代综方对3T3-L1脂肪细胞分化及相关基因表达的影响

目的：研究代综方（Dai Zong Fang,DZF）对3T3-L1脂肪细胞分化及分化过程中相关基因表达的影响。方法：体外培养3T3-L1前脂肪细胞,鸡尾酒式诱导脂肪细胞分化,给予不同浓度DZF干预6 d。BODIPY493/503与DAPI双荧光染色观察脂肪细胞分化情况;甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶法测定细胞内甘油三酯（triglyceride,TG）含量;RT-PCR检测CCAAT增强子结合蛋白-α（CCAAT enhancer binding protein-α,C/EBP-α）、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator activated re－ceptor-γ,PPAR-γ）、乙酰辅酶A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase,ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FAS）的mRNA表达;Western blot法检测PPAR-γ、C/EBP-α的蛋白表达。结果：DZF抑制脂肪细胞分化,降低细胞内TG含量,并呈剂量依赖效应;与对照组比较,DZF大剂量组明显下调ACC的mRNA表达（P<0.05）,DZF小中大剂量均明显下调FAS的mRNA表达（P<0.01）;与对照组比较,DZF中、大剂量组明显下调C/EBPα、PPAR-γ的mRNA表达（P<0.01）,Western蛋白表达结果与mRNA结果一致。结论：DZF能够明显抑制3T3-L1脂肪细胞的分化程度,其机制可能与下调C/EBPα、PPAR-γ、ACC、FAS基因的表达有关。     

染料木苷对3T3-L1脂肪细胞分化以及AMPK磷酸化的影响

目的观察染料木苷(Genistin,GIN)对3T3-L1前脂肪细胞细胞分化以及分化过程中腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化程度的影响。方法用激素鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,用MTT法观察GIN对细胞生存率的影响,以油红O染色法镜下观察3T3-L1前脂肪细胞分化的情况,并通过比色分析法检测GIN对细胞内脂滴堆积量的影响;用Western blotting方法分别检测对照组和给药组细胞分化过程中细胞中AMPK,P-AMPK(Thr172)蛋白表达量,借以计算AMPK磷酸化比率。结果分化诱导后,对照组脂肪细胞呈典型的成熟脂肪细胞表型,形成"戒指环"结构,经100μM GIN干预后,脂滴数量减少,体积减小,通过比色分析法量化后显示100μM GIN可减少胞内脂质的堆积(P<0.05)。与对照组相比,给药组从第4天开始上调p-AMPK(Thr172)/AMPK比率,并持续到第10天(P<0.05)。结论 GIN可通过激活AMPK抑制3T3-L1脂肪细胞分化。     

VPS13A在3T3⁃L1脂肪细胞分化过程中的表达及调控研究

目的：明确囊泡分选蛋白13A（vacuolar protein sorting 13 homolog A,VPS13A）在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embry- onic fibroblast cells,3T3-L1）分化过程中的表达水平;探索VPS13A对3T3-L1细胞的影响。方法：利用Western blot及Q-PCR法检测3T3-L1细胞在分化过程中VPS13A的表达,利用CRISPR/Cas9系统构建VPS13A稳定敲降细胞系,Western blot和油红染色检测VPS13A敲降后对3T3-L1细胞分化的影响。结果：VPS13A的表达在3T3-L1分化过程的早期降低,在分化的后期升高。敲降VPS13A后,3T3-L1细胞中脂滴增多,参与调控脂肪细胞分化基因的表达水平升高。结论：在3T3-L1细胞中VPS13A的表达水平在分化过程中被调控,敲降VPS13A可以促进3T3-L1细胞的分化成熟。     

11β⁃羟化类固醇脱氢酶敲除对高脂饮食喂养小鼠认知功能的影响

目的：探究11β-羟化类固醇脱氢酶1（11β-hydroxysteroid dehydrogenase,11β-HSD1）基因敲除对小鼠整体代谢和认知功能的影响。方法：将C57BL/6J为遗传背景的野生对照组及11β-HSD1基因敲除组各15只小鼠高脂喂养20周,代谢笼评估能量代谢,行为学评估观察小鼠认知功能,电镜评估海马体的线粒体结构,免疫荧光及PCR确定其认知功能、线粒体功能相关基因及炎症基因的变化。结果：11β-HSD1基因敲除能够提高高脂喂养小鼠学习和记忆能力,改善握力,改善海马体的微结构、线粒体含量变多,认知相关基因、线粒体呼吸功能相关基因上调,炎症相关基因改变。结论：11β-HSD1敲除后高脂饮食喂养小鼠认知功能显著改善,握力显著提高,可能是治疗认知功能障碍的有效靶点。     

槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

目的探讨槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响及其机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和油红O染色检测不同浓度(10、30、50、100μmol/L)的槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响,荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和CAA T/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的表达。结果 10～100μmol/L槟榔碱作用3T3-L1前脂肪细胞12 h和24 h能促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,且呈一定的量效关系。到分化的第9天,与对照组相比,50μmol/L槟榔碱组胞浆中的脂滴明显减少,同时PPARγ和C/EBPαmRNA表达水平显著降低。结论槟榔碱能促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖、抑制其分化,其机制可能与PPARγ和C/EBPα的表达降低有关。     

维拉帕米对前体脂肪细胞3T3-L1分化及脂质积聚的影响

目的:观察钙离子通道阻滞剂盐酸维拉帕米对3T3鄄L1前体脂肪细胞分化及脂质积聚的影响。方法:体外培养3T3鄄L1前体脂肪细胞,在常规诱导分化方案基础上加用维拉帕米(终浓度30μmol/L),采用油红O染色各分化时段脂肪细胞,计数含脂滴脂肪细胞数。结果:维拉帕米干预后,脂肪细胞分化速度低于正常对照,虽未影响脂滴出现的时间(第4天),但含脂滴脂肪细胞数均显著低于同期正常对照(P<0.001)。结论:维拉帕米具有抑制脂肪细胞分化及脂质积聚的作用。     

3T3-L1前脂肪细胞分化过程中miRNAs表达谱的变化

目的探讨3T3-L1前脂肪细胞分化过程中微小RNA(miRNAs)表达谱的变化。方法3T3-Ll前脂肪细胞培养和诱导分化,通过形态学观察和RT-PCR方法,判断3T3-Ll前脂肪细胞是否分化成脂肪细胞。运用miRNAs芯片技术检测3T3-Ll前脂肪细胞和脂肪细胞中差异表达miRNAs。结果3T3-L1前脂肪细胞呈现成纤维状,诱导分化的第9天,细胞变成球形,内含许多脂滴;过氧化物酶体增殖物激活受体r2(PPARr2)和脂肪性脂肪酸结合蛋白(aP2)的表达显著增加。3T3-L1前脂肪细胞分化成脂肪细胞上调的miRNAs有26个,下调的miRNAs有2个。结论3T3-L1前脂肪细胞分化过程中存在miRNAs表达谱的变化。     

11β-羟化类固醇脱氢酶1在饮食诱导性肥胖大鼠组织中的表达

目的:探讨11-βhydroxysteroid dehydrogenase type 1(11-βHSD1)在肥胖发生过程中的作用。方法:建立饮食诱导的肥胖(DIO)大鼠模型,应用Western blotting方法检测各组织11-βHSD1的蛋白表达,同时应用实时定量PCR检测LPL、re-sistin、FAS等肥胖相关基因的表达,采用放射免疫分析法检测血糖、血脂、胰岛素、TNFα等指标。结果:DIO组大鼠体重、体脂明显高于正常组,DIO组大鼠脂肪、脑、骨骼肌的11-βHSD1表达明显高于正常组,肥胖相关基因LPLr、esistin、FAS等在DIO组内脏脂肪的表达高于正常组,外周血脂、胰岛素DIO组高于正常组,但血糖、TNF-α两组间无明显差异。结论:11-βHSD1在饮食诱导性肥胖大鼠相关组织的表达高于正常组,具有组织特异性;11-βHSD1在内脏脂肪组织的高表达促进肥胖的发生。     

CDK5介导的AMPK磷酸化对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响

【立论依据】 AMPK是细胞及整体能量稳态的调控器。代谢综合征状态下,机体组织广泛存在AMPK活性下降,但AMPK如何失活仍存许多疑问。因此,弄清楚AMPK的失活机制对阐明代谢综合征的发病机制具有重要意义。 【设计思路】 有研究表明CDK5在肥胖小鼠脂肪组织中异常激活,AMPKα2的活性显著降低。同时,AMPKα2 345和529位丝氨酸满足Cdk5的底物一般都具有特定S/TPXK/R序列的条件。据此推测:活化的CDK5能够磷酸化AMPKα2 345和529位丝氨酸,进而抑制AMPKα2的活性,参与代谢综合征的发病。本课题拟在3T3-L1前脂肪细胞上研究Cdk5介导的AMPKα2蛋白磷酸化的作用,为代谢综合征和糖尿病的治疗提供新的思路。 【实验内容】 应用lipofectamine2000转染技术构建Cdk5 siRNA基因的脂肪细胞系3T3-L1-Cdk5 siRNA实验组及其阴性对照组细胞系3T-L1- Mock siRNA(Mock siRNA 为空siRNA转染),实验分为3T3-L1-Cdk5 siRNA组,3T-L1- Mock siRNA 组和3T-L1组,以AIMV无血清培养基培养3T3-L1细胞,使其自然增殖,于增殖第3天起用TNF-α作用于增殖中的3T3-L1细胞,之后每24小时以MTT法观察细胞增殖情况;采用含胰岛素、地塞米松与IBMX的分化培养基诱导分化3T3-L1细胞,于诱导分化第8天起用TNF-α作用于分化中的3T3-L1细胞,此后每3天以油红O染色并染料提取的半定量方法及细胞内甘油三酯测定的方法了解细胞内脂质含量;采用细胞Cdk5/P35和AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒检测3T3-L1细胞中Cdk5和AMPKα2的活性,蛋白质印迹的方法检测3T3-L1细胞AMPKα2 ^S345 、AMPKα2 ^S529及AMPKα2^S345、⁵²⁹磷酸化水平。从而观察CDK5介导的AMPK磷酸化对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响。 【材料】 3T3-L1前脂肪细胞,AIM-V medium,DMEM/F12 培养基,Cdk5 siRNA, AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒,油红O, CO2细胞恒温培养箱。 【可行性】 Cdk5是脯氨酸引导的丝/苏氨酸蛋白酶,特异性磷酸化其底物蛋白的丝氨酸和苏氨酸位点。其磷酸化底物一般都有特定的S/TPXK/R序列。而人、大鼠和小鼠AMPKα2蛋白序列的自动抑制区345位丝氨酸和亚单元结合区域529位丝氨酸有共同的序列YLASSPPSGS 和TGSTLSSVSP,满足Cdk5的底物一般都具有特定的S/TPXK/R序列的条件,实验假设理论上具有可行性。 【创新性】 本课题以Cdk5介导AMPKα2磷酸化进而抑制其活性为切入点,探讨对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响,具有一定的创新性。     

维生素D及其受体对3T3-L1前脂肪细胞分化影响的分子机制

前脂肪细胞增殖、分化过度是肥胖的一个重要病理机制。早在20多年前就已发现维生素D可以抑制3T3-L1前脂肪细胞系分化成熟,相关的分子机制近几年有了新的进展。3T3-L1分化是一个受多种基因蛋白调节的具有严格时序性的过程,现已证实维生素D与其受体结合后作用于3T3-L1分化早期的分子事件,如减少PPARγ配体形成,减少CCAAT/增强子结合蛋白βmRNA的表达,抑制C/EBPβ的转录活性,同时也作用于晚期分子事件,如抑制C/EBPα和PPARγ的mRNA表达等,通过影响这些重要分子发挥其抑制作用。     

游离脂肪酸对小鼠骨骼肌干细胞分化及功能的影响

目的：观察棕榈酸(palmitic acid,PA)对小鼠骨骼肌干细胞分化及功能的影响,为治疗衰老相关的肌少症寻找新思路。方法：对小鼠骨骼肌干细胞诱导分化后,同时予PA(100 μmol/L)干预,用荧光染色法、荧光定量PCR测定成肌基因肌球蛋白重链(myosin heavy chains,MyHC)表达;用seahorse能量代谢仪检测细胞的氧耗增加率,荧光定量PCR 检测线粒体融合基因线粒体融合素基因1(mitofusin1,Mfn1)、视神经萎缩症蛋白基因(opticatrophy 1,Opa1)和裂解基因发动相关因子基因(dynamin 1-like,Drp1)、线粒体分裂素基因1(fission 1,Fis1)的相对表达量。结果：PA刺激后,MyHC荧光表达量下降,肌小管融合率减低,同时seahorse能量代谢仪检测细胞的氧耗增加率(oxygen consumption rate,OCR)降低(P＜0.05);线粒体融合基因无明显异常,但裂解基因表达增加,融合/裂解比值下降(P＜0.05)。结论：游离脂肪酸抑制骨骼肌干细胞分化、影响线粒体氧耗功能,这可能是通过影响线粒体Drp1基因,增加线粒体裂解实现的。     

高浓度游离脂肪酸对大鼠胰岛细胞凋亡的影响

目的 探讨高浓度游离脂肪酸(FFA)对体外胰岛细胞凋亡的影响及其机制.方法 将分离的SD大鼠胰岛按体外培养的条件分为低糖对照组(5.60 mmol/L)、FFA1组(0.25 mmol/L)、FFA2组(0.50 mmol/L)培养48 h后,用低糖(5.60 mmol/L)孵育1 h,收集孵育液用放射免疫法检测胰岛素分泌水平;应用TUNEL法检测各组培养后细胞凋亡百分率;应用免疫组织化学检测培养后caspase-3的表达.结果 ①经FFA培养后的大鼠胰岛胰岛素分泌量降低:FFA 1组、FFA 2组与对照组比较明显减少(P<0.01),并且随FFA浓度的升高胰岛素分泌量减少更明显(p<0.01).②经高浓度FFA培养后大鼠胰岛细胞凋亡增多,胰岛细胞内caspase-3的表达增 多:FFA 1组、2组与对照组比较均明显增多(P<0.01),FFA 1组与FFA 2组组间比较亦差异有显著性(P<0.01).结论 FFA可以减少大鼠胰岛细胞分泌胰岛素,导致胰岛细胞凋亡增多.     

高脂血症和游离脂肪酸与脂肪肝的相关性调查

目的 探讨高脂血症及游离脂肪酸与脂肪肝发生的关系。方法 测定2386名健康体检者的血脂、游离脂肪酸（FFA）水平，并做腹部B超。结果 2386名体检者检出脂肪肝351例，男性脂肪肝患病率明显高于女性（P〈0．01）；脂肪肝组三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）和FFA明显高于非脂肪肝组（P〈0．01）；混合型高脂血症（高TG和高TC）组和高TG血症组脂肪肝的患病率及FFA水平明显高于血脂正常组（P〈0．01），混合型高脂血症组脂肪肝发生率及FFA水平高于高TG血症组（P〈0．05）。结论 脂肪肝发病率与高脂血症尤其是高TG血症和游离脂肪酸密切相关。     

二甲双胍、格列美脲对2型糖尿病患者游离脂肪酸的影响

目的：观察二甲双胍、格列美脲对2型糖尿病（T2DM）患者游离脂肪酸（FFA）的影响,并探讨T2DM中FFA与胰岛素抵抗（IR）的关系。方法：采用前瞻性、病例对照研究,将94例T2DM患者分成单用格列美脲治疗组（n =33）、单用二甲双胍治疗组（n =29）、两药合用治疗组（n=32）,疗程6个月。 采用酶比色法测血清游离脂肪酸。结果：格列美脲组治疗后FFA水平无变化,二甲双胍组和两药合用组治疗后FFA水平明显下降（P＜0.05和P＜0.001)。组间比较,治疗后FFA的下降率两药合用组比格列美脲组明显(P<0.05)。多元逐步回归分析显示FFA水平与HOMA(homeostasis model assessment)胰岛素抵抗（HOMA-IR）关系密切,且FFA下降率与治疗分组有关。结论：二甲双胍单用或与格列美脲合用不仅能降低BMI,改善血糖、IR,还能降低FFA水平,且FFA水平能在一定程度上反映IR水平。     

游离脂肪酸与非酒精性脂肪性肝病的相关性

目的探讨游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)与非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)发病的相关性。方法分别测定296例NAFLD患者和189例健康对照个体血清中的FFA、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(cholesterol,CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)等指标。结果NAFLD组血清FFA水平显著高于对照组[(0.82±0.39)]mmol/L,(0.38±0.17)mmol/L,P<0.01)]。Pearson相关分析提示血清FFA水平与TG,GLU,CHOL,LDL-C存在明显的正相关,与HDL-C存在明显的负相关。结论血清FFA水平与NAFLD患病显著相关,并且与TG,GLU,CHOL等指标相关。     

天麻素对大鼠离体脂肪组织释放游离脂肪酸及抗氧化作用的影响

目的：观察天麻素对大鼠离体脂肪组织释放游离脂肪酸（FFA）及抗氧化作用的影响,并初步探讨其作用机制．方法：实验分8组,正常对照组、盐酸肾上腺素组、天麻素低、中、高浓度组（天麻素浓度分别为1．0×10^-5,1．0×10^-6,1．0×10^-7mol／L）、天麻素中浓度＋异搏定组、天麻素中浓度＋心得安组、天麻素中浓度＋腺苷酸环化酶抑制剂（SQ22,536）组．测定每组离体脂肪组织释放FFA的含量、总抗氧化能力（T—AOC）和丙二醛（MDA）的含量．结果：天麻素能够促进离体脂肪组织释放FFA,并存在剂量效应关系,但其作用没有盐酸肾上腺素强,加入阻断剂异搏定、心得安和SQ22,536,其FFA的释放减少（P〈0．05）;盐酸肾上腺素和中浓度天麻素使T—AOC升高,MDA降低（P〈0．01）．结论：天麻素可促进离体脂肪组织释放FFA,其作用可能部分经β3-肾上腺素能受体、异搏定敏感的L型Ca^2＋通道及腺苷酸环化酶介导．盐酸肾上腺素和天麻素明显增强离体脂肪组织抗氧化能力,使脂肪组织脂质过氧化程度减轻,对脂肪组织有一定的保护作用．     

游离脂肪酸在胆固醇结石成核中的作用

采用分光光度法，测定了软脂酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸这四种离脂肪酸在模拟胆法中对胆固醇结晶生长曲线的影响，探讨它们在胆因醇结石成核过程中的作用。结果表明：软脂酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸，从０．５－２０μｍｏｌ／ｍｌ的不同浓度，使模拟胆汁成核时间均明显减少，仅为对照组的３０％－７０％（Ｐ＜０．０５）。     

小檗碱对脂肪细胞分化的影响

目的 探讨小檗碱对脂肪细胞分化的影响和其机制。方法 培养3T3-L1前脂肪细胞。以四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测3T3-L1前脂肪细胞的增殖,以油红O染色检测3T3-L1脂肪细胞分化过程中胞浆脂肪的堆积,同时采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹技术检测小檗碱对过氧化脂质体增殖激活受体γ2(PPARγ2)mRNA和蛋白质表达的影响。结果 10μmol/L小檗碱使3T3-L1前脂肪细胞的MTT值增加36%(P<0.001),小檗碱处理的脂肪细胞胞浆中,脂肪的堆积明显少于对照组,仅10％～20％的细胞出现较大脂滴。RT-PCR结果显示,在3T3-L1脂肪细胞分化过程中,小檗碱组脂肪细胞的PPARγ2 mRNR较对照组低48％(P<0.01),蛋白质免疫印迹结果也显示小檗碱抑制PPARγ2蛋白质的表达。结论 小檗碱促进前脂肪细胞的增殖,小檗碱减少脂肪细胞分化过程中脂质的堆积、抑制脂肪细胞的分化,可能与其降低PPARγ2mRNA和蛋白质的表达有关,这提示小檗碱在临床上可能适合于治疗肥胖的2型糖尿病患者。     

空腹越野跑对血糖和游离脂肪酸、糖原磷酸化酶BB和心型脂肪酸结合蛋白的影响

目的空腹剧烈运动可造成运动性低血糖,严重时导致心肌损伤。探讨空腹5000 m越野跑对尚未适应训练的新兵心肌主要供能物质的影响,以及监测不易发现的轻微心肌损伤,为部队的新兵制订合理的训练方案提供实验依据。方法入伍1个月男新兵30名,晨起洗漱后空腹越野跑5000 m,分别观察跑前与跑后即刻和4 h血糖和糖原磷酸化酶BB(glyco-gen phosphorylase isoenzyme BB,GPBB)、游离脂肪酸和心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding protein,H-FABP)的变化。结果血糖由运动前的(3.78±0.52)mmol/L升至运动后即刻的(4.36±0.48)mmol/L(P<0.01)。游离脂肪酸由运动前的(141.48±58.52)μmol/L降至运动后即刻的(98.13±33.16)μmol/L和4h的(99.78±18.76)μmol/L(P<0.01)。GPBB由运动前的(22.28±3.47)ng/ml升至运动后即刻的(26.44±3.57)ng/ml和4h的(29.36±5.08)ng/ml(P<0.01)。H-FABP由运动前的(16....