体外血管生成三维培养模型的构建

目的建立脐静脉内皮细胞（HUVECs）的体外血管生成的三维培养模型。方法以酶消化法获得以HUVECs为主的混合细胞悬液,经反复贴壁法分离纯化HUVECs,通过免疫细胞化学染色鉴定。采用夹心培养法构建HUVECs的体外血管生成三维培养模型。结果HUVECs在胶原凝胶之间,24h左右血管样结构的分支之间相互沟通连接形成复杂的网状结构。2d后凝胶内的细胞开始退化,3d发现大部分细胞出现崩解。24h凝胶经H—E染色可见细胞索及原始血管腔形成。结论成功建立体外血管生成的三维培养模型。夹心培养法是较为成熟的体外血管生成的三维培养方法,具有操作简便、三维血管样结构形成数量多、网络结构复杂等特点。     

人参皂苷Rg3抗肿瘤新生血管形成的实验研究

目的：探讨人参皂苷Rg3的抗肿瘤血管形成作用。方法：用含不同浓度人参皂苷Rg3的培养液培养人肺癌SPC－A－1细胞，收集培养上清并制备条件培养液（CM），将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）团培养在纤维蛋白凝胶中，在凝胶上面加入CM，观察并记录内皮细胞形成的血管状结构数量。结果：来自肺癌细胞的CM能刺激内皮细胞呈管状结构生长，用人参皂苷Rg3处理肺癌细胞后的CM对管状细胞生长的刺激作用减弱。结论：人参皂苷Rg3在体外能抑制肺癌细胞新生血管的形成。     

组织工程化血管的种子细胞在体外培养扩增方法的实验性研究

目的为培养组织工程化血管的实验研究提供细胞来源.方法采用酶消化法和组织块法培养人脐静脉血管内皮细胞、人脐动脉血管平滑肌细胞及成纤维细胞,并进行细胞的传代、纯化、鉴定以及形态学观察.结果培养细胞符合血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及成纤维细胞的各有形态特征.结论所培养的细胞有望作为体外构建组织工程化血管的应用.     

人脐静脉内皮细胞的原代培养及体外层流体系的建立

目的:建立体外培养原代人脐静脉内皮细胞的方法及体外模拟自然生理剪切力条件下白细胞流动体系.方法:采用胶原酶、胰蛋白酶联合消化法培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、免疫荧光对细胞进行鉴定,并通过体外层流体系观察白细胞和人脐静脉内皮细胞的相互作用.结果:种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长,48～72 h生长最快,5～7 d汇合.内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,VWF相关抗原检测为阳性.人脐静脉内皮细胞经凝血酶刺激后,内皮细胞表面表达P-选择素并可以介导白细胞在其表面滚动.讨论:形态学及免疫学鉴定结果表明培养细胞为人脐静脉内皮细胞,体外层流体系的建立为以后研究工作奠定了基础.     

人脐静脉血管内皮细胞的培养和鉴定

目的: 建立血管内皮细胞体外培养的模型,为研究内皮细胞提供重要的实验方法.方法: 采用0.1%I型胶原酶消化灌注脐静脉,在37 ℃水浴箱内孵育18～20 min,离心后向沉淀内加入L-DMEM培养液(含10 mg/L内皮细胞生长因子),吹打成单细胞悬液,放入预铺1.5%明胶的培养瓶内,在CO2培养箱中培养,48 h后换液1次,以后每2～3 d换液1次,每天在倒置相差显微镜下观察细胞,免疫组织化学法进行Ⅷ因子相关抗原鉴定.结果: 经胶原酶消化法获得的细胞经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉内皮细胞.结论: 用胶原酶消化法是获得血管内皮细胞的一种好方法,获得的细胞数量多、成活率高.     

canstatin基因在体外培养血管内皮细胞中的表达及其意义

目的 探讨canstatin基因通过电穿孔法在体外培养人脐静脉内皮细胞中的表达及对其生长与凋亡的影响.方法 将canstatin基因通过电穿孔法转染人脐静脉内皮细胞HUV-ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆.用RT-PCR检测canstatin在转基因细胞mRNA中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性.结果 检测到canstatin在转染人脐静脉内皮细胞中的表达,canstatin基因转染内皮细胞组的凋亡率(16.90%)高于空载体组(1.47%)和亲代细胞组(2.85%)(P＜0.01),转染细胞生长明显受抑.结论 canstatin能特异地抑制血管内皮细胞增殖,并诱导细胞凋亡.     

碱性成纤维细胞生长因子对三维培养内皮细胞血管样结构形成的作用研究

目的 :观察碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)对三维培养内皮细胞血管样结构形成的作用。方法 :实验分为两组 ,即加入浓度 2 0ng·ml-1bFGF的bFGF组及不加bFGF的对照组。采用Pepper等介绍的三维培养胶原基质配制及细胞培养方法制作标本 ,透射电子显微镜下观察结果。 结果 :对照组内皮细胞在胶的表面呈单层生长 ,未见其向深层生长及管腔结构形成。bFGF组内皮细胞在胶内呈多层浸润生长 ,伸展、变形呈扁平状 ;内皮细胞与胶原纤维之间可见半桥粒结构 ,内皮细胞之间以桥粒连接 ,形成毛细血管样管腔结构 ;在形成管状结构的内皮细胞中可见空泡样变 ,边界由胞质与胞膜组成 ,细胞核变形 ,凹陷 ,可见切迹 ,或呈薄片状 ;内皮细胞游离面有微绒毛突起。结论 :三维培养技术简单易行 ,是揭示在体血管形成的最简单模型 ;bFGF有利于三维培养内皮细胞在有展性的胶原基质面形成血管样结构。     

人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定

目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法,提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法取2根脐带(至少20 cm)冲净淤血,采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液,一根用0.2%胶原酶Ⅱ,另一根用0.1%胶原酶Ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液,比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有10 ng/mL的VEGF的培养基中培养,观察细胞的生长及传代。并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点,同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周期。结果两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞,胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶,且比较理想的消化时间均为13 min,细胞接种后4～5 h开始贴壁生长,1周左右可生长成单层,光镜下呈多角形,"铺路石"样排列,免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。结论胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法,而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液,成功率高,可靠性大,可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。     

恶性胶质瘤细胞诱导内皮细胞三维成型的体外实验

目的观察在三维胶原体外培养条件下恶性胶质瘤细胞体外诱导内皮细胞血管生成的作用.方法采用鼠尾胶原作为内皮细胞样细胞ECV-304培养的支架,以恶性胶质瘤细胞系SHG-44作为诱导条件,观测ECV-304细胞生长和小管样结构形成的过程,测定形成曲线、小管管径和管长以及细胞周期,比较有和无SHG-44细胞诱导ECV-304细胞形成小管样结构的差异.结果 SHG-44细胞对体外三维培养的ECV-304细胞具有诱导小管形成的作用,所诱导的小管管径和管长数值均较对照组大,小管形成时间早.结论恶性胶质瘤细胞能促进内皮细胞的生长、迁移和小管结构的形成,是研究体外血管生成研究的良好模型.     

人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定

目的研究人脐静脉内皮细胞的体外培养方法,并进行细胞鉴定。方法胰蛋白酶灌流消化法收集人脐静脉内皮细胞,加入DMEM/F12混合培养基,37℃5%CO2培养箱中培养,观察细胞形态及生长状况,近融合时消化传代培养。采用形态学观察和CD34免疫组化法进行细胞鉴定。结果原代培养的人脐静脉内皮细胞约于24h完全贴壁,4~5d后融合成单层铺路石样结构。CD34染色证实培养的细胞是人脐静脉内皮细胞。结论胰蛋白酶灌流消化法可获得大量连续传代扩增的人脐静脉内皮细胞。     

QY1骨髓多能间质干细胞系向心肌细胞和血管内皮细胞分化

目的:探索QY1骨髓多能间质干细胞系在体外向心肌细胞、血管内皮细胞分化的能力;优化骨髓多能间质干细胞向心肌细胞分化的体外适宜诱导条件;并初步探讨骨髓间质干细胞向成心肌成血管细胞分化的能力.方法:分别用5-氮胞苷、血管内皮生长因子对QY1骨髓多能间质干细胞进行定向诱导分化.利用免疫组化、RT-PCR鉴定分化后的细胞.结果:在传代培养至72 h时,加入10 μmol/L5-氮胞苷诱导24 h后换液培养,以后每7 d换液1次,培养14 d进行再次诱导的条件下,细胞能出现自发性搏动的心肌细胞和肌管样结构,诱导率达(39.47±0.56)%.心肌特异性的表面抗体α-横纹肌肌动蛋白、心肌连接蛋白-43表达阳性,RT-PCR检测有心肌特异性因子α-肌球蛋白重链表达.在用血管内皮生长因子诱导48 h后,出现呈直线排列的血管内皮细胞;7 d后,有部分区域细胞相互连接呈血管内皮细胞网状;14 d时免疫组化检测,发现诱导后的细胞血管内皮特异性表面抗体CD31和Ⅷ因子表达阳性.结论:QY1骨髓多能间质干细胞系细胞在体外特定条件下具有分化为心肌细胞和血管内皮细胞的能力.     

脐血CD34＋细胞向内皮细胞诱导分化的体外研究

目的：探讨从脐血中分离CD34＋细胞,并诱导、鉴定其分化为内皮细胞的方法。方法：羟乙基淀粉沉降、密度梯度离心两步法制备脐血单个核细胞,免疫磁珠分选法（MACS）获得CD34＋细胞,在含有细胞因子的M199培养基中诱导。观察细胞形态变化,摄取Dit标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil—AcLDL）的情况,流式鉴定细胞表面标志。结果：分选CD34＋细胞纯度在91％以上,培养3d有明显集落形成及部分细胞贴壁,14d贴壁细胞呈条索状,逐渐增多后呈铺路石样改变。流式检测贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志物CD144、vWF、CD31、CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达,与成熟的脐静脉内皮细胞表达率相近。免疫荧光发现贴壁细胞呈现红色荧光,提示细胞摄取Dil—AcLDL,证明CD34＋细胞分化为有功能的内皮细胞。结论：脐血中存在CD34＋细胞且用两步法和MACS可获得高纯度CD34＋细胞,在特定条件下可分化为内皮细胞。     

人循环内皮祖细胞的分离培养和诱导分化

目的研究人循环内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、分化及鉴定。方法采用Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离单个核细胞,接种于含血管内皮生长因子（VEGF）及优质胎牛血清的M199培养液中,对其进行体外诱导分化培养,以免疫组化、细胞荧光化学法及流式细胞检测法鉴定贴壁细胞的内皮细胞特异性标志。结果人外周血单个核细胞（MNCs）经体外培养,表达内皮细胞的特异性抗原,包括VWF、CD31和CD34,并显示出能内吞乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）,结合UE小1等内皮细胞特性,提示这些细胞具有内皮细胞的表面蛋白特性和具有内皮细胞功能。结论人外周血中存在具有分化增殖能力的EPCs,在一定培养条件下可分化为血管内皮细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子对小鼠骨髓内皮细胞增殖的促进作用

目的以内皮细胞培养基(Endo-M)培养小鼠骨髓内皮细胞,观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对骨髓内皮细胞增殖的影响。方法用Endo-M培养小鼠骨髓内皮细胞,通过Wright’s Giemsa染色计数内皮细胞集落,免疫荧光法观察内皮细胞表型;加入不同浓度的bFGF,通过集落形成率、MTT法和流式细胞仪检测内皮细胞生长周期,观察bFGF对内皮细胞体外扩增的影响。结果Endo-M诱导的骨髓细胞可以生成内皮细胞,vWF检测阳性。加入不同浓度的bFGF,集落计数及MTT法均证实了bFGF对内皮细胞的增殖具有明显的促进作用,比较实验组(bFGF组)和对照组细胞的生长曲线,两者有明显差异(P<0.05)。结论bFGF对内皮细胞的增殖具有促进作用。     

人外周血单个核细胞向内皮祖细胞及内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨体外分离、培养成人外周血单个核细胞,并将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞的方法.方法 密度梯度离心法提取人外周血单个核细胞,用含有生长因子的内皮培养基将其体外培养、定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞;分别用流式细胞技术及RT-PCR通过对内皮祖细胞及内皮细胞表面特异性抗原的检测进行细胞鉴定.结果 分离获得的单个核细胞培养7 d后形成梭状的内皮样细胞,部分细胞积聚成团形成克隆集落,流式细胞仪鉴定该细胞表达内皮祖细胞特异性抗原CD34、CD133及VEGFR.继续培养4周后细胞形成典型铺路石样改变,RT-PCR检测有成熟血管内皮细胞特异性基因vWF、eNOS表达.结论 可成功分离人外周血单个核细胞,并可将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟内皮细胞.     

脐带血CD34+细胞体外诱导成为血管内皮细胞的观察

目的研究脐带血CD34^＋细胞在体外适宜的细胞因子作用下，不仅能够大量增殖分化为各系造血细胞，而且还可以向血管内皮细胞增殖分化的特性。方法采用CSF、FLT-3、TPO、IL-3、G-CSF细胞因子在无血清体系中进行不同的组合，分别在1、2周检测增殖后造血细胞的各项指标，同时用半固体培养研究造血细胞集落形成能力。2周后去除所有非贴壁细胞，更换含小牛血清和血管内皮细胞生长因子的培养基继续培养。分别于4、8周后收集液体培养和半固体培养后的贴壁细胞，检测细胞表面标志。结果CD34^＋细胞在适宜条件下，大量地向造血细胞及内皮细胞增殖分化，分别表达各系细胞分化抗原。结论脐带血CD34^＋细胞在体外可以被扩增、诱导分化为血管内皮细胞。     

一种改良的肺微血管内皮细胞培养方法

目的对目前常用的小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)原代培养方法进行改良,以期建立较为容易获取纯化的小鼠PMVECs的方法。方法应用C57小鼠,采用改进的组织块贴壁法分离、培养PMVECs,光镜观察细胞形态,Ⅷ因子相关抗原和CD31相关抗原免疫细胞化学法鉴定培养的PMVECs,并比较改良培养方法与传统培养方法的优越性。结果体外培养的原代PMVECs在光镜下呈类圆形或短梭形,形成单层后呈铺路石样排列,Ⅷ因子相关抗原和CD31荧光染色阳性,利用改良的培养方法培养的细胞生长较传统方法更加快速,分布更加均匀。结论改良的PMVECs分离、培养方法获得的细胞生长状态良好,克服细胞生长缓慢、杂细胞容易污染等难题,是一种较为理想的培养方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化潜能的研究

目的体外研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)分化为血管内皮细胞的潜能。方法采用密度梯度离心法分离rMSCs,体外扩增并进行鉴定。在内皮细胞生长培养基(EGM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导rMSCs向血管内皮细胞分化,观察细胞形态学变化。采用免疫细胞化学法和Dil荧光标记法,分别检测诱导后rMSCs的内皮细胞表型表达及对乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的摄取能力。结果形态学观察显示,诱导后的rMSCs可见类似内皮细胞样改变,并表达血管内皮细胞特异的表面标志vWF和CD31,但仅少数细胞具有摄取Dil-Ac-LDL的能力。结论VEGF和bFGF在体外能够诱导rMSCs出现内皮细胞表型,但尚不完全具备成熟内皮细胞的功能特性。rMSCs具有向血管内皮细胞分化的潜能。     

小鼠骨髓源性内皮祖细胞的体外培养及标志物鉴定

［摘要］目的: 探讨小鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）的体外培养、诱导分化及表面标志物的鉴别。方法： 收集ICR小鼠骨髓EPCs,Ficoll分离单核细胞,使用含有血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基培养。分别在细胞培养5,10,15及20 d后检测细胞表面的内皮细胞标志物。结果： 培养5 d后细胞开始出现上皮细胞的形态,有伪足出现;培养10 d,细胞开始增殖,成圆形,出现梭形细胞;培养15 d,细胞出现较为典型的内皮细胞形态,铺路石状;培养20 d,细胞出现长梭形拉网状,即类似成熟内皮细胞形态。免疫荧光染色及流式定量检测结果显示,CD34在EPCs中的表达随培养时间延长有渐变减弱的趋势;血管内皮生长因子受体 2（VEGFR-2）在EPCs的表达随培养时间延长有渐变增强的趋势。结论： 骨髓EPCs在特定诱导条件下可分化出典型的成熟内皮细胞,取材方便,扩增能力较强。