丙型肝炎病毒基因分型研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)基因型众多,其命名和分型标准已渐趋统一,一般采用Simmonds命名系统。不同基因型的分布地理差异明显,我国以1b、2a型最常见,南北差异可能不大。现有的HCV基因分型法有多种,PCR和血清学两类方法各有其局限性,相应也出现多种改进及新方法,主要是针对PCR法的改进。近几年新兴的DNA芯片技术也开始应用于HCV基因分型,很可能提供一种更敏感、快速、高效的HCV基因分型法。     

基因芯片在丙型肝炎病毒分型检测中的评价

为研究HCV基因分型芯片检测丙型肝炎患者的基因型,以测序法进行对比,并探讨了IFN治疗慢性丙肝疗效与基因型的关系。采用基因芯片的方法对20例慢性丙型肝炎患者进行分型,并通过测序验证。结果基因芯片和测序结果完全一致。20例丙肝患者中18例为1b,2例为2a,并且IFN治疗效果2a较1b型为优。HCV分型芯片检测HCV分型,特异性强、灵敏度高、结果准确,支持HCVRNA基因型在评价IFN疗效中十分重要的观点。     

丙型肝炎病毒血清学分型与基因分型研究

为了解某农村单采浆供血员人群所感染丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的血清型和基因型构成，并对两种分型方法进行比较，本工作以ＨＣＶＣ区型特异性多肽对抗－ＨＣＶ进行血清学分型，对已确定血清型的血清进行５′非编码区（ＮＣＲ）逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）和限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析以确定基因型，并对６份扩增产物进行序列测定。结果显示１４０份抗－ＨＣＶ阳性血清中，血清Ⅰ型和Ⅱ型分别为４４份（３１．４３％）和１２份（８．５７％），余８４份未能分型。４４株已知血清型的ＨＣＶ中，１ｂ、２ａ和３ｂ等３种基因型分别为３４株（７７．２７％）、９株（２０．４５％）和１株（２．２７％）。两种分型方法一致率为９３．１８％（４１／４４）。对６株ＨＣＶ５′ＮＣＲ的序列分析证实了ＲＦＬＰ分型的正确性。结论认为该人群ＨＣＶ感染以血清Ⅰ型或基因１ｂ型为主；Ｃ区型特异性多肽血清学分型法与ＲＦＬＰ基因分型法符合率高，具有一定应用价值。     

丙型肝炎病毒基因分型研究状况

当前HCV基因分型研究十分活跃,但由于在基因分型的方法、命名等方面尚不统一所以各国学者报道的分型结果很不一致。本文对近来HCV基因分型的现状,存在的问题及开展HCV基因型研究的意义进行了综述。     

丙型肝炎病毒基因分型及其与疾病程度,感染途径和…

为探讨广州地区丙型肝炎病毒感染的基因型及其与疾病程度，感染途径和干扰素疗效的关系，作者应用分型ＰＣＲ技术对１５６例抗－ＨＣＶ阳性患者血清ＨＣＶ ＲＮＡ进行分型检测，并分析不同程度肝病及不同感染途径ＨＣＶ基因型分布，且对５１例经干扰素治疗的慢性丙肝作分型评价。结果１２４例ＨＣＶ ＲＮＡ阳性中Ⅱ型占９０．３％，Ⅲ型占８．１％，Ⅱ／Ⅲ型混合感染占１．６％，未检出Ⅰ，Ⅳ型，说明广州地区ＨＣＶ感染以Ⅱ型为主     

澳门地区丙型肝炎病毒基因型分析

应用逆转录－ＤＮＡ聚合酶链反应及ＤＮＡ序列分析，对采自澳门地区４３例抗－丙型肝炎病毒抗体阳性的慢性肝火患者及５５例血液透析患者血清进行了ＨＣＶ ＲＮＡ检测及基因型分析。     

检测丙型肝炎病毒实验研究

目的探讨丙型肝炎患者血清丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）结果与丙型肝炎病毒核糖核酸（HCV—RNA）定量的相关性。方法采用酶联免疫吸咐实验（ELISA）和实时荧光定量PCR（FQ—PCR）技术,对621例同时做抗-HCV和HCV—RNA的丙型肝炎患者检测。结果621份标本中有115份HCV—RNA含量高于1000拷贝／ml,124份抗-HCV阳性。经统计分析,两者有明显的相关性。结论血清抗-HCV与血清HCV—RNA之间有较好的一致性;抗-HCV检测和HCV—RNA检测均有一定的局限性,同时检测抗-HCV和HCV-RNA可提高丙型肝炎患者的检出率．为其诊断和治疗提供帮助。     

丙型肝炎病毒特异性细胞免疫研究进展

本文综述了近几年丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）特异性细胞免疫研究进展，重点介绍了ＣＤ８＋细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）介导的细胞免疫在抗ＨＣＶ感染中的作用及来自病毒方面的并分析了小鼠在这一研究领域的价值。     

新疆维吾尔族人群丙型肝炎病毒基因分型分布分析

目的 了解新疆维吾尔族人群感染的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）的基因型别,为采取相应的临床治疗措施提供科学依据.方法 从医院收集维吾尔族丙型肝炎（丙肝）患者的血清样本基本信息,通过反转录巢式PCR法扩增HCV NS5b区并进行序列测定,与HCV标准株比较分析、绘制系统发生树、确定其基因型并进行比较分析.结果 39份丙型肝炎患者的样本中,HCVRNA阳性者为20份,基因型的分布状况为：1型17例,占85.0％,2型2例,只占10.0％,3型1例,占5.0％;亚型分析发现lb亚型14例（70.0％）,la亚型3例（15.0％）,2a亚型2例（10.0％）,还发现1例3a亚型（5.0％）.结论 新疆地区维吾尔族人群中流行的HCV基因型构成较为复杂,1b亚型为主要型别.     

丙型肝炎病毒分型方法的研究进展

本文综述了丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）分型方法的研究进展。     

山西省乙型肝炎病毒基因型别的初步研究

目的 初步确定流行于山西地区的乙肝病毒的基因型的基本情况。方法 采集山西地区乙型肝炎表面抗原阳性的血清，利用PCR扩增得到HBV的S基因和C基因；用MEGA3软件对其进行核苷酸序列分析，构建系统发生树，分析基因型。结果 约93％样本的HBVS基因和C基因序列均位于HBV系统发生树的基因型C，近7％的样本其S基因和C基因序列位于系统发生树的基因型B。结论 流行于山西地区的乙肝病毒多数为基因型C，少数为基因型B，未发现基因重组现象。     

河南省漯河地区乙型肝炎病毒基因型别的初步研究

目的 初步确定流行于河南漯河地区的乙肝病毒的基因型的基本情况.方法 采集河南漯河地区乙型肝炎表面抗原阳性的血清,利用PCR扩增得到HBV的S基因;用DANSTAR软件对其进行核苷酸序列分析,构建系统发生树,分析基因型.结果约75.7%样本的HBV S基因序列位于HBV系统发生树的基因型C,约20%的样本其S基因位于系统发生树的基因型B,近4.3%的样本其S基因位于系统发生树的基因型D.结论 流行于河南漯河地区的乙肝病毒多数为基因型C,少数为基因型B,极少数为基因型D.     

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达

目的 从感染ＨＣＶ的中国患者血清中扩增编码ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶的ｃＤＮＡ,在大肠杆菌中进行表达。方法 从血清中提取ＨＣＶ ＲＮＡ,应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶ｃＤＮＡ,Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终引法测定其序列,与ｐＢＶ２２０载体构建重组粒,在大肠杆菌中表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ分析重组蛋白。结果 用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到了ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶基因,序列分析表明其读码框架     

丙肝病毒(HCV)及乙肝病毒(HBV)双表达载体的构建及表达

目的 :为探索HCV/HBV高效联合基因免疫策略 ,构建具有 2套独立表达单元的HCV/HBV真核表达载体。方法 :分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于具有 2套独立表达单元的真核表达载体pRSC的巨细胞病毒启动子和RSV启动子下游 ,称为pRSC HBV/HCV ,转染SP2 / 0细胞 ,通过免疫荧光和Western印迹法观测蛋白的表达 ,免疫Balb/c小鼠 ,用酶联免疫小鼠体液免疫应答。结果 :pRSC HBV/HCV转染SP2 / 0细胞可见HBcAg及HCV核蛋白染色阳性荧光细胞 ,SDS Page电泳显示在 14kD及 2 1kD处均可见蛋白条带 ,与HBcAg及HCV核蛋白的的理论预期值一致 ,Western印迹分析显示在 14kD及 2 1kD处可见特异性的蛋白条带。 5只免疫鼠中全部出现抗 HCV及抗 HBV抗体 ,而对照组全阴性。结论 :pRSC HBV/HCV可分别表达HBcAg及HCV核蛋白 ,免疫Balb/c小鼠后可诱导其体液免疫应答 ,为进一步开展HCV/HBV联合基因免疫奠定了实验基础。     

Elevation of plasma soluble human leukocyte antigen-G in patients with chronic hepatitis C virus infection

The subversion of immune responses that hepatitis C virus (HCV) uses to escape immune surveillance and to establish persistent infection has been poorly understood. The immune-suppressive molecule human leukocyte antigen-G (HLA-G) has been supposed to play important roles in viral infection. In the current study, HCV genotype was analyzed in 67 chronic HCV-infected (CHC) patients. Plasma soluble sHLA-G (including sHLA-G1 and HLA-G5), interleukin-10 (IL-10), and interferon-γ (IFN-γ) levels were determined in these CHC patients and in healthy subjects by enzyme-linked immunosorbent assay, and the sHLA-G isoforms present in plasma were determined by Western blot. Data showed that HCV 1b was the predominant genotype, with a prevalence of 64.2%. sHLA-G was dramatically increased in CHC patients (median: 85.54 U/ml, range: 19.40-204.07) over that in normal controls (median: 9.13 U/ml, range: 5.07-69.56) (p < 0.001). Western blotting revealed that plasma sHLA-G was derived from sHLA-G1 and HLA-G5. IL-10 and IFN-γ levels were also significant higher in CHC patients than in normal controls (median: 16.3 pg/ml vs 1.8 pg/ml, p < 0.001, and 1025.3 pg/ml vs 858.3 pg/ml, p = 0.03, respectively). No significant association was observed for the HCV genotype and viral RNA load with the levels of sHLA-G, IL-10, and IFN-γ in CHC patients. These results indicate that elevation of sHLA-G expression in HCV patients was independent of viral genotype and viral RNA load. Given its immunotolerant property, an increase in sHLA-G may play a role in the persistency of HCV infection.     

丙型肝炎病毒包膜区变异与感染慢性化关系的初步研究

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)包膜区变异与其感染慢性化的关系。方法 3份HCV慢性感染者和3份急性感染者血标本，采用逆转录—聚合两链反应(RT—PCR)扩增HCV的E1区C端及E2区N端片段(573bp)，扩增产物进行克隆，以单链构象多态性(SSCP)和异质性双体(HD)分析对每份血清30个克隆的E1／E2区准种(quasispecies)进行筛选，挑选每份标本HCV的优势株与劣势株序列进行测定，分析非同义替换碱基数与同义替换碱基数比率(dN／dS，间接反映选择压力)和推导的氨基酸序列。结果 HCV慢性感染者病毒准种的复杂性和E2区dN／dS明显高于急性感染者。HCV慢性感染者的E2区氨基酸替换率(8．46％)比急性感染者(1．02％)更高，而两者的E1区氨基酸替换率(分别为2．74％和1．09％)均较低。尽管HVR1变异程度更高，但仍存在高度保守的氨基酸位点。结论 HCV持续性感染与准种复杂性增高和宿主对HVR1的免疫选择有关。     

核酶在细胞外切割HCV核心区RNA的研究

目的 研究核酶在细胞外切割HCV的作用。方法 设计核酶cDNA序列，构建核酶重组质粒及HCV核心区基因cDNA重组质粒。分别进行体外转录，并加入γ-^32P ATP以标记HCV RNA。将核酶RNA、HCV核心区RNA、RNA酶抑制剂及反应缓冲液混事浊国育，以核酶RNA切割HCV RNA。通过变性聚 烯酰胺凝胶电泳及放射自显影来分析结果。结果 β－半乳糖苷酶表型筛选均可见蓝色及白色菌落生长；核酶重组质粒直接测序结果见预期要苷酸序列；HCV重组质粒限制笥酶切分析见410bp条带。核酶切割反应显示：反应时间为15和30min时可见453、307、146nt3条带。反应时间为60min时仅见307及146nt2条带。结论 核酶重组质粒构建成功，所设计核酶对HCV有切割作用。     

HCV核心基因插入突变体编码蛋白对人肝癌细胞系(Huh-7)细胞基因表达的影响

目的用基因表达分析法鉴定丙型肝炎病毒(HCV)核心(Core，C)区基因插入突变体编码蛋白在人肝癌细胞系(Huh-7)表达，探讨该蛋白生物学功能及其基因表达改变与致病的关系。方法构建HCV-1bc基因插入突变体编码蛋白重组表达质粒，建立表达c基因插入突变体编码蛋白Huh-7细胞系，按Affymetrix公司实验程序制备探针、再与该公司H0u133A和Hg-u133b芯片杂交。对基因表达上调或下调≥3倍的基因，用NetAflk作进一步分析。并用半定量RT-PCR对其中3个上调基因进行鉴定。结果Microarray分析显示，HCV-1b C基因插入突变体编码蛋白比c蛋白引起更多的基因表达改变，主要集中在信号传导、蛋白酶活性、分子转运、免疫反应等，特别是免疫反应基因表达更加显著。C基因插入突变体编码蛋白表达可同时导致凋亡基因／抗凋亡基因表达上调或下调及致癌基因上调。半定量RT-PCR对有趣的致癌基因FHL2、抗凋亡基因PRKCZ和凋亡基因LGALSI的鉴定结果表明，FHL2、PRKCZ和LGALSI基因的表达比空载体转染对照组相同基因明显上调。结论Hcvc基因插入突变体编码蛋白在Huh-7细胞表达对其基因表达有很大影响，其中对免疫反应基因的影响更明显，这一结果对理解HCV C基因插入突变体编码蛋白在HCV致病过程中的作用及其研制抗HCV药物均有重大的参考价值。     

线探针核酸杂交分析贵州地区HCV感染株基因型

目的　分析贵州地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染株的基因型。方法　用第二代线探针核酸杂交方法,对９８ 例ＨＣＶ感染者血清进行基因分型。结果　１２ 例献血员血清,均为ＨＣＶ１ｂ 型;１５ 例血液病患者中,１４ 例（９３－３％ ）为ＨＣＶ１ｂ ,１ 例（６－７％ ）为ＨＣＶ１ｂ ＋ ２ 型。慢性丙肝患者３７ 例中,ＨＣＶ１ｂ 型３４例（９１－９％ ） ,混合感染基因型３ 例（ＨＣＶ１ａ ＋ １ｂ 、ＨＣＶ１ｂ ＋ ２ 、ＨＣＶ１ａ ．１ｂ ＋ ２ａ２ｃ 各１ 例）。静脉药瘾者３４ 例,其中ＨＣＶ１ｂ 感染１３ 例（３８－２％ ） ,ＨＣＶ６ａ１０ 例（２９－４％ ） ,ＨＣＶ３ｂ４ 例（１１－８％ ） ,ＨＣＶ３ａ１ 例（２－９ ％） ,混合感染６ 例（１７－６ ％） ,大多为ＨＣＶ２ 复合其他基因型。结论　贵州地区ＨＣＶ感染者中,以ＨＣＶ１ｂ 基因型为主,其次为ＨＣＶ６ａ ,尚存在ＨＣＶ３ａ 和ＨＣＶ３ｂ 。其中ＨＣＶ３ａ、３ｂ 、６ａ ,在本地区系首次报告,但主要存在于静脉药瘾者中。虽然有混合感染基因型的存在,但其基因基础需测序分析