表达明显偏低、c-kitmR-NA在表皮黑素细胞,A2058,WM-266-4和Hs294T中mRNA表达较高,而在WM793B,SK-MEL-5和SK-MEL-1中偏弱。结论酪氨酸激酶c-abl对黑素瘤的发生发展可能有促进作用,而PDGFRα/βmRNA的低表达可能与黑素瘤的转移有关。     

GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达

目的:明确GJB6目的基因蛋白Cx30在GJB6 3种突变体A88V、G11R和V37E在HaCaT细胞中的表达.方法:构建GJB6基因突变体的慢病毒载体,并转染至HaCaT,应用荧光倒置显微镜检测其表达.结果:突变体中G11R和A88V经过多次转染实验,能够明确观察到HaCaT细胞细胞膜上有Cx30蛋白的荧光表达;而V37E突变型荧光表达极弱或无.结论:3种突变体的Cx30表达量不同,初步推测突变体编码的蛋白质或不能定位于角质形成细胞膜或不能形成功能性的Cx30,从而影响了HaCaT细胞正常的增殖和分化.     

结合珠蛋白在银屑病皮损及皮损周边外观正常皮肤中的表达

目的 从mRNA及蛋白质水平研究结合珠蛋白在银屑病皮损及皮损周边外观正常皮肤中的表达,探讨其与朗格汉斯细胞的关系及在银屑病发病中的作用.方法采用免疫组化、免疫荧光双标记和原位杂交技术检测银屑病皮损及皮损周边外观正常皮肤中结合珠蛋白的表达.结果与正常人皮肤相比,银屑病皮损处角质形成细胞中结合珠蛋白mRNA的表达均明显增强(P＜0.001);皮损周边外观正常皮肤中的表达与正常人皮肤差异无显著性(P＞0.05).免疫组化显示:皮损处部分角质形成细胞胞浆中有结合珠蛋白表达;皮损及皮损周边外观正常皮肤中均可见结合珠蛋白在部分朗格汉斯细胞中呈阳性表达,且两者中结合珠蛋白阳性朗格汉斯细胞与朗格汉斯细胞总计数的比值较正常皮肤显著增高(P＜0.001).结论银屑病皮损处角质形成细胞中结合珠蛋白mRNA的表达增强,并能合成结合珠蛋白.合成结合珠蛋白的角质形成细胞可能在银屑病发病机理中起负反馈调节作用。     

PTEN和Survivin在基底细胞癌中的表达

目的:探讨抑癌蛋白PTEN和凋亡抑制因子Survivin在基底细胞癌(BCC)中的表达及其意义。方法:采用免疫组化SP法检测20例BCC和30例正常人皮肤中PTEN、Survivin的表达和分布。结果:20例BCC标本中,PTEN表达下调(P<0.05),Survivin表达增高(P<0.001)。PTEN和Survivin的表达无相关性。结论:PTEN异常低表达和Survivin异常高表达可能与BCC的发生、发展有关。     

PTEN和Survivin在鳞状细胞癌中的表达

目的探讨抑癌蛋白PTEN和凋亡抑制因子Survivin在皮肤鳞状细胞癌中的表达及其意义。方法采用免疫组化SP法检测40例皮肤鳞状细胞癌和30例正常人皮肤中PTEN、Survivin的表达和分布。结果40例鳞状细胞癌标本中,PTEN表达下调(P<0.001),分化越差下调越明显(P<0.001)。Survivin表达增高(P<0.001)。PTEN和Survivin的表达呈显著负相关(P<0.001)。结论PTEN异常低表达和Survivin异常高表达可能与鳞状细胞癌的发病有关,PTEN表达异常的程度可能对判断预后有一定意义。     

桥粒芯糖蛋白1、3在HaCaT细胞、A431细胞及原代角质形成细胞中的表达

【摘要】 目的 测定不同类型角质形成细胞（KC）桥粒芯糖蛋白（DSG）1、DSG3及DSG1 mRNA、DSG3 mRNA表达。 方法 不同KC（HaCaT细胞、A431细胞及原代KC）培养后,直接免疫荧光观察细胞DSG1、DSG3的表达,定量聚合酶链反应（qPCR）测定DSG1 mRNA、DSG3 mRNA相对表达水平。 结果 DSG1与DSG3表达于三种角质形成细胞,荧光强度显示,A431细胞高于HaCaT细胞,HaCaT细胞高于原代KC。三种细胞均表达DSG1、DSG3 mRNA,原代KC DSG1与DSG3 mRNA的相对表达量分别为HaCaT细胞的291.7%及237.4%,差异有统计学意义（P < 0.01）;A431细胞DSG1 mRNA为HaCaT细胞的0.1%、DSG3 mRNA则为HaCaT细胞的18.8%,差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 三种KC均可用于对DSG1、DSG3的相关研究;相对而言,正常培养的A431细胞表面DSG1、DSG3表达较HaCaT细胞及原代KC高;原代KC DSG1、DSG3 mRNA水平较HaCaT细胞及A431细胞高。     

结合珠蛋白在正常人皮肤中的定位表达

目的 探讨正常人皮肤中结合珠蛋白及其mRNA的表达在皮肤中的作用及其与朗格汉斯细胞的关系。方法 采用过氧化物酶法及荧光双标记法和原位杂交技术检测30例正常人皮肤中结合珠蛋白的表达。结果 角质形成细胞、毛囊上皮、皮脂腺导管上皮细胞、腺上皮及小汗腺细胞结合珠蛋白mRNA呈弱阳性至中度阳性表达,真皮成纤维细胞和血管内皮细胞中均未见阳性表达,而在蛋白质水平,只见到一些树突细胞呈阳性表达,免疫荧光双标记检测证实为朗格汉斯细胞。结论 皮肤是结合珠蛋白肝外表达的又一器官,角质形成细胞等上皮来源的细胞是结合珠蛋白mRNA表达的主要细胞;正常皮肤中只见到表皮中下部、毛囊、皮脂腺导管部位的朗格汉斯细胞胞浆中含有结合珠蛋白;角质形成细胞中结合珠蛋白mRNA的表达可能与朗格汉斯细胞胞浆中的结合珠蛋白有关;结合珠蛋白可能参与皮肤中的一些免疫反应过程。     

咪喹莫特对人表皮朗格汉斯细胞及HaCaT细胞分泌细胞因子的影响

目的 研究咪喹莫特对人表皮朗格汉斯细胞(LC)及HaCaT细胞细胞因子分泌水平的影响。方法 联用密度梯度离心和免疫磁珠的方法分离纯化LC,以5μg/mL咪喹莫特刺激LC及HaCaT细胞,4h后取培养上清,用ELISA方法检测肿瘤坏死因子α、白介素1β及白介素6的含量。结果 LC咪喹莫特处理的实验组培养上清中肿瘤坏死因子α、白介素1β及白介素6含量均较未处理对照组明显增高(P均<0.05)。HaCaT细胞3种细胞因子分泌量在实验组与对照组中差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 咪喹莫特能增加LC细胞因子肿瘤坏死因子α、白介素1β及白介素6的分泌,但对HaCaT细胞上述3种细胞因子的分泌未见明显影响。     

血管内皮生长因子受体家族在HaCaT细胞中的表达

目的 探讨血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族在角质形成细胞系HaCaT细胞的表达。方法 RT-PCR法检测HaCaT细胞中VEGFR家族中VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3及neuropilin (NRP)-1、NRP-2的mRNA表达,蛋白免疫印迹法检测VEGFR家族蛋白质的表达,同时免疫荧光法定位VEGFR家族在HaCaT细胞中的表达情况。结果 RT-PCR发现VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3及NRP-1、NRP-2 mRNA在HaCaT细胞中均有表达;蛋白免疫印迹发现VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3蛋白质相对分子质量均为180 000,NRP-1、NRP-2为140 000。HaCaT细胞膜及细胞质内检测到较强的VEGFR家族荧光信号,以细胞膜表达为强。结论 在mRNA及蛋白质水平,HaCaT细胞均表达VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3及NRP-1、NRP-2。     

硒代蛋氨酸对中波紫外线致HaCaT细胞氧化损伤的保护作用

目的 研究硒代蛋氨酸对中波紫外线（UVB）致HaCaT细胞氧化损伤的影响及其可能机制。方法 培养HaCaT细胞,分为4组：①正常对照组,不做任何处理;②硒代蛋氨酸组：分别加入1、10、50、100、200 nmol/L和1 μmol/L 硒代蛋氨酸预孵育24 h;③UVB组：30、60、90 mJ/cm2 UVB照射;④硒代蛋氨酸 + UVB组：不同浓度硒代蛋氨酸预孵育24 h后进行不同剂量UVB照射。采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,比色法检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）水平。采用析因设计方差分析、单因素方差分析对数据进行统计学分析,多重比较采用LSD法。 结果 析因设计方差分析结果显示,UVB照射对细胞增殖活性有抑制作用（F = 128.04,P < 0.05）,且随UVB强度增加,细胞增殖活性逐渐下降,组间差异有统计学意义（P < 0.05）;硒代蛋氨酸预孵育对细胞增殖活性也有影响（F = 5.95,P < 0.05）,其中10 nmol/L ~ 1 μmol/L硒代蛋氨酸 + UVB组与UVB组比较,细胞增殖活性显著升高（P < 0.05）;UVB照射和硒代蛋氨酸对细胞增殖活性无明显交互作用（F = 1.65,P > 0.05）。30 mJ/cm2 UVB 照射后,UVB组凋亡率（31.9% ± 2.67%）较正常对照组（4.1% ± 0.67%）显著升高（P < 0.05）;而10、50、100、200 nmol/L和1 μmol/L硒代蛋氨酸 + 30 mJ/cm2 UVB组凋亡率［依次为：（21.9 ± 3.72）%、（17.2 ± 1.67）%、（4.6 ± 0.85）%、（7.5 ± 1.86）%、（13.5 ± 1.95）%］均较30 mJ/cm2 UVB组凋亡率显著下降（P < 0.05）。30 mJ/cm2 UVB组与正常对照组相比,SOD和GSH-Px活性降低,MDA含量升高（P < 0.05）;10 nmol/L ~ 1 μmol/L硒代蛋氨酸 + 30 mJ/cm2 UVB组与30 mJ/cm2 UVB组比较,SOD和GSH-Px活性增高,MDA含量下降（P < 0.05）。 结论 硒代蛋氨酸可以减轻UVB诱导HaCaT细胞氧化损伤,其机制与增强抗氧化酶活性、减少氧自由基有关。     

Effect of Spa Spring Water on Cytokine Expression in Human Keratinocyte HaCaT Cells and on Differentiation of CD4+ T Cells

Background

Skin acts as the first line of defense against any foreign materials outside of our body. In inflammatory skin disease, the pathogenesis is due to an immune reaction in the keratinocytes, immune cells and soluble mediators. Balneotherapy is widely used for the treatment of inflammatory skin disease, but the mechanisms are only partly understood by immune regulation. Balneotherapy in dermatologic disease can affect the secretion of pro-inflammatory cytokines, IL-1α and tumor necrosis factor from keratinocytes, and possibly affect the T cell differentiation.

Objective

In this study, we evaluated the effect of spa spring water from Yong-gung oncheon on the cells, and investigated the skin immune reaction.

Methods

We investigated the immunomodulatory or anti-inflammatory effect of thermal spring water on the expression of pro-inflammatory cytokines in the HaCaT cells under Toll-like receptor (TLR) stimulation, as well as the effect on the differentiation of CD4⁺ T cells under spring water.

Results

The treatment of spa spring water from Yong-gung oncheon decreased the expression of proinflammatory cytokines under TLR stimulation to the HaCaT cells and antigen presenting cells. In addition, spa spring water attenuated the differentiation process of subsets of CD4⁺ T cells, i.e., Th1, Th2 and Th17 cells. All these immune parameters can be used to evaluate the efficacy of spa spring water in Korea, in terms of the immune modulatory effect.

Conclusion

Spa spring water treatment suppressed the inflammatory cytokines production and also modulated the differentiation of CD4⁺ T cells into Th1, Th2, and Th17 cells, but not the T_regs cells.     

依曲替酸对HaCaT细胞维生素D受体表达的影响

目的探索依曲替酸治疗银屑病的机制。方法免疫组化法检测银屑病皮损和正常表皮维生素D受体(VDR)蛋白表达;Western印迹法半定量检测依曲替酸对HaCaT细胞VDR蛋白表达的影响。结果银屑病皮损VDR蛋白表达水平(33.41±2.22)明显高于正常皮肤(14.87±3.18),差异有统计学意义(P<0.01);不同浓度依曲替酸作用HaCaT细胞24h,48h和72h后细胞VDR蛋白表达均较阴性对照组降低,呈明显的时间和剂量依赖性。结论银屑病皮损VDR蛋白表达异常,依曲替酸可降低HaCaT细胞VDR蛋白表达。     

银屑病患者真皮间充质干细胞对HaCaT细胞的作用

目的 研究分析不同浓度银屑病患者真皮间充质干细胞（Dennis mesenchymal stem cells,DMSCs）对人永生化角质形成细胞（HaCaT）的作用.方法 取银屑病患者和正常人的真皮,获得纯度高的DMSCs,将HaCaT在Transwell小室下室接种,同时按照第5代DMSCs与HaCaT细胞之间的比例（1：1、5：1、10：1）将DMSCs分3组接种在Transwell上室,并设正常对照组和自然增殖组,采用实时细胞分析系统（RTCA）对HaCaT细胞进行增殖检测,培养74 h后用细胞计数法检测HaCaT细胞的数量.结果 共培养组较自然增殖组HaCaT细胞计数减少,与健康对照组相比,银屑病患者组HaCaT细胞计数减少不明显,以银屑病患者DMSC与HaCaT细胞按照1：1共培养组为著.结论 ①DMSCs对HaCaT细胞增殖有抑制作用.②与正常对照组、自然增殖组和其他比例组相比银屑病患者DMSCs与HaCaT 1：1共培养组对HaCaT细胞增殖抑制作用减弱更显著.     

紫外线对HaCaT细胞中瞬时受体电位锚蛋白1的影响

目的 探讨HaCaT细胞中瞬时受体电位锚蛋白1(TRPA1)的光控作用及其机制.方法 培养的HaCaT细胞分为225 mJ/cm2 UVA刺激组和25 mJ/cm2UVB刺激组,UVA刺激组分为空白对照组(仅有HaCaT细胞)、视黄醛组、UVA组、视黄醛+UVA组(UVA-TRPA1对照组)、视黄醛+UVA+肉桂醛组(UVA-TRPA1激动组)、视黄醛+UVA+樟脑组(UVA-TRPA1抑制组);UVB刺激组分为空白对照组(仅有HaCaT细胞)、视黄醛组、UVB组、视黄醛+UVB组(UVB-TRPA1对照组)、视黄醛+ UVB+肉桂醛组(UVB-TRPA1激动组)、视黄醛+UVB+樟脑组(UVB-TRPA1抑制组).qPCR、Western印迹检测HaCaT细胞中TRPA1的表达.流式细胞仪检测各组HaCaT细胞钙离子内流的变化.结果 qPCR和Western印迹显示,HaCaT细胞中有TRPA1 mRNA及蛋白的表达.UVA作用后空白对照组、视黄醛组、UVA组、视黄醛+UVA组荧光强度分别为155.06±7.62、148.37±18.77、166.92±3.71、331.333±40.563,组间差异有统计学意义(F=44.509,P＜0.01).UVB作用后空白对照组、视黄醛组、UVB组、视黄醛+UVB组荧光强度分别为150.20±1.73、171.66±56.23、147.56±6.60、250.44±9.13,组间差异有统计学意义(F=85.261,P＜ 0.01),视黄醛+UVA/UVB组荧光强度均高于空白对照组(q值分别为18.442、6.052,P＜0.01).TRPA1激动剂和拮抗剂可调节UVA、UVB所引起的钙离子内流的变化(P＜ 0.001),在UVA、UVB作用下,TRPA1激动剂组荧光强度均高于对照组(q值分别为14.934、32.770,P＜0.001),TRPA1抑制剂组荧光强度均低于对照组(q值分别为7.986、14.596,P＜0.001).结论 TRPA1在皮肤HaCaT细胞中有表达,UVA或UVB可通过TRPA1调控HaCaT细胞的钙离子内流.