体外培养不同时间后冻存对脐血来源CIK细胞生物学活性的影响

目的： 观察体外培养不同时间后冻存对人脐血来源细胞因子诱导杀伤（cytokine induced killer,CIK）细胞增殖、免疫表型、细胞毒活性以及细胞因子分泌的影响。 方法： CIK细胞在体外培养6 、9 、12 d后冻存1个月,复苏后培养至72 h,其间每隔24 h检测细胞增殖情况,并采用流式细胞术检测复苏后细胞免疫表型、CCK-8法检测复苏后细胞对A549细胞的杀伤活性、ELISA方法检测复苏后CIK细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α的变化。 结果： 体外培养不同时间后冻存的CIK细胞在复苏后仍然显示出较好的增殖活性,其中,体外培养6 d后冻存组CIK细胞增殖活性明显高于体外培养9 d和12 d后冻存组CIK细胞,复苏72 h时,6、9、12 d冻存组CIK细胞数分别为(35.90±1.67)×106、(18.98±2.13)×106和(11.76±2.12)×106个（P<0.01）。 体外培养6、9、12 d后冻存组CIK细胞复苏24 h后,各冻存组CD3+CD56+、CD3+CD8+细胞比例逐渐增加,且复苏72 h后6 d冻存组CIK细胞中CD3+CD56+和CD3+CD8+细胞比例最低。体外培养后冻存组CIK细胞在复苏24 h内对A549细胞的杀伤活性较低,但24 h后细胞毒活性有较大幅度的增加,且体外培养12 d后冻存组CIK细胞对A549细胞的杀伤活性高于6 d和9 d冻存组CIK细胞,如复苏后72 h,12、6、9 d冻存组CIK细胞对A549细胞的抑瘤率分别为（0.81±009）%、（0.59±0.06）%、（0.42±0.08）%（P<0.01）。ELISA检测结果显示,随着复苏时间的延长,体外培养不同时间后冻存的CIK细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平也逐渐上升;复苏72 h时,体外培养6 d后冻存组CIK细胞分泌IFN-γ的量要高于其他组,而体外培养12 d后冻存组TNF-α的分泌量则明显高于其他组。 结论： 体外培养不同时间后冻存对CIK细胞的生物学活性有一定影响,但复苏后经短时间培养后基本恢复,提示CIK细胞可以在培养至12 d后进行冻存。     

不同冻存时间对CIK细胞免疫表型及杀伤活性的影响

目的:探讨不同冻存时间对外周血来源的CIK细胞免疫表型及其杀伤活性的影响。方法:采集6名健康患者外周血,分离外周血单个核细胞培养,第0h加入IFN-γ,24h后加入IL-2、抗CD3单抗,每隔3天补充含CD3单抗、IL-2的新鲜培养液,培养15天进行冻存。复苏冻存1、2、3、4、5月的CIK细胞为实验组,以常规培养至15天的CIK细胞为对照组。利用流式细胞仪检测各组CIK细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞的百分比,CCK8法检测各组CIK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果:冻存1、2、3月的CIK细胞与对照相比CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例无明显差异（P＞0.05）,冻存4、5月的CIK细胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例较对照组明显下降［（70.62±6.35）%、（14.36±4.28）%、（67.87±5.63）%、（12.61±6.21）% vs （84.23±5.20）%、（22.75±3.46）%］,P＜0.05。对靶细胞的杀伤能力在1、2、3月时与对照相比未见明显减弱（P＞0.05）,冻存4月、5月后的CIK细胞在各效靶比对K562细胞的杀伤活性与对照相比明显减弱（P＜0.05）。结论:冻存时间的长短对CIK细胞的免疫表型及杀伤活性均有一定的影响,且随着冻存时间的延长,CIK细胞的杀伤活性减弱。建议冻存CIK细胞的最佳时间为1、2和3月。     

脐血CIK细胞的体外扩增特性研究

目的动态观察脐血CIK细胞体外扩增特性及其表面抗原变化,并对其细胞毒活性进行检测。方法提取健康足月产妇的胎儿脐带血单个核细胞,第0天加入rh-IFN-γ,第1天加入rhIL-2、抗CD3单克隆抗体来诱导培养CIK细胞,以后每3d更换培养液1次,并补加rhIL-2及抗CD3McAb。用流式细胞仪动态检测培养物的免疫表型变化,同时进行细胞计数,并使用MTT法检测各阶段脐血CIK细胞的细胞毒活性。结果脐血CIK细胞在培养2￣3周后大量增生,扩增约(64.4±16)倍,其中CD3+CD5+6细胞扩增约900倍,是CIK的主要效应细胞,且CD+3CD+8的T细胞达(74.7±10.42)%,CD2+5细胞比例也明显增加,而CD3+4细胞比例却减少。另外CD+3CD1+6CD5+6细胞比例升高最显著;脐血CIK细胞对白血病细胞株K562,HL-60及原代白血病细胞有较高的杀伤活性。结论脐血单个核细胞在体外可以被培养为CIK细胞,且扩增潜能极大,扩增倍数极高,细胞毒活性强,脐血CIK细胞有望应用于恶性肿瘤的生物免疫治疗。     

PJ-CW对细胞因子活化的杀伤细胞表型及细胞毒活性的影响

本文介绍我室有关LAK、TIL的体外诱导与活性调节研究及脐血CIK细胞诱导的初步研究.制备LAK-CM与PHA-CM(略)将TIL细胞(2×10~5/ml)分悬于含IL-2(500μ/ml)和/或PJ-CW(25μg/ml)的培液中置37℃,5%CO_2环境中培养,于培养后不同时间测定细胞扩增速度,并于第9天测定TIL细胞表型的变化(采用APAAP法与荧光检测法)及对自体肿瘤细胞与瘤靶细胞的杀伤活性(MIT显色法).将脐血淋巴细胞(1×10~6/ml)分别置含IL-2(2000μ/ml)和/或PJ-CW(25μg/ml)的环境中常规孵育,并于孵育后第5天进行表型分析(方法同前)及细胞毒活性测定.分离脐血淋巴细胞,于培养的不同时间分别加入rIFN-γ(1000U/ml),CD3MAB(20μl/ml),IL-2(300U/ml)及IL-1(100U/ml),测定其表型(方法同前).     

CIK细胞对鼻咽癌细胞体外杀伤活性的研究

目的 以鼻咽癌细胞株CNE为靶细胞,探讨CIK细胞对鼻咽癌细胞的杀伤作用.方法 正常人外周血单个核细胞在体外经CD3单抗、rhIFN-γ、rhIL-1多种细胞因子诱导后所收获的CIK细胞作为效应细胞,以鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2为靶细胞.用MTT法测定效应细胞对靶细胞的杀伤活性.结果 CIK细胞经体外诱导培养12 d后,cD3+细胞、CD8+CD28+细胞和CD3+CD56+细胞的阳性百分率分别为(92.69±5.69)%、(38.01±14.63)%和(27.74±7.96)%.在效靶比为30%时,CNE1和CNE2的杀伤活性分别为(67.90±8.19)%和(65.20±3.80)%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 CIK细胞可用于鼻咽癌放射治疗后的补充治疗.该细胞对CNE1和CNE2两种不同分化程度的鼻咽癌细胞具有相似的杀伤活性,提示临床上利用CIK细胞进行补充治疗,无须考虑细胞的分化程度.     

IL-24对CIK细胞体内杀伤肿瘤细胞活性的影响

目的 研究IL-24对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)体内杀伤肿瘤细胞活性的影响。方法 (1)从健康人外周血中提取单个核细胞,第一天加入IFN-γ(1 000 IU/mL),第二天加入IL-1(100 IU/mL)、CD3mAb(50 ng/mL)、IL-2(300 IU/mL)诱导CIK细胞,另一组与IL-1、CD3mAb、IL-2同时加入IL-24(1 000 IU/mL);(2)建立HepG₂肿瘤细胞株荷瘤小鼠皮下移植瘤模型,分为五组,每三天分别测量肿瘤大小。结果 IL-24诱导CIK细胞治疗组荷瘤小鼠实体瘤体积小于其它组(P＜0.05)。结论 在CIK细胞诱导过程中加入IL-24能明显增强其体内的抗肿瘤活性,对临床上把CIK细胞用于生物治疗有一定的指导意义。     

冻存对CIK细胞活性的影响

目的寻求一种CIK细胞的保存方法。方法将诱导成功的CIK细胞于14天时冻存,两个月之后复苏。观察细胞状态,复苏细胞从第一天起绘制细胞生长曲线,没有冻存的细胞从培养14天起绘制生长曲线,比较两者增殖率有无差别。复苏3天后做MTT,检测两组CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性差异。复苏后第三天用流式细胞仪测定细胞表型,与没有冻存的细胞进行比较。结果复苏后细胞状态良好,与未冻存细胞相比增殖率有差异（P〈0．05）。未冻存细胞在效靶比为40：1、20：1、10：1时杀伤率分别为（51．1±2．0）％、（50．9±3．3）％、（36．4±3．2）％,冻存细胞在效靶比为40：1、20：1、10：1时杀伤率分别为（49．7±1．5）％、（34．7±1．3）％、（29．5±7．6）％,两者在效靶比不同时杀伤活性没有明显差异。细胞表型尤其是起主要杀伤作用的细胞群CD3^＋CD56^＋分别为（19．1±0．4）％、（19．5±0．8）％,两者没有明显差异。结论冻存后复苏对CIK细胞的增殖率有一定影响,但并不影响临床上的应用。对杀伤活性和细胞表型没有影响。CIK细胞冻存后复苏方便了临床的应用。     

两种不同成分培养基制备CIK细胞的生物学特征

目的:采用细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK cell)培养基(含低浓度IL-2、IFN-γ、IL-12和anti-CD3)和NK培养基(含高浓度IL-2和anti-CD3)体外刺激诱导CIK,分析CIK细胞的扩增、表型和细胞因子分泌情况。方法:健康自愿者来源的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),分别加入CIK培养基和NK培养基进行诱导培养,24 h后,换用含IL-2的1%自体血浆培养基继续诱导培养2周。在培养的第6天和第10天检测培养上清中IFN-γ的分泌情况,在培养的第10天以流式细胞术检测两组培养细胞表面CD3、CD4、CD8、CD16、CD56的表达情况。结果:CIK培养基和NK培养基均可使培养细胞在第7天时开始明显扩增,第10天时可扩增至200倍。其中,CIK培养基获得的细胞扩增倍数明显高于NK培养基,其IFN-γ分泌明显高于NK培养基组[(724.7±434.8)vs(108.9±60.6)pg/ml,P<0.01];而以NK培养基培养的细胞,CD3-CD16+CD56+细胞比例高于CIK培养基[(6.27±3.33)%vs(2.88±1.88)%,P<0.05]。结论:不同成分的CIK培养基和NK培养基均可促进CIK细胞的扩增和成熟,但呈现不同的生物学特征。     

卵巢癌、子宫内膜癌与子宫肌瘤患者PBL表型分析及细胞毒活性变化的研究

众所周知,肿瘤的发生与机体免疫状态密切相关,肿瘤在体内的发生发展正是机体免疫监视系统与肿瘤细胞之间的作用失调所致,免疫监视能力降低肿瘤细胞得以逃逸而生长,在免疫监视系统中,活化的T细胞及其所分泌的细胞因子与NK细胞的作用是其重要的组成,特别是NK细胞(CD56~ 细胞)是在B或T细胞功能基本缺失或不能分化的情况下,以正常形式存在的一种成熟的细胞毒细胞,是机体早期肿瘤免疫监视的重要效应细胞.本研究分析了卵巢癌、子宫内膜癌与子宫叽瘤患者PBL的表型及细胞毒活性变化,结果表明,用IL-2(2000 U/ml)刺激PBL5d后其CD4,CD56及CD25的表达有明显的提高,CD56~ 细胞数有听增加.IL-2     

人νδT细胞细胞毒活性研究

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤肿瘤细胞的作用是机体抗瘤机制的重要环节，也是肿瘤过继免疫疗法中的主要效应细胞之一。因此寻找能特异杀伤肿瘤细胞的CTL是目前肿瘤生物疗法中急待解决的焦点之一。νδT细胞是T细胞的另一亚类，大量的实验表明：这群细胞与LAK，NK细胞相似，其胞浆中富含穿孔素，     

Human Umbilical Cord Blood for Hematopoietic Progenitor Cells Transplantation

Human umbilical cord blood (HUCB) represents a unique source of transplantable hematopoietic progenitor cells. HUCB from a newborn sibling has been used successfully for hematopoietic reconstitution of more than 50 children with congenital and malignant diseases. Moreover, 13 HUCB transplants have been performed from unrelated donors. Bone marrow transplantation (BMT) has rapidly progressed over the last two decades offering cure and prolonged disease free survival in patients with hemato-oncological malignancies, metabolic and genetic disorders. BMT is limited by the paucity of HLA-matched donors and the morbidity and mortality due to graft-versus-host disease (GVHD). HUCB could alleviate some of the problems associated with BMT and establishment of HUCB bank and registries could become an easily available source of suitable stem cells for transplantation. This review focuses on identifying current scientific problems and clinical achievement as well as noting the most recent developments in the field with special attention to the collection, processing, cryopreservation, and banking of HUCB. Progenitor cells from cord blood may provide an excellent vehicle for future gene therapy. As a result of relative immunodeficiency at birth, it is likely that partially matched unrelated cord blood transplants (CBT) would be successful due to a lower risk of GVHD related problems. Therefore, the establishment of large cord blood banks is of the utmost importance, in the future.     

Presence in Pieris rapae of Cytotoxic Activity against Human Carcinoma Cells

Cytotoxic activity in extracts of pupae and adults of various kinds of butterflies and moths was tested in vitro against the human gastric carcinoma cell line, TMK-1, which was chosen as an example of human carcinoma cells. Among the species examined, cytotoxicity was limited to Pieris rapae, Pieris napi and Pieris brassicae . Activity was found down to a dilution of 1/10⁴, while with the other butterflies and moths no activity was observed, even at 1/10². When the cytotoxicity of the three developmental stages, larvae, pupae and adults, of Pieris rapae was compared, the pupae showed the strongest activity, the IC₅₀ against TMK-1 cells being at the 1/10⁶ dilution. For larvae and adults, the respective IC₅₀ values were at the 1/10⁵ and 5/10⁵ dilutions. The active principle in the pupae of Pieris rapae was found to be heat-labile and not extractable with organic solvents, but precipitated with ammonium sulfate and digested by proteases, suggesting that it is a protein. This cytotoxic factor was named pierisin.     

放射线照射后NK-92 细胞对人宫颈癌细胞体外杀伤活性的研究

 目的 研究放射线照射后NK-92细胞对人宫颈癌细胞的体外杀伤活性。方法 应用医用电子直线加速器对NK-92细胞进行照射处理(0、400cGy)后，以体外培养人宫颈癌细胞系Hela为靶细胞，以NK-92的敏感细胞株K562作为对照，应用4h^51Cr释放法检测不同效靶比情况下NK-92细胞的杀伤活性。结果 NK-92细胞0cGy照射组，效靶比较低时(1：1、5：1)对Hela细胞杀伤率为15％～33％，随效靶比升高，杀伤率随之上升，10：1时杀伤率显著上升为47％，20：1时杀伤率仅上升了3％；对于K562细胞，杀伤率为33％～69％。400cGy组照射后2d，NK-92细胞对Hela细胞不同效靶比的杀伤率与0cGy组相比稍有降低，其总体杀伤率为14％～47％，对K562细胞杀伤范围在30％～60％之间。结论 放射线照射后的NK-92细胞对人宫颈癌Hela细胞系具有一定的杀伤活性。     

Characteristic Features of Cytotoxic Activity of Flavonoids on Human Cervical Cancer Cells

Cervical cancer is the most common gynecologic malignancy worldwide and development of new therapeuticstrategies and anticancer agents is an urgent priority. Plants have remained an important source in the searchfor novel cytotoxic compounds and several polyphenolic flavonoids possess antitumor properties. In this reviewarticle, data about potential anticarcinogenic activity of common natural flavonoids on various human cervicalcancer cell lines are compiled and analyzed showing perspectives for the use of these secondary metabolites in thetreatment of cervical carcinoma as well as in the development of novel chemotherapeutic drugs. Such anticancereffects of flavonoids seem to differentially depend on the cellular type and origin of cervical carcinoma creatingpossibilities for specific targeting in the future. Besides the cytotoxic activity per se, several flavonoids can alsocontribute to the increase in efficacy of conventional therapies rendering tumor cells more sensitive to standardchemotherapeutics and irradiation. Although the current knowledge is still rather scarce and further studies arecertainly needed, it is clear that natural flavonoids may have a great potential to benefit cervical cancer patients.     

顺铂预处理对CIK杀伤肺癌细胞的影响

目的探讨顺铂（DDP）预处理对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）杀伤活性的影响。方法采用CFSE/PI 双标法检测DDP预处理不同浓度、不同时间及预处理前后不同效靶比,CIK对肺癌细胞的杀伤活性。结果经IFN-γ,CD3单抗,IL-2诱导后20 d,获得典型的CIK细胞做为效应细胞。随着DDP预处理浓度的增加,CIK细胞的杀伤活性随之增强,随着DDP预处理时间的延长,CIK细胞的杀伤活性亦随之增强。在DDP预处理浓度25 ng/ml,预处理时间18 h的条件下,DDP对靶细胞并无明显影响,但联合CIK后,随着效靶比的增高,CIK细胞杀伤肿瘤细胞的活性明显增强。结论顺铂预处理肺癌细胞后,提高了CIK细胞的杀伤活性,对CIK细胞的临床应用具有借鉴意义。     

重组人纤维连接蛋白诱导的CIK细胞的生物学特性和对肺癌细胞株杀伤活性的体外研究

背景与目的CIK细胞是过继免疫治疗的重要手段之一,简化体外培养过程从而提高其增殖率和杀瘤活性仍是目前研究的一个热点课题。本研究观察重组人纤维连接蛋白(recombinant human fibronectin,RN)诱导CIK细胞的生物学特性,建立一种高效、简便的体外CIK细胞扩增方法。方法抽取10名健康人外周静脉血各50mL,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,分别采用RN诱导法和传统方法培养CIK细胞,记录细胞增殖数;用流式细胞术测定免疫细胞表型和分泌IFN-γ、IL-4、穿孔素和颗粒酶B细胞的百分比;用MTT法测定CIK细胞对4种人肺癌细胞株的体外杀伤率。结果RN诱导的CIK细胞扩增倍数为传统方法的2.0倍-3.5倍,具有统计学差异(P<0.05);RN诱导组和传统方法组CD3+CD16+CD56+细胞绝对数分别增加了3778倍和2069倍;RN诱导组细胞中CD3+CD8+细胞比例明显高于传统方法组(P<0.05);但CD3+CD4+细胞比例无统计学差异(P>0.05);对4种肺癌细胞株的体外杀伤活性无统计学差异(P>0.05)。RN诱导的CIK较诱导前:分泌IFN-γ的细胞比例明显增加;分泌IL-4的细胞...     

人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

树突状细胞(DC)作为抗原提呈细胞,在激发T细胞免疫应答及T细胞依赖性抗体生成中起重要作用,骨髓及外周血的CD34造血前体细胞在GM-CSF和TNF-α的作用下,可在体外分化发育,生成树突状细胞.本研究从正常人外周血分离获得单核细胞,加入100ng/ml hGM-CSF、500U/ml hIL-4,体外培养1周后,获得大量高纯度的树突状细胞,其高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子B7-1和CD40,能强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖,培养条件以应用自体血清或胎牛血清为最佳;单独应用hGM-CSF只能生成巨噬细胞;在培养末期加入TNFα可促进DC进一步成熟.本研究为DC的深入研究与临床应用奠定了基础.     

Cytotoxic and Apoptotic Activity of Aglaforbesin Derivative Isolated from Aglaia loheri Merr. on HCT116 Human Colorectal Cancer Cells

Background: The genus Aglaia (Meliaceae) is an established source of many anticancer compounds. The study evaluated the leaf extracts of Aglaia loheri, a tree native to the Philippines, as potential source of anticancer compounds. Methods: Using bioassay-guided fractionation, A. loheri leaf extract was subjected to various chromatographic techniques and step-wise application of MTT assay on human colorectal carcinoma cells, HCT116, to determine the cytotoxic fractions. The most cytotoxic HPLC isolate was structurally identified using 1D and 2D NMR and its apoptotic effect was assessed by JC-1 staining, caspase 3/7 assay and TUNEL assay. Results: After stepwise chromatography fractionation, an HPLC isolate, structurally identified as aglaforbesin derivative (AFD), demonstrated potent cytotoxicity against HCT116. AFD exhibited strong toxicity (IC50 = 1.13 ±0.07 µg/mL) and high selectivity on HCT116 than normal human kidney cells (HK-2). AFD-induced toxicity to HCT116 is possibly through the stimulation of the apoptotic signaling pathway via caspase 3/7 activation and DNA fragmentation independent of mitochondrial membrane depolarization. Conclusion: AFD exhibited selective cytotoxicity and apoptotic activity to HCT116 and could be further developed as anticancer drug lead.     

Multi-Target Cytotoxic Actions of Flavonoids in Blood Cancer Cells

To date, cytotoxic effects of flavonoids in various cancer cells are well accepted. However, the intracellularsignaling cascades triggered by these natural compounds remain largely unknown and elusive. In this minireview,the multiplicity of molecular targets of flavonoids in blood cancer cells is discussed by demonstrating theinvolvement of various signaling pathways in induction of apoptotic responses. Although these data reveal a greatpotential of flavonoids for the development of novel agents against different types of hematological malignancies,the pleiotropic nature of these compounds in modulation of cellular processes and their interactions certainlyneed unraveling and further investigation.