RNA干扰抑制c-Met表达对喉癌Hep-2细胞体内外生长的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人喉癌Hep-2细胞c-Met基因表达,观察对其体外生物学活性和体内生长的影响.方法 构建能够表达针对c-Met的小干扰RNA的RNAi质粒和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂将其转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT-PCR及Western Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力.在裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c-Met-siRNA基因治疗实验中,采用Western Blot法检测重组质粒对c-Met基因及MMP-9、VEGF基因表达的影响.结果 pSilencer2.0/c-Met-shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c-Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P值分别为0.003和0.02),细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制(P值分别为0.001,0.004和0.004).肿瘤接种到裸鼠后第35天,重组质粒组肿瘤体积为(138±27)mm~3,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);重组质粒组瘤体内c-Met、MMP-9、VEGF基因表达率比对照组明显降低(P<0.05).结论 c-Met-siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动、侵袭及移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略.     

抑制水通道蛋白1对Hep-2细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察水通道蛋白1(AQP-1)对喉癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用MTT法、流式细胞仪及原位末端标记(TUNEL)法、免疫组织化学SABC方法多种技术分别检测AQP-1的抑制剂乙酰唑胺对细胞生长抑制率、凋亡率和细胞内AQP-1蛋白表达的影响。结果:乙酰唑胺在5×10-5mol/L浓度下对Hep-2细胞内AQP-1蛋白表达有明显的抑制作用,细胞生长抑制率和细胞凋亡率均随时间延长而增大,呈时间依赖性。并且TUNEL法检测的细胞凋亡率与免疫组织化学SABC方法检测的AQP-1蛋白抑制率呈明显正相关(r=0.784,P<0.05)。结论:乙酰唑胺在一定浓度下对AQP-1的抑制可显著诱导喉癌Hep-2细胞凋亡,提示AQP-1可能成为治疗喉癌新的靶点。     

RNA干扰细胞周期蛋白D1对Hep-2周期和凋亡的影响

目的研究小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)抑制细胞周期蛋白D1(cyclin D1)对喉鳞状细胞癌(简称喉癌)细胞生长和凋亡的影响。方法通过脂质体转染试剂将针对cyclin D1的特异小干扰RNA转入喉癌细胞,利用MTT法检测喉癌细胞生长抑制情况,流式细胞技术检测喉癌细胞周期变化和细胞凋亡。结果MTT结果表明喉癌细胞生长受到抑制,并具有时间依赖性。同时实验组喉癌细胞周期受到影响,并检测到喉癌细胞的凋亡。结论Cyclin D1基因沉默后,喉癌细胞生长受到了抑制,细胞周期受到影响,并能够最终导致喉癌细胞凋亡。     

RNA干扰沉默Aurora-A基因抑制喉癌Hep-2细胞生长的实验研究

目的 研究RNA干扰沉默Aurora-A基因后对喉癌Hep-2细胞体外体内生长的抑制作用.方法 构建靶向Aurora-A的小干扰RNA(siRNA)表达质粒并转染喉鳞癌Hep-2细胞株,采用CCK-8实验、Transwell实验、软琼脂克隆形成实验和裸鼠体内接种观察Aurora-A沉默后Hep-2细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力以及体内肿瘤生长情况,Western blot和免疫组化检测参与细胞黏附侵袭的重要因子黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达情况.结果 Hep-2细胞转染Aurora-A siRNA 后,siRNA-3实验组的Aurora-A蛋白的表达下降了52％,CCK-8实验中siRNA-3组细胞的平均(x±s)吸光度值为(3.268±0.106),低于Hep-2细胞组的(3.722 ±0.152),差异有统计学意义(F=17.634,P＜0.01);Transwell实验显示,siRNA-3组每个视野的平均侵袭细胞数目为(110.0±18.0)个,较Hep-2组的(236.0 ±26.0)个减少,两组差异有统计学意义(F=26.462,P＜0.01);克隆形成实验中,siRNA-3组平均集落数目(31.0±6.6)个,低于Hep-2组平均细胞集落数目(104.0±14.0)个(F=75.321,P＜0.001).接种后,体内移植瘤生长受到抑制,siRNA-3组的肿瘤平均体积为(127.77±174.83) mm3,低于Hep-2组的肿瘤平均体积(837.26±101.80) mm3(F=28.187,P＜0.001).在体外和体内黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达也下降.结论 抑制Aurora-A基因后,通过降低黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达,抑制Hep-2细胞的生长,减弱肿瘤细胞的恶性侵袭性,Aurora-A可以成为喉鳞癌治疗良好的干预靶点.     

Bmi-1基因RNAi对喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的:构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,观察其对喉癌细胞Hep-2增殖、侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL2GFP,构建Bmi-1基因的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1。实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测稳定转染vshRNA-Bmi-1后喉癌细胞中Bmi-1mRNA及蛋白的表达;克隆形成实验及小室侵袭实验检测喉癌细胞增殖和侵袭能力的变化。结果:稳定转染vshRNA-Bmi-1后Hep-2细胞Bmi-1mRNA表达均明显下降,Hep-2细胞中Bmi-1蛋白表达明显下降。抑制率分别为79%及88%。Bmi-1干扰后Hep-2细胞增殖减慢、侵袭能力减弱。结论:成功构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1mRNA和蛋白在喉癌细胞Hep-2中的表达。Bmi-1基因的RNAi能抑制喉癌细胞Hep-2的增殖和侵袭能力。     

人喉鳞癌组织中c-myc蛋白的表达及c-myc siRNA下调喉癌Hep-2细胞中c-myc的表达对细胞增殖的影响

目的:检测喉鳞状细胞癌组织中c-myc的表达及利用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制喉癌Hew2细胞中c-myc的表达对细胞增殖及抗凋亡的影响,探讨在喉癌治疗中将c-myc作为基因治疗靶点的价值.方法:免疫组织化学法检测80例喉鳞状细胞癌和30例声带息肉组织中的c-myc和Rb蛋白的表达;利用RNAi技术将c-myc siRNA转染到喉癌Hep-2细胞中,Western Blotting法检测c-myc蛋白的表达,RT-PCR法检测c-myc mRNA的表达;MTT法检测转染c-myc siRNA 24、48、72 h后,或转染不同浓度的c-myc siRNA(25、50、75 nmol/L)培养72 h,或在转染后加入不同浓度的5-Fu培养48 h,细胞增殖情况;流式细胞仪检测c-myc siRNA与5-Fu联合应用对喉癌细胞凋亡的影响.结果:免疫组织化学结果显示c-myc蛋白在喉鳞状细胞癌组织中表达增强,Rb蛋白表达下降,二者存在负相关;Hep-2细胞转染c-myc siRNA后,c-myc蛋白和tuRNA的表达水平逐渐下调;MTT结果显示随着转染c-myc siRNA浓度的增加,Hep-2细胞的存活率受到明显的抑制,具有浓度依赖性;当转染c-myc siRNA(50 nmol/L)后Hep-2细胞的抑制效率随时间的延长而增加,具有时间依赖性;当联合使用5-Fu时,在同一浓度5-Fu作用下,转染c-myc siRNA组细胞的增殖活性明显受到抑制;凋亡检测结果显示,当c-myc siRNA与5-Fu联合使用时,可明显提高Hep-2细胞对5-Fu的敏感性,在较低剂量时凋亡细胞显著增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:喉鳞状细胞癌组织中存在c-myc的高表达,c-myc siRNA可以特异性地下调Hew-2细胞中c-myc的表达,抑制喉癌细胞的增殖,增加细胞对5-Fu的敏感性,表明c-myc或许可以成为喉癌基因治疗中一个重要的分子靶点.     

靶向人端粒酶小干扰RNA对人喉癌Hep-2细胞系形态学影响

目的 探讨靶向人端粒酶基因siRNA对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞形态学的影响。方法 根据人端粒酶基因设计和合成人端粒酶siRNA和随机的siN.C作为阴性对照,通过转染载体Lipofectamine 2000脂质体转染Hep 2细胞,观察形态学结构。结果 转染siRNA 48?h后细胞皱缩、变圆并开始脱落。HE染色显示细胞呈明显的良性转化。透射电镜下可见细胞凋亡、胀亡的形态改变。结论 靶向人端粒酶基因的siRNA能促使Hep-2细胞形态呈良性转化,并能促进肿瘤细胞凋亡。     

RNA干扰技术沉默上皮型钙黏蛋白表达对体外培养的喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的　通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术沉默喉癌He p - 2 细胞上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达,探讨E-cadherin对Hep-2细胞增殖能力的影响。方法　设计、合成特异性小干扰RNA（siRNA）和无基因沉默功能的阴性siRNA转染Hep-2细胞,获得下调E-cadherin基因表达的体外培养的Hep-2细胞;荧光定量PCR检测E-cadherin基因的沉默效果;体外细胞增殖实验（MTT）检测Hep-2细胞体外增殖能力的变化。结果　①重组质粒和脂质体质量体积按1：1转染时,转染效率最高组siRNA-3达65%。②荧光定量PCR：重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-siRNA1、pRNAT-U6.1/Neo-siRNA2、pRNAT-U6.1/Neo-siRNA3使E-cadherin mRNA的表达下调。以空白对照组为基准（设为1）,E-cadherin相对于β-actin的改变倍数siRNA-1组=0.00092,siRNA-2组=0.00143,siRNA-3组=0.00045,阴性对照组=3.44898,差异有统计学意义。③MTT：经特异性siRNA处理的Hep-2细胞生长速度较对照组增快,差异有统计学意义。结论　有效抑制Hep-2细胞E-cadherin mRNA的表达使Hep-2细胞的增殖能力增强。     

Jab1靶向shRNA质粒构建及其对Hep-2细胞目的基因沉默效应

目的 利用RNA干扰技术构建Jab1基因靶向shRNA质粒,观察目的 基因沉默效应及对人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2细胞(简称Hep-2细胞)的影响.方法 设计合成以Jab1基因为靶向目标的shRNA,将其定向克隆到真核表达载体pGenesill.1中形成重组质粒,利用脂质体介导的方法将质粒转染至Hep-2细胞,通过W...     

RNA干扰介导的PIK3CA基因沉默抑制Hep-2细胞增殖和侵袭力

目的观察RNA干扰介导PIK3CA基因表达沉默对喉鳞状细胞癌（简称喉癌）细胞增殖和侵袭力的影响,探讨PIK3CA基因作为喉癌基因治疗靶标的可行性。方法构建PIK3CA-shRNA的慢病毒表达载体,在脂质体介导下转染人喉癌细胞Hep-2。采用real-time RT-PCR和Western-blot检测PIK3CA基因的表达,MTT法、细胞克隆形成实验、细胞生长曲线检测细胞生长增殖,Boyden小室模型检测细胞的体外侵袭力。结果表达PIK3CA-shRNA的慢病毒载体构建成功;与对照组相比,实验组细胞PIK3CA mRNA和蛋白表达明显下调,分别达75％和70％（P〈0．05）;细胞增殖和侵袭力均受到明显抑制,差异显著（P〈0．05）。结论靶向PIK3CA基因的RNA干扰可抑制喉癌细胞的增殖和侵袭力,PIK3CA有望成为喉癌基因治疗的新的候选基因。     

RNA干扰Jabl基因对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖影响

目的 通过脂质体将人工合成的Jab1 siRNA Ⅱ包裹后导入人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞(简称Hep-2细胞)中,使Jab1基因的表达受到抑制,并通过不同的方法来观察Jab1 siRNA Ⅱ对Jab1基因的表达及细胞增殖影响.方法 MTT法检测Jab1 siRNA Ⅱ不同时间对Hep-2细胞增殖的影响,RT-PCR方...     

阻断氯通道对人喉癌Hep-2细胞增殖及凋亡的影响

目的研究氯通道阻断剂5-硝基-2-(3-苯丙氨基)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)- benzoic acid,NPPB]对人喉表皮样癌细胞(Hep-2)细胞增殖及凋亡的影响,探讨氯通道在喉癌中的意义。方法以Hep-2细胞为研究对象,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度NPPB对Hep-2细胞增殖的影响;用流式细胞术检测NPPB阻断氯通道前后Hep-2细胞凋亡率及细胞周期变化。结果NPPB浓度依赖性地抑制Hep-2细胞增殖,NPPB阻断氯通道前后Hep-2细胞凋亡率及细胞周期存在显著性差异。结论氯通道与Hep-2细胞增殖及凋亡密切相关,阻断氯通道可抑制Hep-2细胞增殖、诱导Hep-2细胞凋亡。     

稳定表达siRNA-STAT3基因Hep-2细胞系的建立

目的建立稳定表达siRNA-STAT3基因的Hep-2细胞系,为进一步探讨STAT3在喉癌中的作用机制提供基础。方法产生针对STAT3的小发卡状RNA寡核苷酸,连接到PGPU6/GFP/Neo载体,双酶切和质粒测序鉴定真核表达质粒PGPU6/GFP/Neo-siRNA-STAT3,G418筛选稳定转染细胞系,蛋白印迹法测定p-STAT3的表达。分别用MTT法绘制生长曲线和平板克隆形成实验测定单细胞增殖能力。结果构建了重组干扰质粒并筛选出了阳性克隆,蛋白印迹法鉴定STAT3被抑制后p-STAT3表达也明显下降。生长曲线显示siRNA-STAT3组3天后抑制效应才较为明显（P=0.001）,5d后抑制效应更加突出（P=0.000）,其抑制效应呈时间-效应关系。另外,siRNA-STAT3组单克隆形成率也明显低于对照组（P=0.000）。结论本研究筛选了可稳定、较高水平表达siRNA-STAT3的Hep-2细胞系。干扰STAT3表达对细胞增殖抑制的作用较为明显。     

新城疫病毒对Hep-2肿瘤细胞的抑制效应

目的探讨新城疫病毒(newcastlediseasevirus,NDV)对Hep-2肿瘤细胞的杀伤效应及其免疫刺激作用。方法采用考马斯亮兰染色法观察NDV感染对Hep-2肿瘤细胞细胞骨架的影响。运用甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT)染色法检测NDV感染致Hep-2肿瘤细胞死亡的杀伤率。通过免疫荧光结合流式细胞仪(flowcytometer,FCM)检测Hep-2肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(majorhistocompabilitycomplexclassImolecules,MHC-I)的表达情况。另外,分离人外周血淋巴细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)作为效应细胞,以NDV感染的Hep-2肿瘤细胞作为靶细胞,同时设空白细胞对照,通过特异性细胞毒T淋巴细胞实验,探讨NDV所介导的抑瘤作用。结果NDV可致Hep-2肿瘤细胞的细胞骨架发生改变,对体外培养Hep-2肿瘤细胞的杀伤率达77.7%,可上调其表面MHC-I类分子的表达,并且能够刺激增强人外周血淋巴细胞中肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)活性,杀伤率为23.54%。结论NDV可有效杀伤Hep-2肿瘤细胞,并刺激产生特异性抗肿瘤免疫反应。     

人喉癌Hep-2细胞膜钾离子通道与RNA编辑酶1的相关性

目的研究人喉癌细胞系Hep-2细胞膜钾离子通道特性及其与RNA编辑酶1(RNA-dependent adenosinedeaminase1,ADAR1)的相关性.方法以Hep-2细胞为研究对象,采用穿孔膜片钳全细胞记录法研究钾离子通道特性,用逆转录聚合酶链反应检测四乙胺(tetraethylammonium,TEA)阻断钾离子通道前后Hep-2细胞ADAR1 mRNA的表达.结果 Hep-2细胞膜的静息膜电位为(-29.8±1.9)mV,在钳制电压-40 mV,阶跃电压在-80～ 80 mV,记录到一种跨膜电流,该跨膜电流具有电压依赖、外向整流特性,该电流在延迟25ms后最大激活,800 ms内不失活,可被阻断剂TEA阻断.Hep-2细胞钾离子通道被TEA阻断前后ADAR1mRNA相对表达量存在显著性差异.结论 Hep-2细胞膜上存在延迟整流钾离子通道,此钾离子通道可能和ADAR1 mRNA的表达密切相关.